Revista Colombiana de Biotecnología

Evaluating methods for preserving yam (Dioscorea sp) phytopathogenic fungii

Un elemento esencial en la investigación con microorganismos fitopatógenos es su conservación y uso seguro. Desde este punto de vista, en este estudio se evaluaron métodos de conservación de hongos que atacan el ñame, empleando como factores de respuesta el potencial de viabilidad, y la estabilidad y presencia o ausencia de cambios en las características macro y microscópicas. Como resultado del trabajo se proponen los métodos más adecuados para los géneros Colletotrichum y Fusarium, hongos causantes de las mayores pérdidas en las plantaciones de ñame en la Costa Caribe colombiana. Las cepas utilizadas en este estudio provienen de las colecciones de la Universidad de Sucre, del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia (IBUN) y de una donación de la doctora Lucía Afanador de la Universidad Nacional, Sede Medellín. Estas fueron sometidas a diferentes métodos de conservación, entre ellos criopreservación, liofilización y cultivo periódico con y sin aceite mineral. Los resultados obtenidos permitieron elegir la criopreservación como el método más eficiente para la conservación de la colección, y el cultivo periódico con aceite mineral como método alternativo y complementario. Estos minimizan el riesgo de pérdida del material biológico y brindan condiciones de manejo que conservan las características biológicas bajo estudio desde campos como la microbiología, la bioquímica y la biología molecular, entre otros.

An essential element in phytopathogenic microorganism research is their preservation and safe use. The purpose of this study was to evaluate methods for preserving fungi producing diseases in yam, using potential viability, stability and the presence or absence of macro- and microscopic characteristic changes as response factors. More suitable methods for Colletotrichum and Fusarium genera were proposed as a result of the work; these are fungi causing the greatest losses in yam plantations on the Colombian Caribbean Coast. The strains used in this study came from collections kept at the University of Sucre and the Universidad Nacional de Colombias Institute of Biotechnology (IBUN) in Bogota and a donation from Dr Lucia Afanador from the Universidad Nacional in Medellín. These strains were subjected to different preservation methods, including cryopreservation, lyophilisation and periodic culture with and without mineral oil. The results led to choosing cryopreservation as the most efficient method for preserving the collection and the periodic culture with mineral oil as an alternative and complementary method. These minimised the risk of biological material loss and provided handling conditions conserving the biological characteristics of the fungi being studied from the fields of microbiology, biochemistry and molecular biology

A protocol for yam (Dioscorea alata L.) microtuber formation in temporary immersion system

Con el propósito de desarrollar un protocolo para la formación de microtubérculos en el clon de ñame Pacala Duclos (Dioscorea alata L.) en sistema de inmersión temporal, que pudiera ser usado como alternativa para la propagación de esta especie, se definieron como objetivos de trabajo determinar el efecto del tiempo y la frecuencia de inmersión, así como la influencia del volumen de medio de cultivo por planta cultivada in vitro. Con el empleo de 15 min de inmersión y una frecuencia de inmersión cada 6 horas, se alcanzaron los mejores resultados en cuanto al número de microtubérculos formados por planta. Con este tiempo y frecuencia de inmersión los microtubérculos presentaron la mayor masa fresca y seca, así como el mayor diámetro. Además, a las 18 semanas de cultivo se obtuvo el mayor número total de microtubérculos por sistema y el mayor número de microtubérculos aprovechables como material vegetal de propagación. En cuanto al volumen de medio de cultivo por planta, con 60 ml de medio de cultivo por planta in vitro se alcanzó el mayor número de microtubérculos aprovechables, los cuales presentaron el contenido más alto de materia seca. Los microtubérculos obtenidos en este tipo de sistema de inmersión temporal presentaron una masa fresca superior a 2,40 gMF, lo cual podría permitir su uso como material de plantación directo a campo

The following working objectives were defined for developing a protocol for ´Pacala Duclos´ yam clone (Dioscorea alata L.) microtuber formation in temporary immersion systems (TIS): time effect, immersion frequency and culture medium volume influence per in vitro cultivated plant. The results led to defining that the highest performance regarding microtuber number formed per plant was achieved with a 15-minute immersion time and six-hourly immersion frequency; the microtubers presented the greatest dry and fresh weight and largest diameter at such immersion time and frequency. Furthermore, the highest total number of microtubers per system and the largest number of microtubers usable for planting (vegetal propagation) material were obtained after 18 weeks culture. Regarding culture medium volume per plant, the greatest amount of usable microtubers was achieved with 60 ml per in vitro plant, microtubers presenting the highest dry matter content. As microtubers obtained in this type of TIS had fresh weights higher than 2.40 gFW they could be used as direct planting material in field conditions.

