Revista Colombiana de Biotecnología

Three decades of biotechnology in Colombia

Biotechnology as a tool for propagation, con-servation and genetic breeding in guava

Las técnicas biotecnológicas contribuyen positiva y significativamente en los programas de propagación, conservación y mejoramiento de las especies vegetales. Dentro de éstas, el cultivo de tejidos, el desarrollo de mapas de ligamientos genéticos y de QTLs y la detección de genes de interés han demostrado ser de gran utilidad para los mencionados propósitos. En este sentido, se estandarizó una técnica para la multiplicación in vitro de la forma silvestre de guayabo en tres fases de cultivo: establecimiento, multiplicación de propágulos y enraizamiento. La misma constituye una vía de utilidad para la propagación, la conservación de germoplasma y el mejoramiento genético en la especie. Además, se estandarizó un método de conservación a corto-mediano plazo. Por otra parte, se construyó un mapa de ligamiento genético para la especie empleando marcadores AFLP y SSR. Los 11 grupos del mapa de ligamiento genético y los 50 QTLs relacionados con caracteres vegetativos y de calidad interna y externa del fruto, constituyen el punto de partida para el clonaje de genes de interés agrícola y la implementación futura de la selección asistida por marcadores en el guayabo. De igual forma, las 176 secuencias candidatas a genes de resistencia (RGL) y del desarrollo de la planta (MADS-box y HOMEO-box) detectadas pueden ser de gran utilidad en la saturación del mapa de ligamiento referido, el estudio de la variabilidad presente en el cultivo, así como en la solución de problemas relacionados con el rendimiento, la producción y la resistencia a estrés biótico y abiótico.

Biotechnologies contribute positively and signifi¬cantly in the propagation, conservation and breeding programs of many plant species. From them, tissue culture, linkage maps and QTLs detection for interesting genes have been proved to be of great utility for these purposes. In this sense, a technique for in vitro multiplication of wild guava was standardized in three culture phases: establishment, multiplication and rooting. This technique constituted a useful way for propagation, germplasm conservation and genetic breeding in the specie. A method for short-medium term conservation was also standardized. On the other hand, a genetic linkage map was constructed for the specie using AFLP and SSR markers. The 11 groups of the genetic linkage map and the 50 QTLs related with vegetative and internal/external fruit characters constitute the starting point for genes cloning of agricultural interest and the future imple¬mentation of markers assisted selection in guava. Also, the 176 candidate sequences for resistance-gene-like (RGL) and plant development (MADS-box and HOMEO-box) genes detected can be of great utility in linkage map saturation, variability studies in this crop, as well as in the solution of problems rela¬ted with yielding and resistance to biotic and abiotic stresses.

Somatic Embryogenesis and friable embryogenic callus production in two cassava cultivars (Manihot esculenta Crantz)

La yuca (Manihot esculenta Crantz) es un cultivo de alta importancia en países tropicales. La transformación genética de yuca ha sido posible desde hace 15 años mediante la producción que callo embriogénico friable (CEF) a partir de embriones somáticos. En el presente trabajo se evalúan la inducción de embriones somáticos usando tres diferentes auxinas sintéticas y la producción de CEF a partir de éstos en los cultivares de yuca SG107-35 y BRA685. Estos cultivares son resistentes a la bacteriosis vascular de yuca cuyo agente causal es Xanthomonas axonopodis pv. manihotis, una de las principales limitantes del cultivo. Los resultados obtenidos muestran que en ambos cultivares la hormona Picloram a una concentración de 12 mg/l fue más eficiente que 2,4-D y Dicamba para producir embriones somáticos. Adicionalmente se consiguió la producción de CEF y la regeneración de plantas mediante embriogénesis somática en el cultivar BRA685. Los resultados del presente trabajo son importantes para evaluar la transformabilidad de distintos cultivares de yuca. Actualmente este número es bastante reducido principalmente porque la producción de CEF es fuertemente influenciada por el genotipo. Por tal razón solo se transforma de manera rutinaria y eficiente en el cultivar 60444. La posibilidad de transformación de distintos cultivares de yuca permitirá explotar la enorme variabilidad del cultivo, invitándonos a aumentar los esfuerzos para mejorar y universalizar los protocolos de transformación de yuca.

The cassava (Manihot esculenta Crantz) crop has a very important role as a food, feed and a raw material in developing countries; therefore it is a priority to develop technologies oriented to the solution of problems and agronomic improvement of the crop. The genetic transformation of cassava was developed 15 years ago by producing friable embryogenic callus (FEC) from somatic embryos as target tissue for transformation. In the present work we evaluated the induction of somatic embryos by using three different synthetic auxins and the production of FEC from both SG107-35 and BRA685 cassava cultivars; both are resistant to cassava bacterial blight caused by Xanthomonas axonopodis pv. manihotis, the most important bacterial disease affecting the crop. Our results showed that in both cultivars gave rise to somatic embryos in media containing Picloram at a concentration of 12 mg/l being more efficient than using 2,4-D or Dicamba. Additionally the cultivar BRA685 produced regenerative FEC giving rise to plants through somatic embryogenesis. However compared to the model cultivar 60444, FEC production was greatly lower. This work shows new efforts to increase the number of transformable cultivars of cassava and take advantage of the enormous genetic variability of the crop.

First report of the employment of AFLP markers in Asteraceae in Cuba.

Rhodogeron coronopifolius Griseb., es una especie vegetal de la familia Asteraceae, que se encuentra en peligro crítico de extinción. Es endémico de la provincia Villa Clara en la región central de Cuba. Habita en el matorral xeromorfo sub espinoso sobre serpentina. Existen solo cinco poblaciones naturales dentro de un área protegida, la principal causa de amenaza es la fragmentación de su hábitat por acciones antrópicas. Debido a su situación de conservación, se hace necesario realizar estudios de la diversidad genética de las poblaciones naturales para así generar información básica y diseñar una estrategia de conservación. El objetivo de este trabajo fue analizar de manera preliminar la diversidad genética de cuatro poblaciones de esta especie utilizando marcadores AFLP (Polimorfismo de Longitud de Fragmentos Amplificados). Se emplearon dos combinaciones de iniciadores y se evaluó el porcentaje de polimorfismo así como la similitud entre los individuos. Se obtuvieron 165 loci de los cuales el 78,7 % fueron polimórficos. La población de mayor polimorfismo fue Corojito con 85,2%, de manera general el polimorfismo fue alto con valores entre 75 y 87%. La similitud entre los individuos también fue alta con un promedio de 0,74. El agrupamiento genético fue independiente a la población de procedencia, lo que sugiere que existe intercambio genético entre las poblaciones y que estas comparten más del 80 % de los alelos que fueron analizados. Los resultados obtenidos son importantes para el mantenimiento in situ de la especie y para tomar decisiones en aras de su conservación.

