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HACIA UN ABORDAJE INTEGRAL DEL ENVENENAMIENTO OFÍDICO EN AMÉRICA LATINA: LA IMPORTANCIA DE LA GENERACIÓN DE CONOCIMIENTO CIENTÍFICO-TECNOLÓGICO ENDÓGENO

¿ES LA EDUCACIÓN TERAPÉUTICA LA MEJOR ESTRATEGIA PARA AUMENTAR LA ADHERENCIA DE LA TERAPIA ANTIRRETROVIRAL?

ACTIVIDAD ANTI-VIH-1 IN VITRO DEL EXTRACTO ENZIMÁTICO ENRIQUECIDO CON LACASA PRODUCIDO POR LOS HONGOS GANODERMA SP. Y LENTINUS SP.

ABSTRACT Background: Natural compounds are a good source for the development of antiretroviral drugs with low cytotoxicity. The laccase enzyme, produced by fungi of the genera Ganoderma sp. and Lentinus sp., inhibits the reverse transcriptase (RT) of the human immunodeficiency virus 1 (HIV-1), in cell-free models in vitro. Objetives: In this study we evaluated the anti-HIV-1 activity of the enzymatic extracts (EE) enriched with laccase, produced by two native species of fungi of the same genera in an in vitro cell culture model. Methods: The inhibition of viral replication was performed using the U373-MAGI cell line infected with recombinant viruses in the presence/absence of the EE and 48 hpi, the percentage of infected cells was evaluated by flow cytometry for green fluorescent protein -GFP- and ELISA for p24. The inhibition of the RT was determined by quantification of early and late products of reverse transcription using quantitative PCR. Results: The EEs from Ganoderma sp. and Lentinus sp. inhibited the replication of HIV-1 between 80 and 90% and decreased the production of early and late transcripts between 55,5%-91,3% and 82,1%-93,6% respectively. The EE from Lentinus sp. had the best selectivity index (SI: 8.3). Conclusions: These results suggest the potential anti-HIV-1 activity of the EE for the exploration of an alternative therapy against HIV-1 infection.

RESUMEN Antecedentes: Los compuestos naturales son una buena fuente para el desarrollo de fármacos antirretrovirales con baja citotoxicidad. La enzima lacasa, producida por hongos del género Ganoderma sp. y Lentinus sp., inhibe la transcriptasa reversa (TR) del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), en modelos in vitro, libres de células. Objetivos: En este estudio se evaluó la actividad anti-VIH-1 del extracto enzimático (EE) enriquecido con lacasa, producida por dos especies nativas de hongos de los mismos géneros en un modelo in vitro de cultivo celular. Métodos: La inhibición de la replicación viral se realizó usando la línea celular U373-MAGI infectada con virus recombinantes en la presencia/ausencia del EE y 48 hpi, el porcentaje de células infectadas se evaluó mediante citometría de flujo para GFP y ELISA para p24. La inhibición de la TR se determinó mediante la cuantificación de los productos tempranos y tardíos de la transcripción reversa utilizando una PCR cuantitativa. Resultados: El EE de Ganoderma sp. y Lentinus sp. inhibió la replicación del VIH-1 entre el 80 y 90% y disminuyó la producción de transcriptos tempranos y tardíos entre el 55,5% -91,3% y 82,1% -93,6%, respectivamente. El EE de Lentinus sp. mostró el mejor índice de selectividad (IS: 8.3). Conclusiones: Estos resultados sugieren el potencial anti-VIH-1 del EE para la exploración de una terapia alternativa contra la infección por el VIH-1.