Characterising Cuban papaya accessions (Carica papaya L.) by AFLP markers

Los marcadores moleculares son herramientas valiosas en los estudios genéticos en plantas, y están siendo empleados exitosamente en programas de mejoramiento principalmente en la elección de progenitores y en la selección. El polimorfismo observado mediante la técnica molecular AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ha sido de utilidad para estudios de diversidad genética en frutales. En el presente trabajo se realizó la caracterización molecular de 12 accesiones de papaya (Carica papaya L.) del banco de germoplasma del Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical (IIFT), empleando la técnica AFLP. Se evaluaron seis combinaciones de iniciadores para la amplificación selectiva, las cuales amplificaron un total de 431 bandas con 73,3% de polimorfismo. El número total de patrones de bandas identificados fue igual en todas las combinaciones utilizadas, con un porcentaje de identificación alto, lo que sugiere que dichas combinaciones pudieran ser empleadas para estudios de variabilidad genética en papaya. En general, los resultados presentados demuestran que existe diversidad genética entre las accesiones evaluadas, lo cual constituye un reflejo del origen que presentan los genotipos analizados a partir de la introducción de materiales foráneos y la polinización abierta de un grupo de materiales selectos. Por tanto, se recomienda retomar la prospección y selección de accesiones locales, así como la introducción de nuevos genotipos foráneos, como dos vías fundamentales para aumentar la diversidad genética presente en el banco de germoplasma de papaya de Cuba.

Molecular markers are valuable tools for genetic studies in plants and they are often used successfully in genetic breeding, mainly for choosing progenitors and selection. Polymorphism observed by amplified fragment length polymorphism (AFLP) has been useful for genetic diversity studies in fruit trees. Twelve papaya accessions from the Tropical Fruit Crop Research Institute germplasm bank were molecularly characterised by AFLP. 431 bands having 73.3% polymorphism were obtained using 6 primer combinations. The total number of band patterns identified was the same in all combinations assayed with a high percentage of identification, suggesting that such primer combinations could be used for genetic variability studies in papaya. The results demonstrated genetic diversity among the papaya accessions evaluated, indicating the origin of the analysed genotypes from exogenous material and open pollination of a selected group of material. It is thus recommended that local accessions and their selection be monitored as well as the introduction of new foreign genotypes as two ways of increasing the genetic diversity of the Cuban papaya germplasm bank.

The effect of inoculum density on embryogenic cell suspension proliferation and differentiation in banana hybrid cultivar FHIA-18 (Musa spp. AAAB)

La obtención de un sistema de regeneración eficiente por medio de la embriogénesis somática en las Musaceas, es hoy una gran herramienta ante los enormes problemas que presenta este género con el ataque de enfermedades como la sigatoka negra. El objetivo del trabajo es determinar las densidades celulares adecuadas para las etapas de multiplicación de suspensiones celulares embriogénicas y formación de los embriones somáticos en medios de cultivo líquidos. Como material vegetal se usaron brotes inmaduros de la inflorescencia masculina de Musa AAAB, cv. FHIA-18. Los resultados demostraron que es posible el establecimiento de suspensiones celulares homogéneas a partir de embriones somáticos en etapa globular, y obtener los mayores volúmenes de biomasa celular al multiplicar dichas suspensiones con una densidad del 3% del volumen de células sedimentadas. A partir del decimoquinto día en el medio de cultivo de formación de embriones comenzaron a formarse estructuras compuestas por proembriones y embriones somáticos en etapa globular; entre las densidades estudiadas los mejores resultados se obtuvieron con 100 mgMF en la cual se formaron 1 871 ES.l-1 con un peso de 248 mgMF.l-1