Rhodogeron coronopifolius Griseb., is a specie of Asteraceae family, in critical danger of extinction. It is an endemic of Villa Clara city in the central region of Cuba. Its inhabits sub thorny xeromorphic heath on serpentine soil. Only five natural populations exist included in a protected area, the main threat cause is the fragmentation of its habitat for antropics activities. Due to their conservation status, it becomes necessary to analyze the genetic diversity of the natural populations in order to generate basic information usefull to apply a conservation strategy. The main goal of this work was to evaluate in a preliminary manner the genetic diversity of four populations of this specie using AFLP markers (Amplified Fragment Length Polymorphism). Two primer combinations were used and the polymorphism percentage was evaluated as well as the similarity among the individuals. A total of 165 loci were obtained of which 78,7% were polymorphic. The population with higher polymorphism was Corojito with 85,2%. High level of polymorphism was observed among population showing values between 75 and 87%. The similarity among the individuals was also high with an average of 0,74. The genetic grouping was independent to the origin of the population. This suggesting that gene flow exists among the populations, those which share more than 80% of the alleles analyzed. This is important for the in situ maintenance of the specie and to take decisions for their conservation.

Presence of the transposable genetic element dTdic1 in Dianthus caryophyllus with variegated and no variegated flowers

El objetivo de este trabajo era la búsqueda del EGT (Elemento Genético Transponible) dTdic1 que ha sido asociado con la variegación del color de las flores de clavel y su relación con dos genes que codifican para enzimas involucradas en la biosíntesis de antocianinas, Chalcona isomerasa (CHI) y Dihidroflavonol reductasa (DFR). Su presencia y expresión se evaluó en siete genotipos con flores variegadas (líneas híbridas) y en cuatro genotipos de flores no variegadas (una línea híbrida y tres cultivares comerciales). Un alto número (indefinido) de copias del elemento dTdic1 se detectó en todas las líneas variegadas y no variegadas. En consecuencia, la sola presencia de este EGT no pudo asociarse directamente con la variegación de los pigmentos florales de flores de clavel. Adicionalmente, dTdic1 se encontró interrumpiendo el gen CHI en cuatro genotipos variegados y uno no variegado. No se observó evidencia de inserción de dTdic1 en el gen DFR en ninguno de los genotipos.

The objective of this work was to search for the EGT (Transposable Genetic Element) dTdic1 that has been associated with color variegation of carnation flowers and its relationship with two genes that code for enzymes involved in the synthesis of anthocyanins, Chalcona isomerase (CHI) and Dihidroflavonol reductase (DFR). Its presence and expression was evaluated in seven genotypes of variegated flowers and four no variegated flower genotypes (one hybrid line and three commercial cultivars). A high number of copies (undefined) of copies of the dTdic1 element was detected in variegaated and no variegated lines. Therefore, the main presence of this EGT was not associated directly with variegation of floral pigments. Additionally, dTdic1 was found interrupting the CHI gene in four variegated and one no variegated phenotypes. No evidence was observed of insertion of dTdic1 in the DFR gene in any of the genotypes.

Tissue culture of Piper sp. (Piperaceae): in vitro propagation, organogenesis and germplasm conservation

En el Nuevo Mundo el género iPiper (Piperaceae) comprende al menos 500 especies en las que muchos compuestos biológicamente activos fueron identificados; es por ello que el estudio sobre la química y biosíntesis de los miembros de este género son de gran interés, donde el cultivo de tejidos in vitro juega un rol fundamental. El propósito de este trabajo fue desarrollar varios sistemas de cultivo in vitro, en diferentes especies de Piper, con la finalidad de propagarlas clonalmente y regenerarlas por organogénesis directa para el establecimiento de plantas en campo, y la conservación y transferencia internacional de germoplasma. La germinación de semillas alcanzó aproximadamente entre el 20 y el 99% después de 4 semanas de cultivo. La micropropagación fue realizada en medio de cultivo MS suplementado con sacarosa 3%, AIA 0,02 mg L-1 y AG3 0,02 mg L-1. El potencial morfogenético de explantes de raíz, peciolo, hoja, nudo y entrenudo fue investigado con la finalidad de desarrollar un protocolo confiable de regeneración de plantas. La conservación e intercambio internacional de germoplasma in vitro también fue realizado, entre Perú, Brasil y Ecuador.

In the New World the genus Piper (Piperaceae) contains at least 500 species in which many biologically active compounds were identified; is why the study of the chemistry and biosynthesis in members of this genus are of interest, and here techniques in vitro tissue culture plays a fundamental role. The aim of this work was to establish several in vitro culture systems in different Piper species in order to propagate clonally and regenerate by direct organogenesis for the establishment the field plants, the conservation and international germoplasm exchange. The seed germination achieved approximately 20 - 99% after 4 weeks of culture. The micropropagation was performed on MS culture medium supplemented with sucrose (3%), IAA (0,02 mg L-1) and GA3 (0,02 mg L-1). Callus induction and morphogenetic potential of root, petiole, leaf, node and internode explants was investigated to develop a reliable plant regeneration protocol. The in vitro germplasm conservation and international germplasm exchange also was realized, between Perú, Brazil and Ecuador.

