Revista Colombiana de Biotecnología

10 años de la secuenciación del genoma humano: Encuentro entre el imaginario y la realidad

Isolated cellulolytic bacteria in the gut termites (Nasutitermes nigriceps) with probiotic characteristics and potential pasture degradation

El objetivo de la presente investigación fue aislar bacterias celulolíticas del intestino de termitas (Nasutitermes nigriceps) para determinar sus propiedades probióticas in vitro y su potencial en la degradación de pasto. Las termitas fueron tratadas con detergente antibacterial, separando y macerando luego, el intestino de las mismas en agua peptonada estéril. Diluciones de esta mezcla fueron inoculadas en cajas Petri con medio Luria Bertani (LB) y Carboximetilcelulosa (CMC) al 2%, incubando a 37º C por 24 horas, para luego revelar con Rojo Congo al 1%. Las bacterias que presentaron mayores halos de degradación fueron sometidas a tinción de Gram y a pruebas probióticas de temperatura, pH, salinidad y presencia de sales biliares, así como también a pruebas de antagonismo y degradación de pasto. Los resultados revelaron la presencia de 9 bacilos celulolíticos Gram (-) de los cuales, los bacilos BTN7 y BTN8, presentaron los mejores halos de degradación, 12 y 14 mm de diámetro respectivamente, creciendo adecuadamente en las diferentes pruebas probióticas con densidades entre 10(6) y 10(8) UFC/ml; el porcentaje de degradación de materia seca fue de 39.73% y 36.10% en 48 y 72 horas respectivamente. Las pruebas bioquímicas API E (bioMérieux SA) revelaron que los bacilos BTN7 y BTN8 pertenecen al género Enterobacter sp. Los anteriores resultados abren la posibilidad de emplear, estos microorganismos como aditivos en la alimentación de rumiantes, a fin de contribuir con un mayor aprovechamiento de pastos, y otros sustratos vegetales lignocelulósicos.

The objective of this research was to isolate cellulolytic bacteria in the gut of termites (Nasutitermes nigriceps) to determine their probiotic properties in vitro and its potential degradation of grass. Termites were treated with antibacterial detergent, separating and then macerating the intestine of the same in sterile peptone water. Dilutions of this mixture were inoculated in Petri dishes with Luria Bertani (LB) and carboxymethylcellulose (CMC) 2%, incubated at 37 ° C for 24 hours, and then revealed with 1% Congo Red. Bacteria that had higher degradation halos were subjected to tests and Gram stain probiotic temperature, pH, salinity and presence of bile salts, as well as antagonism tests and degradation of grass. The results revealed the presence of 9 bacilli cellulolytic Gram (-) of which the bacilli BTN7 and BTN8, showed the best degradation halos, 12 and 14 mm in diameter respectively, growing well in the different tests probiotic with densities between 10(6) and 10(8) CFU / ml, the degradation percentages of dry matter was 39.73% and 36.10% within 48 and 72 hours respectively. Biochemical tests revealed that API E (bioMérieux SA) bacilli BTN8 BTN7 and belong to the genus Enterobacter sp. The above results open the possibility of using these organisms as additives in feed for ruminants, in order to contribute to a better use of pasture, and other lignocellulosic plant substrates.

Evaluation of the mutagenic potential of biocides (vertimec and pentachloro) on onion

El uso de biocidas es una constante en el campo agronómico, el daño ocasionado a los cultivos y por consiguiente el gran potencial de daño para los consumidores es conocido, sin embargo su uso sigue en marcha. Por ello se realizaron pruebas citogenéticas para la observación de aberraciones cromosómicas en Allium cepa, usando muestras de raíces de plantas expuestas y no expuestas a biocídas. Los tratamientos se realizaron con el objetivo de comparar el grado de afectación de los biocídas sobre la mitosis y la ocurrencia de mutaciones cromosómicas. El ANOVA para los datos de desarrollo radicular al finalizar la experimentación, mostraron un CV de 9.88, se observo diferencias significativas entre el control y los tratamientos, los porcentajes de inhibición llegaron a tener valores máximos de 84.2% para vertimec X8 y 76.5% para pentacloro X8, y valores mínimos de 38.2% para vertimec X0.5 y 43.8% para pentacloro 0.5 X. El índice mitótico fue mayor para el control (0.193) y menores para el tratamiento con menor desarrollo radicular, vertimec X8 (0.021) y pentacloro X8 (0.028). Las pruebas citogenéticas mostraron la ocurrencia de anomalías en el ciclo celular siendo la más frecuente la C-mitosis. Se puede concluir que el test Allium es un buen indicador de citotoxicidad y genotoxicidad. Los biocidas ocasionan cambios en la estructura genómica de un cultivo, estos cambios podrían acumularse y ocasionar cambios de expresión génica, pudiendo dañar regiones de interés agronómico para una especie y afectar su estabilidad genética.

Use of biocides is a constant in the agronomic field, the damage to crops and therefore the potential for harm to consumers is known, however its use is ongoing. Therefore, tests were performed to observe cytogenetic aberrations in Allium cepa using plant root samples exposed and not exposed to biocides. Treatments were performed in order to compare the degree of impact of biocides on mitosis and the occurrence of chromosomal mutations. The ANOVA for root development data at the end of the experiment showed a CV of 9.88, significant differences was observed between control and treatments; the inhibition percentages have reached maximum values of 84.2% for Vertimec X8 and 76.5% for pentachloro X8, and minimum values of 38.2% for Vertimec X0.5 and 43.8% for pentachloro X0.5. The mitotic index was higher for control (0.193) and lower for treatment with less developed root Vertimec X8 (0.021) and pentachloro X8 (0.028). Tests showed the occurrence of cytogenetic abnormalities in the cell cycle being the most frequent C-mitosis. It can be concluded that the Allium test is a good indicator of cytotoxicity and genotoxicity. Biocides cause changes in the genomic structure of crops; these changes may accumulate and cause gene expression changes, can damage agronomic interest regions for a species and affect their genetic stability.