An extremely useful tool for dealing with the enormous problems involved in banana growing (Musaceae) caused by the attack of diseases such as black Sigatoka can be obtained today by ensuring an efficient regeneobration system via somatic embryogenesis. The work was aimed at defining appropriate cell densities for embryogenic cell suspension growth stages and somatic embryo formation in liquid culture medium. Immature male inflorescence buds from Musa AAAB cf FHIA-18 were used as vegetal material. The results showed that it is possible to establish homogeneous cell suspensions from somatic embryos in globular stage and obtain greater cell biomass volume by multiplying the suspension with 3% sedimented cell volume (density). Embryos began to form structures in culture medium consisting of globular stage somatic proembryos and embryos from the fifteenth day onwards. The best results amongst the densities studied were obtained with 100 mgMF, in which 1,871 ES.l -1 were formed weighing 248 mgMF.l-1

Assessing two staining methods for cytotoxicity tests on tumor cell lines

En la estimación de la posible citotoxicidad de extractos o compuestos en proceso de prospección se emplean métodos de tinción celular como aproximación indirecta para la medición masa celular viable. En ensayos de citotoxicidad sobre las líneas celulares SiHa, MCF-7 y MKN-45 se comparan el método de tinción sulforodamina B (SRB), que es un ensayo de tipo terminal, con el uso de resazurina propuesta como poco tóxica para las células. La comparación de los métodos se hizo en términos de porcentaje de supervivencia donde se evaluó la sensibilidad de las líneas a tres compuestos sintéticos durante un periodo de tratamiento de 48 horas usando como referencia de actividad doxorrubicina HCl, un medicamento empleando en cáncer. Los datos obtenidos en los dos tipos de ensayos sometidos a una prueba de correlación mostraron que no hay diferencias significativas en ambos métodos permitiendo la comparación entre estos bajo las condiciones usadas.

Cell staining methods are commonly used for estimating extracts or compounds potential cytotoxic activity when prospecting for indirect quantitative measurement of cell growth and viability. This work compared the sulphorhodamine B (SRB) staining method, which is a terminal cell density measuring assay, and the resazurin method, a cell proliferation assay which is supposed to be less toxic for the cell. The methods were compared in terms of percentage survival by evaluating MCF-7, MKN-45 and SiHa cell line sensitivity to three synthetic compounds using a 48-hour treatment period and doxorubicin HCl (a drug used in cancer treatment) as reference activity. A correlation test using the data obtained from the assays showed that there was no significant difference between the methods in the conditions used here.

Identifying cefotaximase genes in Enterobacteriaceae hospital isolates by PCR-SSCP

Las cefotaximasas (CTX-M) son las beta-lactamasas de espectro extendido más ampliamente diseminadas entre especies de la familia Enterobacteriaceae, y son la causa principal de resistencia en aislamientos causantes de infección intrahospitalaria. El objetivo del presente trabajo fue identificar variantes de cefotaximasas del grupo CTX-M-1 mediante el análisis del polimorfismo conformacional de cadena sencilla (SSCP) de fragmentos de restricción provenientes de los productos de la amplificación por PCR de los genes blaCTX-M. Con el procedimiento PCR-SSCP estandarizado, en este trabajo se analizaron 49 aislamientos de enterobacterias recolectados en 8 hospitales de Bogotá, D.C., adscritos a la Secretaría Distrital de Salud. Se detectaron las variantes CTX-M-12, CTX-M-15, CTX-M-12a, y CTX-M-1 y una nueva variante denominada CTX-M-60. Todas las variantes fueron detectadas tanto en aislamientos intrahospitalarios como de la comunidad, lo que indica posible movilidad de estos genes desde y hacia los centros hospitalarios. Esta publicación constituye el primer reporte en Colombia de la variante CTXM-12a y la nueva variante evolutiva CTX-M-60.