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIAGREGANTE PLAQUETARIA DE UNA FRACCIÓN DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE CORTEZA DE Nectandra amazonum Nees

ABSTRACT Background: Some species of the Lauraceae family are known to produce secondary metabolites that have antiplatelet properties. Studies on the leaves of Nectandra amazonum Nees. have shown antiaggregant activity but the bark of this species has not been studied. Objectives: To assess the antiplatelet effect of the ethanolic fraction obtained from the bark of Nectandra amazonum Nees. (N.V. “laurel amarillo”, Lauraceae) applying the “Born” turbidimetric method. Methods: The screening test compared the effects of a fraction of N. amazonum (0.1 mg/mL), acetylsalicylic acid (ASA, 0.5 mM, as reference standard) and dimethylsulphoxide (DMSO, 0.1%, as control) on human platelets stimulated with adenosine diphosphate (ADP, 2 μM), epinephrine (EPI, 1 uM (one micromolar)), collagen (COLL, 1 μg/mL) and arachidonic acid (AA, 0.2 mg/mL). Subsequently, the study focused on determining the antiaggregant potency of the N. amazonum fraction through concentration - response curves (from 1 μg/mL to 0.4 mg/mL), obtaining pIC50 (-log IC50) values against the platelet agonists. Results: Control platelets attained the highest percentage values of aggregation (96% AA, 89% EPI, 85% COLL, and 77% ADP). The N. amazonum fraction significantly reduced the aggregation effects (6% AA, 45% EPI, 10% COLL, 21% ADP), with values close to those obtained with ASA (17% AA, 21% EPI, 10% COLL, 20% ADP). According to concentration - response curves, the pIC50 values of the ethanolic fraction indicated the following order of potency: AA, 4.90 > ADP, 4.51 > COLL, 4.33 > EPI, 3.85. Conclusions: These results suggest that the N. amazonum Nees. ethanolic fraction elicited antiplatelet effects mainly related to the inhibition of the arachidonic acid pathway.

RESUMEN Antecedentes: Algunas especies de la familia Lauraceae poseen metabolitos secundarios que ejercen efectos antiplaquetarios. Estudios de las hojas de Nectandra amazonum Nees. han mostrado esa actividad, pero no se conoce sobre las propiedades antiagregantes de su corteza. Objetivos: Evaluar el efecto antiagregante plaquetario de la fracción etanólica obtenida de la corteza de Nectandra amazonum Nees. (N.V. “laurel amarillo”, Lauraceae) aplicando el método turbidimétrico de Born. Métodos: En el tamizaje antiagregante se comparó la fracción de N. amazonum (0,1 mg/mL) con ácido acetil salicílico (ASA 0,5 mM, como estándar de referencia) y dimetilsulfóxido (DMSO, 0,1%, como control) en plaquetas humanas estimuladas con adenosin difosfato (ADP, 2 μM), epinefrina (EPI, 1 uM (uno micromolar)), colágeno (COLL, 1 μg/mL) y ácido araquidónico (AA, 0,2 mg/mL). Posteriormente, el estudio se enfocó en la determinación de la potencia antiagregante de la fracción mediante curvas de concentración - respuesta (desde 1 μg/mL hasta 0,4 mg/mL) para obtener los valores respectivos de pIC50 (-log CI50). Resultados: En el grupo control se alcanzaron altos valores de agregación plaquetaria (96% AA, 89% EPI, 85% COLL, 77% ADP). La fracción de N. amazonum redujo significativamente la agregación (6% AA, 45% EPI, 10% COLL, 21% ADP), con valores próximos a los obtenidos con ASA (17% AA, 21% EPI, 10% COLL, 20% ADP). De acuerdo con las curvas de concentración - respuesta, los valores de pIC50 arrojaron el siguiente orden de potencia: AA, 4,90 > ADP, 4,51 > COLL, 4,33 > EPI, 3,85. Conclusiones: Estos resultados sugieren que la fracción etanólica de N. amazonum Nees ejerce efectos antiplaquetarios relacionados especialmente con la cascada metabólica del ácido araquidónico..