In vitro **plant regeneration of Spartina argentinensis Parodi**

Spartina argentinensis Parodi es la especie dominante en comunidades halófitas que ocupan alrededor de 20.000 km² en la Provincia de Santa Fe, Argentina. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un método simple para la regeneración de plantas in vitro de S. argentinensis que podría ser utilizado para la investigación básica y aplicada. Se utilizaron como explantes, segmentos basales de hojas de plantas jóvenes y maduras, puntas de raíces e inflorescencias inmaduras. Los medios de cultivo utilizados para callos, brotes e inducción de raíces consistió en la base salina de Murashige y Skoog suplementado con diferentes reguladores del crecimiento vegetal (2,4-D; BAP o ANA). La mayoría de los explantes (con la excepción de puntas de raíces) mostró una proliferación celular y formación de callos después de 30 días de cultivo. Solo las inflorescencias inmaduras regeneraron brotes y raíces cuando los callos se incubaron en sales MS con 2,4 -D y BAP (0,1 y 0,01 mg.L-1, respectivamente), posteriormente los callos se transfirieron a medio de inducción de brotes (sales MS, 0,5 mg. L-1 BAP) y luego a medios de inducción de raíz ( MS y 0,5 mg.L-1NAA). Las plantas regeneradas se evaluaron para detectar anomalías morfológicas y el contenido de lignina de sus hojas. El análisis histológico de los callos mostró que los brotes y las raíces se originaron vía organogénica. Un bajo porcentaje de las plantas regeneradas mostraron deficiencia de clorofila (plantas albinas) y otras anomalías morfológicas. Entre las plantas regeneradas se detectó variaciones significativas en el contenido de lignina. El protocolo que se describe en este trabajo podría ser utilizado para la regeneración in vitro de plantas de S. argentinensis y la selección de variantes somaclonales para futuros planes de mejoramiento.

Spartina argentinensis Parodi is the dominant species of the temporally-flooded halophyte communities of the Santa Fe Province, Argentina. It occupies around 20,000 km² and it is mainly used as low-cost impute forage for cattle production. The objective of this work was to develop a simple method for in vitro plant regeneration of S. argentinensis that could be used for fundamental and applied research. Leaf-basal segments from both young and mature plants, roots tips and immature inflorescences were used as explants. Culture media for calli, shoot, and root induction consisted of Murashige & Skoog salts supplemented with different plant growth regulators (2,4-D; BAP or ANA). Most of the explants (with the exception of root tips) showed cell proliferation and calli formation after 30 days of culture. However, only immature inflorescences responded to shoot and root induction when calli were incubated on MS salts plus 2,4_D and BAP (0.1 and 0.01 mg.L-1, respectively), transferred to shoot inductionmedia (MS salts plus BAP, 0.5 mg.L-1) and then to root induction media (MS slts plus NAA 0.5 mg.L-1). Regenerated plants were evaluated for morphological abnormalities and lignin content. Historical analysis of regenerating calli showed that shoots and roots originated via organogenesis. A low proportion of regenerated plants resulted with deficiency in chlorophyll (albino plants) and other morphological abnormalities. Interestingly, significant variations in the lignin content were detected between regenerated plants. The protocol described in this work could be used ordinarily for S. argentinensis in vitro plant regeneration and selecting somaclonal variants for breeding purposes.

Characterization of lignocellulose-degrading rare actinobacteria: demostration of laccase activity in two isolates of Tsukamurella sp and Cellulosimicrobium sp

Las características fisicoquímicas de la lignina y su compactación con la celulosa han dificultado la explotación biotecnológica de enormes cantidades de biomasa vegetal. Las lacasas constituyen una subfamilia de oxidasas multicobre que intervienen en la despolimerización de la lignina. Si bien han sido ampliamente caracterizadas en los hongos, los estudios de la diversidad y las funcionalidades de las lacasas en los procariotas se han centrado especialmente en isoformas enzimáticas de Streptomyces sp. En este trabajo se aislaron 20 cepas de actinobacterias del suelo. La actividad lacasa de 17 de ellas fue evidenciada en ensayos cualitativos con guayacol y dos cepas seleccionadas fueron caracterizadas en detalle. Las pruebas morfológicas y el análisis de las secuencias del gen 16S rRNA apuntan a que estos dos aislados pertenecen a los géneros Tsukamurella y Cellulosimicrobium. En cultivo sumergido con agitación, AC01 (Tsukamurella sp.) expresó una máxima actividad de oxidación de ABTS (2,2-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato) de 108 U/L. Por otra parte, AC18 (Cellulosimicrobium sp.) que había exhibido una actividad oxidativa de guayacol superior a las 16 cepas restantes y demostró ser resistente a niveles tóxicos de cobre, logró un valor máximo de oxidación del ABTS de 0,56 U/L. Estos resultados sugieren que en el aislado AC18 operaría un fenómeno de especificidad de sustrato o de inductor, regulador de la expresión y de la actividad lacasa cuantificable. La caracterización genómica y funcional de las lacasas de nuevas actinobacterias lignocelulósicas ampliará la gama de centros redox con aplicaciones biotecnológicas específicas, además de facilitar el establecimiento de sus relaciones evolutivas con las eucariotas.

The physicochemical characteristics of lignin and its compaction with cellulose have restricted the biotechnological exploitation of enormous amounts of plant biomass. Laccases are a subfamily of multicopper oxidases involved in lignin depolymerization. Although they have been extensively characterized in fungi, studies of the diversity and functions of laccases in prokaryotes are mainly on enzyme isoforms of Streptomyces sp. In this work we isolated 20 strains of soil actinomycetes. The laccase activity of 17 of them was evidenced in qualitative assays with guaiacol, and two selected strains were characterized in detail. The morphological evidence and the analysis of the 16S rRNA gene sequences suggest that these two isolates belong to the genera Tsukamurella and Cellulosimicrobium. In submerged cultures with shaking, AC01 (Tsukamurella sp.) exhibited a maximal oxidation activity of ABTS (2,2 '-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate) of 108 U/L. On the other hand, AC18 (Cellulosimicrobium sp.) that exhibited a higher oxidative activity of guaiacol than the other 16 isolated strains and showed resistance to toxic levels of copper, reached a maximum ABTS oxidation rate of 0.56 U/L. These results suggest that in AC18 operates a mechanism of substrate or inducer specificity, regulating the measurable laccase activity and laccase gene expression. Genomic and functional characterization of laccases of new ligninolytic actinomycetes may help to extend the range of redox centers with specific biotechnological applications, as well as establishing their evolutionary relationships with eukaryotes.