CTX-M cefotaximases are the most widely distributed extended-spectrum beta-lactamases among Enterobacteriaceae and they are an important cause of microbial resistance in nosocomial infection-causing isolates. The object of this work was to identify group 1 CTX-M cefotaximase variants from PCR amplified blaCTX-M genes by single-stranded conformational polymorphism of restriction fragments (RF-SSCP). We analysed 49 Enterobacteria isolates using the RF-SSCP procedure standardised in this work; isolates were collected from eight hospitals attached to the Bogota Health Secretariat (Secretaría Distrital de Salud). CTX-M-12, CTX-M-15, CTX-M-12a and CTX-M-1 variants were detected as well as a new one, designated CTX-M-60. All variants were detected in hospital and community isolates thereby indicating these genes possible high mobility from and towards hospital centres. This study represents the first report in Colombia of CTXM-12a and of the new evolutionary variant: CTX-M-60.

Evaluating different phytohormone combinations in regenerating Solanum tuberosum (Solanaceae) ar. Pastusa Suprema from intermodal explants

La regeneración de plantas mediante el cultivo de tejidos es un importante componente de la biotecnología que es requerido para procesos tales como la obtención de plantas transgénicas. Se estableció un sistema eficiente de regeneración para la especie Solanum tuberosum L. var. Pastusa Suprema, susceptible de ser transformada genéticamente. Se evaluó el efecto de las fitohormonas zeatina ribósido (ZR), ácido naftalénacetico (ANA) y ácido gibérelico (AG3), utilizadas en combinaciones específicas, sobre la inducción de callo, la regeneración y el número de brotes producidos por explante. La presencia de ANA demostró ser esencial en la respuesta callogénica y regenerativa de los explantes. Se encontró que la adición de 3,0 mg/L de ZR, 0,02 mg/L de ANA y 1,0 mg/L de AG3 sobre un medio básico M-S, es una formulación hormonal adecuada para inducir el proceso de organogénesis indirecta sobre la variedad de papa Pastusa Suprema; produce callogénesis y regeneración en porcentajes superiores al 90%, con un promedio de seis regenerantes por explante

Plant regeneration using tissue culture represents an important biotechnological tool which is necessary in processes such as obtaining transgenic plants. An efficient regeneration system was established for Solanum tuberosum L. var. Pastusa Suprema; this specie is susceptible to being genetically transformed. The effect of zeatin riboside (ZR), gibberellic acid (GA3) and naphthalene acetic acid (NAA) phytohormones used in specific combinations was evaluated regarding callus induction and bud regeneration and number per explant. The presence of NAA was seen to be essential in explants callogenic and regenerative response. Adding 3.0 mg/L ZR, 0.02 mg/L NAA and 1.0mg/L GA3 to a basic M-S medium was an appropriate hormonal combination for inducing indirect organogenesis in the Pastusa Suprema potato variety; it produced more than 90% callus genesis and plant regeneration and an average of six regenerants per explant

**Quantitative transient GUS expression in J-104 rice calli through manipulation of in vitro culture conditions.**

This paper purposes suitable conditions for callus induction and co-cultivation with Agrobacterium tumefaciens of J-104 rice cultivar. It was evaluated the effect of different concentrations of 2.4-D and agar, and the inclusion of L-proline and L-glutamine in callus culture medium. The use of 2.5 mg/L 2.4-D and 0.8% agar allowed the highest percentage of embryogenic calli. Callus formation was improved considerably with 500 mg/L of L-proline and L-glutamine in the culture medium. Different factors were studied throughout co-cultivation of calli with A. tumefaciens: inoculation time, co-cultivation temperature, concentration of acetosyringone and co-cultivation period. Transient GUS expression was quantified by fluorometry in all co-cultivated calli. The best results were obtained with the following conditions: 10 min as inoculation time, 100µM acetosyringone in co-cultivation medium, temperature of 20°C, and 3 days as co-cultivation period.

Se describen las condiciones óptimas para la callogénesis y cocultivo de callos con Agrobacterium tumefaciens de la variedad de arroz J-104. Se determinó el efecto de diferentes concentraciones de 2.4-D, agar y de L-prolina y L-glutamina en el medio de cultivo de callos. El uso de 2,5 mg/L de 2.4-D y 0,8% de agar permitió lograr el porcentaje más alto de callos embriogénicos. La formación de callos fue mejorada considerablemente con la adición de 500 mg/L de L-prolina e igual concentración de L-glutamina en el medio de cultivo. Se estudiaron diferentes factores en el cocultivo de los callos con A. tumefaciens: tiempo de inoculación, concentración de acetosiringona, temperatura y tiempo de cocultivo. Para comparar el efecto de cada factor sobre la expresión GUS se cuantificó la actividad transitoria mediante fluorimetría. Los valores más altos de actividad fluorimétrica fueron obtenidos con las siguientes condiciones: 10 min de inoculación, 100µM de acetosiringona en el medio de cocultivo y 3 días de cocultivo a 20 °C.