CARACTERIZACIÓN DE LA FRACCIÓN MÁS PROMISORIA DE Swietenia macrophylla ACTIVA CONTRA FOSFOLIPASAS A2 MIOTOXICAS: IDENTIFICACIÓN DE CATEQUINA COMO UNO DE LOS COMPUESTOS ACTIVOS

ABSTRACT Background: The pharmacological effects produced by snakebite accidents involve the actions of several enzymes, of which those of the phospholipases A2 (PLA2) exhibit a wide variety of effects such as edema and myotoxicity. Some plant extracts have been antagonists of crude snake venoms and toxins. Based on promising bioactivity, Swietenia macrophylla King was selected for further studies. Objective: The purpose of this study was to identify the PLA2 inhibitors present in the crude extract of S. macrophylla that could be promising leads in neutralizing the local effects of ophidian accidents. Methods: Bioassay-guided fractionation of the ethanolic extract of the leaves of S. macrophylla lead to the detection of (+)-catechin, characterized through gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS), and confirmed by HPLC. The PLA2 inhibitory activity was measured with the Dole method and a spectrophotometric assay with 4-Nitro-3-octanoyloxy-benzoic acid (4N3OBA). Cytotoxicity was done on C2C12 murine myoblast. Results: Fraction F5 and (+)-Catechin inhibited the PLA2 activity of B. asper venom, in a dosedependent way. In addition, (+)-Catechin showed an inhibition level of 83.1 ± 3.1 % of the enzymatic activity of one PLA2 purified from the venom of Crotalus durissus cumanensis using 4N3OBA as substrate. Also the ethanolic extract and fraction F5 showed inhibition of the cytotoxicity induced by the Bothrops atrox venom and their Lys 49 PLA2 (80 and 100% respectively). Molecular docking results suggested that OH from 4´ and 5' carbons of (+)-catechin could form hydrogen bonds with carboxylate moiety of residue Asp49, while OH from 5 could form a hydrogen bond with Asn 6. Additional Van der Waals interactions were also proposed. Conclusion: Swietenia macrophylla exhibited strong inhibitory activity against PLA2s enzymes. Catechin, one of the components in the active fraction F5, is proposed as being partially responsible for the bioactivity.

RESUMEN Antecedentes: Los efectos farmacológicos producidos en el accidente ofídico implican la acción de varias enzimas, como las fosfolipasas A2 (PLA2), que exhiben una amplia variedad de efectos como edema y miotoxicidad. Algunos extractos de plantas han demostrado ser antagonistas de los venenos crudos y sus toxinas. En base a una bioactividad promisoria previa, Swietenia macrophylla King fue seleccionada para estudios posteriores. Objetivo: El propósito de este estudio fue identificar metabolitos inhibidores de PLA2 presentes en el extracto crudo de S. macrophylla que podrían ser prometedores en la neutralización de los efectos locales del accidente ofídico. Métodos: Un fraccionamiento biodirigido del extracto etanólico de hojas de S. macrophylla llevó a la detección de la (+)-catequina mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS), y se confirmó mediante HPLC. La actividad inhibidora de PLA2 se determinó por el método de Dole y un ensayo espectrofotométrico con Ácido 4-Nitro-3-octanoiloxibenzoico (4N3OBA). La citotoxicidad se determinó en mioblastos C2C12 murinos. Resultados: La fracción F5 de S. macrophylla, mostró la mayor inhibición del veneno de Bothrops asper y PLA2s aisladas de B. atrox y Crotalus durissus cumanensis e inhibición completa de la citotoxicidad. La (+)-catequina fue el metabolito más abundante en F5, mostró una inhibición de PLA2 de 89,8%, 81,1% y 74,3%, a diferentes relaciones de veneno: catequina. Mediante estudios de docking molecular se demostró la unión de la (+)-catequina al sitio activo de la PLA2. Conclusión: Swietenia macrophylla exhibió una fuerte actividad inhibitoria sobre las enzimas PLA2s. La (+)-catequina, uno de los metabolitos presentes en la fracción activa F5, se propone como uno de los compuestos responsables de la bioactividad.