Halotolerant alkalophilic and indolacetic acid producing bacteria associated with Arthrospira platensis (Cyanophyceae)

Este trabajo tuvo como propósito contribuir al conocimiento de la interacción entre la cianobacteria alcalófila Arthrospira platensis y las bacterias que crecen asociadas a su mucilago. Se desarrolló un medio de cultivo heterotrófico en el cual se aislaron cinco cepas bacterianas asociadas a un monocultivo de A. platensis. Se determinó la capacidad de estas cinco cepas para producir ácido 3- indol acético (AIA). La tipificación molecular de los aislamientos bacterianos permitió identificarlos como Exiguobacterium aurantiacum str. DSM 20416, Xanthomonas sp. ML-122, Halomonas sp. Ap-5, Bacillus okhensis str. Kh10-101, Indibacter alkaliphilus, type str. LW1T; todas las cepas bacterianas obtenidas son halotolerantes, alcalófilas y productoras de AIA. Los resultados aportan evidencia para sugerir una interacción benéfica entre A. platensis y sus bacterias asociadas, quizá como estrategia evolutiva de cooperación para desarrollarse en un ambiente hipersalino.

The aim of this study was contribute to knowledge over alkalophilic cianobacteryum Arthrospira platensis and their interaction with some associated bacteria growing in their mucilage. Heterotrophic culture medium was designed, in this medium were isolated five bacterial strains associated to single culture of A. platensis. It was measured the 3-indol acetic acid (IAA) production by these bacterial strains. Molecular typing allowed identify these bacterial strains like Exiguobacterium aurantiacum str. DSM 20416, Xanthomonas sp. ML-122, Halomonas sp. Ap-5, Bacillus okhensis str. Kh10-101, Indibacter alkaliphilus, type str. LW1T; all these bacteria are halotolerant, alkalophilic and IAA producer. The findings allow suggest a beneficial interaction between A. platensis and their associated bacteria, maybe as evolutionary strategy of cooperation to grow and develop in hypersaline environments.

Identification of polyhydroxyalkanoate-producing bacteria in soils contaminated with fique wastes

Los Polihidroxialcanoatos (PHAs) son biopolímeros con características similares a los plásticos sintéticos, pero rápidamente biodegradables dado su origen microbiano. En esta investigación se aislaron 248 colonias bacteriales de suelos contaminados con residuos del beneficio de fique en Guarne (Antioquia), evaluándose su capacidad como productoras de PHAs. Se realizaron tinciones con rojo y azul de Nilo y detección por PCR del gen PhaC. Las bacterias positivas a dichas pruebas, fueron identificadas utilizando análisis filogenético de secuencias de 16S del ADNr y pruebas bioquímicas. Finalmente, se evaluó, mediante cromatografía de gases con detector selectivo de masas GC-MS/SIM, la naturaleza química del biopolímero, a partir de la biomasa generada en un ensayo de fermentación en cultivo sumergido, con medio mínimo de sales suplementado con glucosa como fuente de carbono. Cuatro cepas de los morfotipos bacteriales encontrados, presentaron potencial para producir PHAs, de los cuales dos fueron identificados como miembros de la especie Bacillus megaterium, uno como B. mycoides y el otro como Gordonia sp. El gen PhaC se detectó en los dos aislamientos de B. megaterium. El análisis cromatográfico permitió detectar al Polihidroxibutirato (PHB) como el principal componente de los PHAs presentes en B. megaterium, cuantificándose entre 63.8 mg/g y 95.3 mg/g de PHB en los ensayos de fermentación. Las bacterias aisladas tienen potencial en la producción de PHAs a partir de residuos agroindustriales, incluyendo el jugo de fique, lo que contribuiría a la reducción de su condición contaminante.

Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are biodegradable biopolymers of bacterial origin with properties similar to conventional plastics. In this work, bacteria were isolated from soils contaminated with fique wastes in the municipality of Guarne (Antioquia) and their ability to produce PHAs was evaluated. Bacteria were stained with Nile blue and Nile red and the PhaC gene detected by PCR. Positive bacteria were identified by phylogenetic analysis of 16S rDNA and biochemical tests. The chemical nature of the biopolimers was determined by gas chromatography GC-MS/SIM using biomass produced in a submerged fermentation in a minimal media supplemented with glucose as sole carbon source. Four bacterial morphotypes identified as Bacillus megaterium (2), B. mycoides (1) and Gordonia sp. (1) showed potential to produce PHAs. However, the PhaC gene was detected in B. megaterium. Chromatographic analysis showed polyhydroxybutirate (PHB) to be the main component in the PHAs produced by B. megaterium with levels between 63.8 mg/g and 95.3 mg/g in the fermentation test. The isolated bacteria have potential to produce PHAs, generating added value to the Agro-industrial waste, as in the fique industry, and reducing its contamination impact.

Effect of two cytokinin, ascorbic acid and sucrose to obtain in vitro shoots of sorghum for calli formation

El trabajo se realizó con el objetivo de obtener brotes in vitro vía organogénesis directa en sorgo variedad CIAP 2E-95, para la formación de callos con estructuras embriogénicas. Se tomaron semillas maduras de plantas que crecían en condiciones controladas, las que se desinfectaron y fueron colocadas a germinación en un medio de cultivo con las sales MS, mioinositol 100 mg L-1, sacarosa 3%, pH 5,7, Fitagel 2,5 g L-1. Para la multiplicación de los brotes, se estudiaron diferentes concentraciones de 6 Bencilaminopurina (6-BAP) y kinetina. El empleo en el medio de cultivo de multiplicación con las sales MS y 6- BAP 0,22 mg L-1, incrementó el número de brotes por explante y se observó la presencia de oxidación fenólica. La oxidación fenólica se contrarrestó con la adición al medio de cultivo de 50 mg L-1 de ácido ascórbico y se incrementó significativamente el número de brotes, altura y número de hojas. En la obtención de brotes in vitro de calidad para la formación de callos, estos fueron engrosados con las sales MS, sin reguladores de crecimiento, ácido ascórbico 50 mg L-1, Fitagel 2,5 g L-1, pH 5,7 y 40 g L-1 de sacarosa. La formación de callos con estructuras embriogénicas a partir del cilindro central de las hojas enrolladas del segmento más próximo a la base de los brotes engrosados se alcanzó a los 45 días de cultivo. Los segmentos del cilindro central de las hojas enrolladas constituyen una fuente segura y promisoria de explantes para la formación de callos embriogénicos.