Evaluating the effect of MS medium and temperature in developing Marchantia polymorpha L. (Marchantiaceae) propagules in in vitro and ex vitro conditions

En este trabajo de investigación se propagaron, bajo condiciones in vitro, propágulos de Marchantia polymorpha evaluando su desarrollo vegetativo mediante observaciones y registros semanales a cada cultivo por tratamiento en función del tiempo de desarrollo. En este contexto, se evaluó cualitativamente la forma y las características del talo, las cuales se valoraron mediante observaciones y registros semanales. Se analizaron los resultados cuantitativos mediante un análisis de varianza con diseño al azar y arreglo factorial 4 x 2, mediante la prueba estadística de Fisher. Las condiciones apropiadas de cultivo para propágulos de M. polymorpha se establecieron en una concentración de 25% de sales minerales Murashige y Skoog (1962), incubados a una temperatura de 25 ± 1 °C. Luego de 13 semanas de desarrollo bajo condiciones in vitro, se adaptaron a condiciones naturales mediante un cambio de sustrato, y controlando la temperatura y humedad en el lugar de desarrollo. En esta etapa se evaluó la sobrevivencia de plantas durante 10 semanas; posteriormente al cambio de condiciones, y como característica cualitativa, se tuvo en cuenta el vigor del talo. Este protocolo de propagación de M. polymorpha, pionero en Colombia, es un modelo que permite conservar y cultivar de manera masiva diferentes especies de briófitos, especialmente aquellos que se encuentran en vías de extinción en nuestro país

Marchantia polymorpha propagules were propagated in this research in in vitro conditions to assess their growth in terms of development time. Development rate and contamination regarding each treatment were also evaluated by weekly observations and crop records for each experimental unit per treatment. Talus shape and characteristics were also qualitatively evaluated by weekly observations and records. Fishers statistical test was used for analysing quantitative results by variance analysis with random design and 4 x 2 factorial arrangement. Appropriate conditions for cultivating M. polymorpha propagules were established at 25% Murashige and Skoog mineral salt concentration (1962), incubated at 25°C ± 1°C. After 13 weeks development in in vitro conditions, they were adapted to natural conditions by changing development site substrate and controlling temperature and humidity. Plant survival was evaluated for 10 weeks during this stage. Conditions were then changed and (as qualitative characteristic) talus vigour was taken into account. In was also determined that the ex vitro cultivation level should allow for gradual adjustment to new humidity, temperature and substrate conditions, taking special care that these conditions were not so altered as to become insurmountable. This pioneering M. polymorpha propagation protocol in Colombia is a model for the future maintenance and mass development of different bryophyte species, especially those which are endangered in our country

Evaluating the presence of the mer A gene implied in mercury detoxification from native actinomycete strains from La Conejera wetlands

Se aislaron diez cepas de actinomicetos nativos del humedal La Conejera a partir de muestras de sedimento y agua, con el fin de determinar la capacidad de resistencia y detoxificación de mercurio, evaluando la presencia del gen mer A involucrado en el proceso. La prueba de resistencia fue realizada mediante un test de sensibilidad tomando concentraciones desde 3,68x10-3 mM hasta 10 mM de HgCl2. Se realizaron curvas de crecimiento de 192 h para las cepas resistentes al mercurio, en un medio suplementado con 0,01 mM y 0,05 mM de HgCl2, realizando una fermentación discontinua y midiendo el crecimiento por la técnica de peso seco. A partir de estos resultados se determinó un tiempo de adaptación de 24 h y una producción máxima de biomasa de 2,72 g·L-1 a la hora 72. Paralelamente, se realizó la secuenciación de los genes de resistencia al mercurio de Streptomyces lividans 1326, por medio del diseño de los oligonucleótidos capaces de amplificar el extremos 3 del gen mer A, codificador de la enzima mercurio reductasa. Se optimizaron las condiciones de amplificación por PCR para obtener un producto amplificado de 686 pb aproximadamente. Finalmente, se realizó una electroforesis en campo pulsado comprobando la presencia de plásmidos en la cepa KH7 con tamaños aproximados de 50, 90 y 300 Kb, no integrados al cromosoma y posiblemente asociados a la resistencia presentada frente al metal.