ÁCIDO LINOLEICO CONJUGADO EN LECHE Y LECHES FERMENTADAS: VARIABILIDAD Y EFECTOS DE LOS PROCESOS TECNOLÓGICOS

ABSTRACT Background: Conjugated linoleic acid (CLA) is a generic term used to describe a group of geometric and positional isomers of linoleic acid with a conjugated double bond system. CLA-isomers have been widely studied because of their important biological activity and their protective effects against several diseases, such as obesity, atherosclerosis, chronic inflammatory diseases, and cancer. Consequently, these biomolecules have attracted much attention from the dairy industry, since they are naturally found in ruminants' milk, and because the development of CLA-enriched dairy foods can be a good economic opportunity given the growth of the functional foods market, in which the dairy industry plays an important role. Objectives: This work presents a comprehensive review of the following aspects: (i) The synthesis and concentration of the CLA-isomers in milk, and the main strategies employed to increase their content in a natural manner; (ii) The influence of the main technological treatments applied to milk on the concentration of CLA-isomers; and (iii) The effects of milk fermentation on the content of CLA-isomers, and the challenges of this technological process, which has been though as a promissory alternative to naturally increase the content of CLA in fermented dairy products. Methods: Information available in various databases was reviewed. A total of 103 articles were selected on the basis of their relevance and scientific-technical quality. Results: The CLA concentration in cows' milk normally ranges between 2 and 37 mg/g fat, and is mainly affected by the dietary regime offered to the animals. From the total CLA-isomers, rumenic acid represents between 75 and 90%. The technological processes normally applied to milk (thermal processing, high pressure processing, and fermentation) might cause slight changes on the CLA concentration, but the mechanisms causing these changes have not been still established. The increase in CLA concentration by milk fermentation is strain-dependent, because of the different linoleate isomerase activity of the species. Conclusions: Although several studies have reported increases in the concentration of CLA in milk and fermented milks in a natural manner, they are fairly moderate, and the obtained levels of CLA are significantly lower than those recommended to achieve therapeutic effects.

RESUMEN Antecedentes: El ácido linoleico conjugado (CLA) es un término genérico utilizado para describir el grupo de isómeros geométricos y posicionales del ácido linoleico con un sistema de dobles enlaces conjugados. Los isómeros de CLA han sido ampliamente estudiados debido a su importante actividad biológica y a sus efectos protectores contra varias enfermedades, como la obesidad, arteriosclerosis, enfermedades inflamatorias crónicas y el cáncer. En consecuencia, estas biomoléculas han despertado mucho interés en la industria láctea, dado que están presentes naturalmente en la leche de rumiantes, y porque el desarrollo de productos lácteos enriquecidos con CLA puede representar una oportunidad económica interesante, dado el crecimiento del mercado de alimentos funcionales, en el cual la industria láctea tiene una participación importante. Objetivos: En este trabajo se presenta una revisión detallada de los siguientes aspectos: (i) El origen de los isómeros de CLA en la leche, sus concentraciones promedio y las principales estrategias utilizadas para incrementar su contenido de manera natural; (ii) La influencia de los principales tratamientos tecnológicos aplicados a la leche en la concentración de los isómeros del CLA; y (iii) Los efectos de la fermentación de la leche en el contenido de isómeros de CLA, y los retos de este proceso tecnológico concebido como promisorio para aumentar naturalmente el contenido de CLA en leches y productos lácteos fermentados. Métodos: Se revisó la información disponible en varias bases de datos. Un total de 103 artículos fueron seleccionados con base en su pertinencia y calidad técnico-científica. Resultados: La concentración de CLA en la leche de vaca normalmente oscila entre 2 y 37 mg/g grasa, y es afectada principalmente por la dieta suministrada a los animales. Del total de isómeros de CLA, el ácido ruménico representa entre 75 y 90%. Los procesos tecnológicos aplicados normalmente a la leche (procesado térmico, procesaimento por altas presiones y fermentación) pueden causar ligeras modificaciones en la concentración de CLA, pero los mecanismos que causan estos cambios no han sido aún establecidos. El incremento en la concentración de CLA por fermentación de la leche es dependiente de la cepa, debido a diferencias en la actividad de la linoleato isomerasa de las especies. Conclusiones: Aunque varios estudios han reportado incrementos en la concentración de CLA en leche y leches fermentadas de manera natural, estos son bastante moderados, y los niveles de CLA obtenidos son significativamente menores que los recomendados para alcanzar los efectos terapéuticos.