The current work aimed to obtain in vitro shoots by direct organogenesis from sorghum variety CIAP 2E-95, for the formation of calluses with embryogenic structures. Mature seeds were collected from plants grown under controlled conditions, which were disinfected and were placed in a germination medium with MS salts, myo-inositol 100 mg L-1, 3% sucrose, pH 5.7, phytagel 2.5 g L-1. Different concentrations of 6-benzylaminopurine (6-BAP) and kinetin were studied for shoot multiplication. Using 6 - BAP 0.22 mg L-1 in the multiplication culture medium increased the number of shoots per explant, showing phenolic oxidation. Adding 50 mg L-1 of ascorbic acid to the culture medium resisted phenolic oxidation and the number of sprouts (5.0), height and number of leaves increased significantly. Quality in vitro buds for callus formation were obtained stimulating the thickening by using MS salts, without growth regulators, ascorbic acid 50 mg L-1, phytagel 2.5 g L-1 and pH 5.7 and 40 g L-1 of sucrose. The largest diameter of shoots, height, number of leaves and roots of in vitro plants, was achieved after 21 days of cultured in MS salts with 40 g L-1 sucrose. Calluses formation with embryogenic structures from the central cylinder of curled leaves of the nearest segment to the base of thickened shoots was achieved after 45 days of culture. Segments from the central cylinder of the curled leaves are a safe source for the formation of embryogenic calli.

Performance of a Sequencing Batch Reactor (SBR) in the treatment of domestic sewage

Se estudió la remoción biológica de materia orgánica y nutrientes de un agua residual doméstica empleando un Reactor Biológico Secuencial (RBS) a escala piloto. El estudio fue dividido en cuatro fases en las que se modifico la carga orgánica y la duración de las etapas anaerobia, aerobia y anoxica que conforman cada ciclo de tratamiento, considerando edades de lodo de 10 y 7,5 días. Durante las Fases I y II se operó el sistema con bajos valores de carga másica: 0,364 y 0,220 kg.DQO/Kg.SSV.dia, mientras que durante las Fases III y IV se emplearon cargas mayores: 0,665 y 0,737 kg.DQO/Kg.SSV.dia respectivamente. Los resultados obtenidos muestran que las mayores eficiencias de remoción de materia orgánica en términos de DBO se alcanzaron durante la Fases III (91%) y IV (82%), con remoción de fósforo superior a 40%. En cuanto al proceso de nitrificación durante las Fases I y II se registraron tasas de 0,032 y 0,024 kg.N-NH3/kg.SSV.dia, esto debido al menor contenido de materia orgánica y a la baja relación DBO/NKT, mientras que durante las Fases III y IV estas fueron menores: 0,015 kg.N-NH3/kg.SSV.dia durante la Fase III y 0,020 kg.N-NH3/kg.SSV.dia en la Fase IV, sin embargo, fue en estas fases donde se alcanzaron los mayores niveles de desnitrificación durante la etapa anóxica, favorecido por una relación C/N adecuada, próxima de 4 kg.DBO/kg.N-NO3- y la presencia de un substrato de fácil biodegradación. Los resultados obtenidos muestran los RBS como una alternativa eficiente y viable en el tratamiento de aguas residuales domésticas.

It was studied the biological removal of organic matter and nutrients from domestic wastewater using a Sequential Biological Reactor (SBR) at pilot scale. The study was divided into four phases in which the organic load and the duration of anaerobic, aerobic and anoxic cycle were modified, considering sludge ages of 10 and 7.5 days. During Phases I and II the system was operated with low mass load values: 0.364 and 0.220 kg.COD/kg.VSS.day, while during Phases III and IV were used heavier loads: 0.665 and 0.737 kg.COD/Kg.VSS.day respectively. The results obtained show that the removal efficiencies of organic matter in terms of BOD were achieved during Phase III (91%) and IV (82%) with phosphorus removal exceeding 40%. As for the nitrification process during Phases I and II showed rates of 0.032 and 0.024 kg.N-NH3/kg.VSS.day, this due to lower organic matter content and low BOD/TKN, while during phases III and IV these were lower: 0.015 kg.N-NH3/kg.VSS.day during Phase III and 0.020 kg.N-NH3/kg.VSS.day in Phase IV, however, was in these phases which reached the highest levels of denitrification during the anoxic phase, favored by a C/N appropriate next of 4 kg.BOD/kg.N-NO3- and the presence of an easily biodegradable substrate. The results show the RBS as an efficient and viable process in the treatment of domestic wastewater.

In vitro culture response of Zamia incognita, an alternative for preservation

Las Zamiaceas son plantas relictuales consideradas fósiles vivientes. En Colombia, el 65% de esta familia se encuentra en alguna categoría de amenaza, por la destrucción del hábitat e intensa recolección. Teniendo en cuenta que entre las ventajas de la propagación in vitro está la conservación ex situ de germoplasma, el presente trabajo tuvo como objetivo evaluar el potencial de regeneración de plantas de Z. incognita a partir de explantes foliares y embriones cigoticos. Se evaluó el efecto de diferentes combinaciones de Auxinas (2,4-D y ANA) y citoquininas (KIN, BAP y TDZ) sobre la formación de callo y la regeneración de brotes (directa o indirecta), utilizando como medio basal MS (MB1) y medio basal B5 modificado (MB2). La formación de callo se presentó sobre un amplio rango de concentraciones de 2,4-D con KIN y 2,4-D con BAP, independientemente del medio basal, pero no en los explantes tratados con ANA más KIN o TDZ. Para los explantes foliares no hubo respuesta a la formación de embriones somáticos y/o brotes con las combinaciones y concentraciones hormonales evaluadas, no obstante los callos inducidos en MB2 con 2,4-D (0,22 mg/l) y BAP (0, 1, 2, 3 mg/l) fueron diferentes, su aspecto nodular, color crema y apariencia proembriogénica coincidió con una gran cantidad de células meristemáticas potenciales para el proceso de regeneración. A partir de embriones cigoticos inmaduros se logró la formación de embriones somáticos en el medio MB2 exento de reguladores o conteniendo 2,4-D solo (0,22 mg/l) y en combinación con BAP (1 mg/l), sin lograr el proceso de conversión a plántulas.