Ten native actinomycete strains were isolated from water and sediment samples collected in La Conejera wetlands to assess mercury resistance and detoxification ability for evaluating the presence of the mer A gene involved in that process. Sensitivity assays were performed using 3.68 x 10-3 mM to 10 mM HgCl2 concentrations. Growth curves were generated for each resistant strain after 192 h in discontinuous fermentation in medium supplemented with 0.01 mM and 0.05 mM HgCl2. Biomass growth was then measured by dry weight, maximum value (2.37 gL-1) being obtained after 72 h. Primer pairs were designed based on the sequence encoding the mercury-reductase enzyme in Streptomyces lividans 1326. PCR conditions for amplifying that region were standardised. The mer A gene was identified in the KH7 strain, resulting in an amplified product of around 686 bp. The KH7 strain electrophoresis profile obtained by pulsed field gel electrophoresis showed 50, 90 and 300 Kb plasmid DNA which could be related to metal resistance in this strain.

Comparing microbacterial flora by using two methodologies for treating household solid waste in Garagoa, Boyacá

El objetivo de esta investigación consistió en comparar la flora microbiana a partir de la metodología convencional implementada en Garagoa, Boyacá, para el tratamiento de residuos sólidos domiciliarios con una metodología experimental que consistió en humectar los residuos con agua en lugar de lixiviado, y no mezclar el material por tratar con otro de distintos tiempos de compostaje; para tal fin, se caracterizaron y determinaron los tamaños poblacionales de heterótrofas totales, pseudomonas, hongos y actinomicetos a partir de muestras tomadas en distintas etapas del proceso. De las distintas muestras analizadas se identificaron hongos de los géneros Cladosporium y Aspergillus, propios del proceso de compostaje, Fusarium, Scopulariopsis, Moniliella, Curvularia y levaduras del género Rhodothorula. En el agar ISP2 (para el aislamiento de actinomicetos) se identificaron diversos morfotipos: bacilos esporulados, bacilos gramnegativos, cocobacilos, cocos grampositivos y una bacteria del género Streptomyces. De acuerdo con los resultados de los tamaños poblacionales de los grupos de microorganismos estudiados no se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos evaluados; sin embargo, el mayor promedio de los recuentos se presentó en el tratamiento experimental.

This research was aimed at comparing microorganisms from conventional household solid waste treatment in Garagoa, Boyacá, using an experimental methodology consisting of moistening waste with water instead of lixiviate and not mixing the material to be treated with other material having different composting times (i.e. organic fertilizer). Complete heterotopous, pseudomona, fungi and actinomycete population size were thus characterised from samples taken from different stages of the process. Fungi from the Cladosporium and Aspergillus genera (from composting) were identified from this analysis, as well as Fusarium, Scopulariopsis, Moniliella, Curvularia and yeasts from the Rhodothorula genera. Some morphotypes were identified in the ISP2 agar (for the actinomycete isolate): sporulated bacilli, gram-negative bacilli, cocobacilli, gram-positive coci and one bacterium from the Streptomyces genus. According to the results regarding the population sizes of the microorganism groups studied, no meaningful differences were presented between the treatments being tested; however, the experimental treatment presented the highest average count.

Using different disinfection treatments on in vitro cultures of the caraqueño Dioscorea alata L. clone

El cultivo in vitro, como técnica, consiste en cultivar asépticamente una porción aislada de la planta bajo condiciones de ambiente controlado, para que las células expresen su potencial intrínseco e inducido. El presente trabajo tuvo como objetivo determinar el efecto de diferentes concentraciones y tiempos de inmersión en hipoclorito de sodio en el establecimiento in vitro de explantes primarios de ñame (Dioscorea alata L.) clon caraqueño. Las variantes de desinfección consistieron en la utilización de diferentes concentraciones de hipoclorito de sodio (1,5; 2 y 2,5%) durante distintos tiempos de inmersión (10; 20 y 30 min). A los 7 días se evaluó el porcentaje de contaminación de bacterias y hongos respectivamente, y a los 40 días el número de nudos de novo, la longitud del vástago, el número de hojas, y el porcentaje de explantes establecidos y necrosados. Se aplicó un diseño experimental completamente aleatorizado con análisis de varianza bifactorial y clasificación simple. Se realizó la prueba de comparación de medias de Tukey para un nivel de significación del 5%. Los resultados obtenidos arrojaron que el tratamiento de desinfección de segmentos uninodales de ñame con hipoclorito de sodio al 1,5% durante un tiempo de inmersión 30 min es el de mayor efectividad para el establecimiento in vitro de explantes primarios del ñame (D. alata L.) clon caraqueño con altos porcentajes de supervivencia en condiciones ex vitro.

The in vitro culture technique consists of aseptically culturing an isolated plant portion in controlled environmental conditions for the cells to express their intrinsic and induced potential. This work was aimed at determining the effect of different sodium hypochlorite concentrations and immersion times on in vitro establishment of yam (Dioscorea alata L.) caraqueño clone primary explants. Disinfection varied by using different sodium hypochlorite concentrations (1.5%, 2% and 2.5%) during different immersion times (10, 20 and 30 min). Bacterial and fungal contamination percentages were evaluated after 7 days and de novo bud number, shoot length, leaf number, explant establishment and necrosis percentages were determined after 40 days. A totally randomised experimental design was applied, having one- and two-factor variance analysis; the Tukey test was used for comparing means at 5% significance level. The results showed that the most appropriate disinfection treatment for uninodal yam (D. alata L.) segments used 1.5% sodium hypochlorite during 30 min immersion; this was most effective for the in vitro establishment of yam (D. alata L.) clone caraqueño primary explants, having high survival percentage in ex vitro conditions.

Comparative study of Chalcone synthase promoters across plant families

In the post - genomic era the understanding of gene regulation has become a challenge and a research priority. In this research, we performed a comparative study of the regulator sequences of the chalcone synthase gene across plant families. Twenty-two sequences of chalcone synthase promoters were compared considering three regulator Cis elements: G-Box, H-Box and TATA Box. Our results show that these Cis elements are conserved among species and even at the family level. However, in some species all of the Cis elements were not found, showing that the expression and regulation of these promoters via the Cis elements can be variable. Additionally, a comparison between promoters from a species with a chalcone synthase multigene family showed that the duplicate genes are variable in the composition of the Cis elements, suggesting that these genes could be expressing in different ways.

En la era post-genómica, el entendimiento de la regulación génica se ha convertido en un reto y una prioridad de investigación. En este trabajo realizamos un estudio comparativo de las secuencias reguladoras del gen de la chalcón sintetasa de varias familias botánicas. Veintidós secuencias de promotores de Chalcone Synthase fueron comparados teniendo en cuenta tres elementos Cis reguladores: Caja-G, Caja-H y Caja-TATA, que podrían estar actuando como una sola unidad cooperativa. Nuestra comparación muestra que estos elementos puede que se conserven en algunas especies e inclusive que se conserven a nivel de familia. Sin embargo, en algunas especies no todos los elementos Cis fueron encontrados, mostrando que no todas las especies se regulan bajo los mismos parámetros. Adicionalmente, una comparación entre promotores de una misma especie con una familia de multigenes Chs, mostró que los genes duplicados son variables en la composición del elemento Cis, sugiriendo que estos genes pueden estarse expresando de maneras diferentes.