Zamiaceas are relict plants considered living fossils. In Colombia, 65% of this family is under some threat category due to their habitat destruction and their intense collection. Given that the advantages of in vitro propagation is ex situ conservation of germoplasm, this study aimed to evaluate the regeneration potential of Z incognita plants from leaf explants and zygotic embryos. The effect of different combinations of auxin (2.4-D and NAA) and cytokinins (KIN, BAP and TDZ) was evaluated on the formation of callus and shoot regeneration (direct or indirect), using MS (MB1) basal medium and B5 (MB2) basal modified medium. The callus formation was presented over a wide concentration range of 2.4-D with KIN and 2.4-D with BAP, regardless of the basal medium, but not in explants treated with ANA more TDZ or KIN. For leaf explants there was no response to the formation of somatic embryos or shoots with hormonal combinations and concentrations evaluated; however, MB2 calluses induced with 2.4-D (0.22 mg / l) and BAP (0. 1 , 2. 3 mg / l) were different, their nodular aspect, cream color and pro-embryogenic appearance coincided with a lot of potential meristematic cells for the regeneration process. From immature zygotic embryos, somatic embryo formation in the MB2 medium was achieved without growth regulators or containing 2.4-D alone (0.22 mg /l) or 2.4-D in combination with BAP (1 mg/l) without achieving the conversion process to seedlings.

Auxiliary system for positioning the stereotactic frame to the skull

En neurocirugía funcional y radioneurocirugía estereotáctica, la fijación de un marco en el cráneo, permite el establecimiento de un sistema tridimensional de coordenadas, para localizar y definir con precisión los objetivos en el cerebro. El montaje se basa en la experiencia y la percepción visual del médico, pero los resultados son subjetivos y la calibración de las coordenadas del marco con respecto al cráneo no siempre es la óptima para el desarrollo del procedimiento quirúrgico. Este estudio evalúa la eficacia y la funcionalidad de un sistema auxiliar diseñado para colocar el marco estereotáctico en el cráneo. La evaluación se realiza por medio de un estudio comparativo de dos grupos de 7 pacientes cada uno sometidos a tratamiento de radioneurocirugía. En el primer grupo no es utilizado el sistema, solo en el segundo, se tomaron 165 imágenes (IRM) en promedio por cada estudio. El empleo del sistema auxiliar disminuye la variación de la inclinación y la rotación del marco con respecto al cráneo hasta un 64%, la apreciación subjetiva del médico es sustituida por una medición objetiva, obteniéndose certidumbre al posicionar el marco sobre el cráneo. Los resultados muestran que el sistema auxiliar diseñado es eficaz y funcional.

In functional neurosurgery and stereotactic radioneurosurgery, the fixation of a frame to the skull allows the establishment of a three-dimensional coordinate system, to locate and precisely defined objectives in the brain. The montage is based on experience and visual perception the doctor, the results obtained and the calibration of the coordinates of the frame with respect to the skull is not always the optimal for developing the surgical procedure. This study evaluates the effectiveness and functionality of an auxiliary system designed to collocate the stereotactic frame to the skull. The evaluation is done by means of a comparative study of two groups of 7 patients each underwent radioneurosurgery treatment. The first group is not using the system, only in the second, were performed on average 165 images (MRI) for each study. The use of auxiliary system reduces the variation of the inclination and rotation of the frame with respect to the skull by 64%, the subjective appreciation the doctor is substituted by an objective measure, thus obtaining certainty to position the frame on the skull. The results show that the auxiliary system designed is effective and functional.

Influence of light type and intensity on induction and proliferation of somatic embryos in soybean

La embriogénesis somática representa una alternativa para la regeneración de plantas, sobre la cual influyen diversos factores durante el cultivo in vitro. Entre estos, las condiciones de iluminación durante la formación de embriones somáticos es determinante. Sin embargo, no existen trabajos que refieran el efecto de la luz solar en la formación de embriones somáticos de soya. Este trabajo tuvo como objetivo evaluar el efecto del tipo e intensidad de luz en la formación y multiplicación de embriones somáticos de soya cultivar INCASoy-27. Para ello, cotiledones inmaduros de 3,0-4,0 mm de longitud fueron colocados en medio de cultivo con 40 mg.l-1 de ácido 2,4-diclorofenoxiacético, sacarosa 3% y pH 7,0 en cámaras de crecimiento con luz artificial e intensidades luminosas de 5-10 µmol.m-2.s-1 y 68-73 µmol.m-2.s-1, y en cámaras de crecimiento con luz solar con 50-65µmol.m-2.s-1. El mayor número de cotiledones embriogénicos (95,31) se obtuvo en condiciones de luz artificial con alta intensidad luminosa. La mayor formación de embriones somáticos se obtuvo en luz artificial (9,65) y luz solar (8,45) respectivamente con alta intensidad luminosa. No se encontraron diferencias significativas en la multiplicación de los embriones somáticos, al emplear ambas fuente de luz con alta intensidad luminosa. Esta es la primera referencia sobre formación y multiplicación de embriones somáticos de soya con empleo de luz solar.

The somatic embryogenesis represents an alternative for the regeneration of plants, in which influence diverse factors during the cultivation. Among these factors, the conditions of illumination during the induction of somatic embryos are determinant. However, works not exist that refer the effect of the sunlight on the formation of embryos in soybean. The goal of this work was to evaluate the effect of light type and intensity on the induction and proliferation of somatic embryos in soybean cultivar INCASoy-27. Immature cotyledons for 3,0-4,0 mm in length was placed on culture medium with 40 mg.l-1 2,4-diclorophenoxiacetic acid, sucrose 3%, and pH 7,0 under growth chamber with artificial light and range luminous intensity between 5-10 µmol.m-2.s-1 and 68-73 µmol.m-2.s-1 and growth chamber with sunlight from 50-65 µmol.m-2.s-1 were evaluated. The higher number of embryogenic cotyledons (95,31) was obtained into growth chamber with artificial light and intensity high. The results showed the major formation of embryos in artificial light (9,65) and sunlight (8,45) with luminous intensity high. They were not significant differences between two light types during somatic embryos multiplication. This is the first report on induction of somatic embryos in soybean with employment of sunlight as illumination source.

Quantification of cultivable bacteria by the "Massive Stamping Drop Plate" method

Cuando se desea cuantificar el número de bacterias presentes en múltiples muestras, los procedimientos de rutina suelen consumir mucho tiempo. En ese periodo las muestras podrían sufrir modificaciones en su población. En el presente trabajo se evaluó una metodología alternativa para cuantificar bacterias cultivables de forma masiva, rápida y económica en la que se implica el sellado, estampado o impresión de diluciones seriadas de muestras de diversa procedencia. El tiempo requerido para preparar 22 muestras para su sellado en placa es de 15 minutos. El método se basó en realizar diluciones seriadas (base 10) de las muestras líquidas originales contenidas en una placa multipozos con la ayuda de una pipeta multicanal. Después, con un replicador se tomó un volumen (aproximadamente 1,65 µl) de muestra de cada pozo, que se inoculó por sellado en un medio de crecimiento gelificado de interés. Las placas se incubaron el tiempo necesario, se contó el número de colonias presentes en la dilución contable y se calculó el número de Unidades Formadoras de Colonia por mililitro (UFC/ml) para cada muestra. La metodología se denominó "Goteo por Sellado en Placa Masivo" (GSPM) y ha sido aplicada para cuantificar exitosamente bacterias provenientes de diferentes muestras de laboratorio, por ejemplo, de cultivos líquidos, muestras clínicas (como exudados y secreciones) y bacterias presentes en la rizósfera de plantas de maíz. Sin embargo, la metodología GSPM podría aplicarse para contabilizar masivamente a bacterias de cualquier otra procedencia.

In an attempt to quantify the number of bacteria present in a high number of samples, routine procedures are usually very time-consuming. During this period of time, bacterial population could be modified. In this work, an alternative for a massive, quick and economic method was evaluated in order to count viable bacteria, consisting in the sealing or stamping of serial dilutions performed in samples from different origins. The time required to prepare 22 samples for plate stamping is only 15 minutes. The quantification was based in performing serial dilutions (10-fold) of the original liquid samples contained in a multiwell plate using a multichannel micropipette. Afterwards, using a replicator, the same volume of each sample (approximately 1,65 µl) was recovered from each well, and then it was inoculated and sealed in a solid growth media of interest. Plates were incubated as needed, colonies were counted in the quantifiable dilution and Colony Forming Units per milliliter (CFU/ml) was calculated for each sample. We called this method "Massive Stamping Drop Plate" (MSDP) and it has been successfully applied to count bacteria from different lab samples, including liquid cultures, clinical samples (exudates and secretions) and bacteria recovered from the rhizosphere of corn plants. However, MSDP could also be applied to massively count bacteria from any other source.

Statins: Biological activity and biotechnological production.

Las estatinas de tipo I son metabolitos fúngicos de gran interés no sólo por su efecto hipocolesterolemiante sino por el número de efectos pleiotrópicos que presentan. El papel de las estatinas en la reducción de lípidos en la sangre está ampliamente documentado. En la actualidad, los estudios clínicos han puesto en evidencia que las estatinas impactan positivamente en varios órganos y en diferentes estados de algunas enfermedades, independientemente de la reducción en los niveles de colesterol. Exhiben efecto antiinflamatorio, antioxidante y acción inmunomoduladora, lo que les confiere potencial impacto terapéutico en el tratamiento de varias enfermedades. Estudios recientes las posicionan como antirretrovirales, impidiendo la replicación del virus de inmunodeficiencia adquirida (VIH). El hecho de que generan pro-apoptosis, inhibición en el crecimiento y respuesta a favor de la diferenciación de las células neoplásicas de diversos orígenes, las hace útiles en el tratamiento de leucemia, cáncer de mama, cáncer colo-rectal, de pulmón, de próstata y de páncreas. No se deben dejar de lado los efectos benéficos sobre el metabolismo óseo, gracias a su asociación con el aumento en la densidad mineral ósea y el efecto protector contra el Alzheimer y otros tipos de demencia, posiblemente debido a su participación en la relación entre el Β-amiloide y los niveles de colesterol. La necesidad de su producción en cantidades apreciables, ha llevado a los biotecnólogos a la optimización de los procesos biotecnológicos en busca de un mejor rendimiento y de tiempos más cortos de obtención, encontrando resultados tan valiosos como que si se obtienen a partir de basidiomicetos, se eliminan los problemas que se generan con las toxinas de los micromicetos. Estos procesos corresponden a fermentaciones, bien sea en estado líquido (FEL) o en estado sólido (FES), siendo la FEL la más utilizada. Si bien la biosíntesis de las estatinas está íntimamente ligada tanto al hongo como a la cepa del mismo, la composición de los medios de cultivo, la aireación, la morfología del pellet, la agitación, el tipo del proceso fermentativo, el pH, la temperatura, el uso de luz, el tipo de inóculo y del proceso, son variables determinantes para la optimización de la producción biotecnológica de estos bioactivos. Estudios comparativos ponen de manifiesto que en algunas ocasiones la FES presenta ventajas sobre la FEL, incluyendo mayor y más rápida obtención del producto. Sin embargo, la producción de lovastatina mediante FES presenta dificultades y limitaciones ya que son muchas las variables del proceso que se requieren controlar. En esta revisión se presentan los resultados más relevantes reportados en los últimos 12 años, relacionados con los dos campos, las bioactividades y la biotecnología de la producción de las estatinas tipo I.