The characteristics of Trichoderma harzianum as a limiting agent in edible mushrooms

El incremento dramático de incidencia y severidad de los mohos verdes en la producción de hongos comestibles se refleja en la aparición de formas altamente agresivas de éstos patógenos, como es el caso de los biotipos de Trichoderma harzianum (Th1, Th2., Th3 y Th4), que han sido encontrados en Europa y Norte América, donde la importancia de la patogenicidad de dicho moho se comprobó en 1995 con las pérdidas del 30-100% en las plantas de hongos comestibles en Chester, Pennsylvania. En México se han identificado diversos mohos contaminantes, entre los cuales Trichoderma spp., se encuentra frecuentemente en la producción de hongos comestibles (Agaricus bisporus, Pleurotus ostreatus y Lentinula edodes), en el 2004, un grupo de investigación detectó la presencia de cepas altamente agresivas de T. aggressivum f. aggressivum, identificadas con técnicas clásicas y moleculares, en muestras de substrato (compost) contaminado, proporcionado por la principal planta de hongos de México. Actualmente se desconoce la situación sobre la distribución de Trichoderma harzianum y los problemas de contaminación en la producción de hongos comestibles, tanto de zonas rurales, como de zonas industrializadas en México, puede causar serias disminuciones en la producción de hongos comestibles y presentar pérdidas económicas para los productores de la región

The dramatic increase of green mould incidence and severity in edible mushroom production has been reflected in the emergence of highly aggressive forms of these pathogens, such as Trichoderma harzianum biotypes (Th1, Th2, Th3 and Th4). These have been found in Europe and North America where the importance of the moulds pathogenicity was discovered in 1995 leading to 30%-100% losses from Th4 in edible mushrooms from farms in Chester, Pennsylvania. Several contaminating moulds have been identified in Mexico, Trichoderma spp. frequently occurring in edible mushroom production (Agaricus bisporus, Pleurotus ostreatus and Lentinula edodes). A research group detected the presence of highly aggressive strains of T. aggressivum f. aggressivum in 2004, identified by classical and molecular techniques on contaminated substrate (compost) samples provided by the main edible mushroom-growing farm in Mexico. The current situation regarding Trichoderma harzianum distribution and contamination problems in edible mushroom production in both rural and industrial areas in Mexico remains unknown. This can lead to a serious decrease in edible mushroom production lead to financial loss for the regions producers.

Techniques for detecting in vitro apoptosis and cell senescence and their importance in health biotechnology

Se presenta una revisión bibliográfica sobre las principales técnicas de detección de los niveles de apoptosis y senescencia celular para aplicación en cultivo de células animales y humanas, dada la importancia de establecer la metodología más adecuada para su implementación en investigación biológica y biomédica que usa este tipo de células como medios de diagnóstico, experimentación y obtención de alternativas terapéuticas. Existe la necesidad de aplicar técnicas estandarizadas para evaluación y monitoreo del cultivo de células ya que esto garantiza la calidad del mismo cuando este tiene aplicación en el campo clínico. La apoptosis y la senescencia celular se perfilan como parámetros biológicos idóneos para esta valoración. La apoptosis se considera una forma de muerte celular que, a diferencia de la necrosis, es ordenada, programada y dependiente de energía, que implica la activación de un grupo de enzimas proteolíticas denominadas caspasas y una cascada molecular intracelular hasta la desaparición completa de la célula. La senescencia celular se define como la pérdida irreversible de la capacidad proliferativa de la célula que al mismo tiempo se encuentra en un estado metabólicamente activo. Se muestra una comparación entre las técnicas de detección de estos fenómenos y, finalmente, se enfatiza en la opción de implementar multiensayos para una determinación más sensible y rigurosa de apoptosis y senescencia celular in vitro.

This article reviews the main techniques for detecting apoptosis and cell senescence levels for application in animal and human cell cultures, given the importance of establishing the most appropriate methodology for implementing them in biological and biomedical research which uses these kinds of cell for diagnosis, research and in therapeutic alternatives. There is a need for implementing standardised techniques for assessing and monitoring cell cultures as this guarantees culture quality if they can be applied in the clinical field. Apoptosis and cell senescence appear to be good biological parameters for such evaluation. Apoptosis is considered to be a form of organised and programmed cell death, unlike necrosis; this process is energy dependent, implying the activation of proteolytic enzymes called caspases and an intracellular molecular cascade until a cell completely disappears. Cell senescence is defined as being the irreversible loss of a cells proliferative capacity whilst still metabolically active. This analysis contrasts techniques for detecting such phenomenon and emphasises the possibility of implementing multi-assays for a more sensitive and rigorous determination of in vitro apoptosis and cell senescence.