Statins of type I are fungic metabollites of great importance not only by its hypocholestorolemic but also by its number pleoitropic effects that they show. The role of statins in the reduction of lipids in the blood is broadly reported. Currently, clinic surveys have put into evidence that statins both impact in a positive manner on several organs and in different stages of some diseases, regardless of the cholesterol reduction levels. They show an anti-inflammatory effect, anti-oxidant, and immune modulator action, which give them a therapeutic potential in the treatment of several diseases. Recent studies place them as anti-retrovirus avoiding the replication of the human immunodeficiency virus (HIV). The fact that they generate pro-apoptosis, inhibition on growing, and an favorable effect of the neo-plastic cell differentiation of diverse origins make them useful in the leukemia treatment, breast-cancer, colorectal, lung cancer, prostate cancer, and pancreas cancer. The beneficial side effects on bone metabolism should not be left aside due to its association with the increase of bone mineral density, the protector effect against Alzheimer and other types of dementia, possibly due to its participation in the relationship between Β-amyloid and the cholesterol levels. The need of its production at large amounts has led biotechnologists to the optimization of biotechnology processes seeking for a better performance on short-time processing; finding results as worth as those obtained from basiodiomycetes, eliminating the problems generated by the toxins in the micromycetes. These processes correspond to fermentations whether in liquid state or in solid state solid being the former the most used. Even though biosynthesis of statins is deeply linked as much to the fungus as to the strain of the same, the composition of the culture, aeration, pellet’s morphology, agitation, fermentation processing type, pH , temperature, light, inoculation type, are determinant variables to the optimization of biotechnological production of these bio-actives. Comparative studies show that sometimes, solid state fermentation (SSF), present some advantages over liquid state fermentation (LSF) with both a greater amount and fast processing of the product. However, the lovastatin production through SSF present difficulties and limitations as much as there many variables of the process that required to be controlled. In this review are presented the most relevant results in the latest 12 years, related with both fields, bio-actions, and the biotechnology of the production of statins type 1.

Methods and agricultural uses of genetic engineering applied to rice crop

En biotecnología de arroz se han logrado avances en transformación genética, con importantes resultados en el mejoramiento genético de variedades elite de las subespecies japónica e índica. Con el propósito de revisar los métodos y los usos agrícolas de la ingeniería genética aplicada al cultivo del arroz, se usaron varias palabras claves en idioma inglés en algunas de las bases de datos de revistas científicas indexadas, disponibles en el Sistema Nacional de Bibliotecas de la Universidad Nacional de Colombia (SINAB), seleccionando documentos publicados entre 2000 y 2011. La base de esta revisión inicial, se complementó con artículos publicados en fechas anteriores, que se consideraron relevantes, debido a que implicaban cambios metodológicos importantes. Desde que se logró producir la primera planta transgénica de arroz a finales de los 80´s, varios protocolos para la transferencia de genes se han empleado con éxito logrando la modificación genética de más de 60 cultivares de arroz. Para ello se han empleado sistemas de transformación tanto directos como indirectos. Se han realizado modificaciones de rasgos importantes en el cultivo, tales como la resistencia a factores bióticos (insectos, hongos, bacterias, virus, nematodos), tolerancia a factores abióticos (salinidad, sequía, altas y bajas temperaturas, inmersión), y mejoramiento de características agronómicas (calidad nutricional, rendimiento, uso de nutrientes, tolerancia a herbicidas).

In rice biotechnology advances have been made in genetic transformation, with significant results in breeding elite varieties of japonica and indica subspecies. In order to review the methods and agricultural uses of genetic engineering applied to rice, calves were used several words in English in some of the databases of scientific journals available in the National Libraries National University of Colombia (SINAB), selecting papers published between 2000 and 2011. Based on this initial review, it addition to some articles published at earlier dates, which were considered relevant because they involved significant methodological changes. Since it was able to produce the first transgenic rice plant in the late 80's, several protocols for gene transfer have been used successfully achieving the genetic modification of more than 60 rice cultivars. For this transformation systems have been used both direct and indirect. There have been significant changes in the crop traits such as resistance to biotic (insects, fungi, bacteria, viruses, nematodes), tolerance to abiotic (salinity, drought, high and low temperatures, immersion), improved features agronomic (nutritional quality, yield, nutrient use, herbicide tolerance).

Evaluation of Curcuma longa L. plants obtained by tissue culture in organoponic conditions.

La cúrcuma es una planta utilizada como condimento y colorante que posee múltiples propiedades medicinales. La evaluación de la estabilidad genética y la respuesta en condiciones de producción constituye una etapa muy importante en los sistemas de propagación de plantas por cultivo de tejidos. En este trabajo se evaluó la respuesta morfoagronómica de plantas de cúrcuma obtenidas por cultivo de tejido y por rizomas en condiciones de organopónico. Los resultados muestran una alta supervivencia (100%), para las plantas provenientes del cultivo in vitro, así como para las obtenidas a partir de los rizomas. Se logró un mayor crecimiento de las plantas propagadas por el cultivo de tejidos durante todo el ciclo de cultivo, sin cambios en las características morfológicas evaluadas. Los rendimientos en las plantas provenientes del cultivo de tejidos fueron superiores en comparación con las plantas propagadas por el método tradicional.

Turmeric is a plant uses like condiment and coloring. It has multiples medicinal properties. The genetic stability and response in production conditions is an important stage in plant propagation system by tissue culture. In this paper was evaluated the morphoagronomic response of turmeric plants obtained by tissue culture in organoponic conditions. Results show a high survival (100%) for a plant from in vitro culture as well as for the plant obtained by rizomes . A bigger growth of the plants obtained by tissue culture was observed during the whole cultured cycle without changes in the morphologycal characteristic evaluated. The yields of the plants obtained by tissue culture were higher that the plants planted by the traditional method.