Numerical analysis on stresses and contact areas in a TKR Scorpio II® of Stryker®. Basis to design of customized TKR in accordance to Mexican Phenotype

El desgaste de los insertos de Polietileno de Ultra-Alto Peso Molecular (UHMWPE pos sus siglas en inglés) continúa afectando la longevidad de las prótesis totales de rodilla (PTR) junto con el aflojamiento aséptico, y ambos constituyen las dos principales causas de falla de las prótesis. Considerando esto, es necesario encontrar soluciones adecuadas para evitar el desgaste excesivo y hasta la ruptura de los insertos de polietileno. En este trabajo se realizó el estudio mediante simulación numérica de una PTR Scorpio II® Stryker®, la cual se retiró por desgaste del inserto de UHMWPE en el Hospital 1° de Octubre del ISSSTE en México. Se utilizaron las hipótesis de Bartel et al. (1995) y Chillag et al. (1991) para la validación del método numérico utilizado, las cuales establecen que el desgaste del polietileno puede reducirse utilizando insertos tibiales de mayor espesor, lo cual disminuye las presiones de contacto. Los análisis se realizaron mediante MEF variando el espesor del inserto de 6, 8, 10, 12 y 14 mm, suponiendo cargas axiales de tipo cuasi-estático en la articulación a cero grados de flexión, para 1.33 veces el peso de un individuo de 75 kg (736 N) empleando el ciclo normalizado de marcha. Los resultados obtenidos muestran similitud con los reportados por Bei et al. (2004) y Deen et al. (2006). Después de validar el método, se desarrolló el modelo de MEF de la PTR y se determinaron las curvas de esfuerzo y de áreas de contacto del inserto de UHMWPE, con lo que se obtuvo información importante para modificar el diseño y obtener una prótesis de geometría conforme en los planos coronal y sagital del inserto femoral y el inserto de polietileno, de acuerdo con el fenotipo mexicano.

Wear of UHMWPE inserts continues affecting the longevity of total knee replacements (TKR) together with septic loosening, and both constitute two main causes of prosthesis failure. It is necessary to find appropriate solutions to avoid excessive wear and failure of polyethylene inserts. In this work a study was carried out by means of numeric simulation of a Scorpio II® Stryker® TKR, which was retired due to wear of UHMWPE in the Hospital 1° de Octubre of ISSSTE in Mexico city. Hypotheses of Bartel et al. (1995) and Chillag et al. (1991) were used, which settle down that wear of polyethylene can decrease using thicker tibial inserts, which can be reduced contact pressures. Analyses of this work was carried out by means of FEM varying insert thickness of 6, 8, 10, 12 and 14 mm, considered quasi-static axial loads actuating on the articulation with zero degrees of flexion and loads equivalent to 1.33 times of bodyweight of a subject of 75 kg (736 N) was considered. Normalized gait cycle was employed and results obtained are similar to those reported by Bei et al. (2004) and Deen et al. (2006). After validating the method, a model of study case of TKR in FEM was developed and the curves of stress and contact areas of UHMWPE were determined, with which important information was obtained to modify the design, as well as to obtain a prosthesis of optimal conformity in both coronal and sagital planes of the femoral and UHMWPE inserts, in agreement with characteristics of the Mexican phenotype.

Characterization of chemosensitivity profile gene amplification status of a panel of lung cancer cell lines

En este trabajo se presentan los resultados de un análisis de amplificación génica y de sensibilidad a fármacos antineoplásicos, realizado para un panel de líneas celulares de origen tumoral pulmonar. Para los ensayos de quimiosensibilidad las células fueron tratadas durante 48 h con concentraciones variables de taxol, cisplatino, doxorrubicina y 5-fluoracilo. La citotoxicidad de los fármacos se cuantificó usando el ensayo de reducción de resazurina y se reportó en valores de concentración inhibitoria 50 (CI50). Para los análisis de amplificación génica se emplearon sondas TaqMan® dirigidas contra los genes AKT2, PIK3CA, ERBB2, EGFR, c-REL y genes de la familia MYC. El número de copias para cada gen fue calculado usando el método de doble delta Ct, empleando ACTB como gen de referencia y la línea MRC-5 como muestra control. Los resultados mostraron que la viabilidad de todas las líneas celulares se afectó por el tratamiento con taxol, cisplatino y doxorrubicina, pero no con el tratamiento con 5-fluoracilo. Las CI50 calculadas se ubicaron entre 0,38 ± 0,03 µM y 111,3 ± 3,58 µM, siendo el taxol y la doxorrubicina los fármacos más potentes. Del panel evaluado las células NCI-H292 resultaron ser las más sensibles y las células LSPG8G las más resistentes a los fármacos. Interesantemente en las células NCI-H292 ningún gen se encontró amplificado; por el contrario en las células LSPG8G los genes cMYC, MYCN, MYCL y AKT2 mostraron un aumento en el número de copias con respecto al de las células control. Estos resultados sugieren que eventos de amplificación génica podrían contribuir con el fenómeno de quimioresistencia en líneas celulares de cáncer de pulmón, sin embargo otros estudios deben realizarse para confirmar esta hipótesis.

In this paper, we show results of anticancer drug sensitivity assays and studies of gen amplification performed for a panel of lung cancer cell lines. For the chemosensitivity assays the cells were treated for 48 h with different concentrations of taxol, cisplatin, doxorubicin and 5-fluorouracil. The cytotoxic effect of each drug was determined using the resazurin reduction assay and reported in terms of inhibitory concentration 50 (IC50). For the analysis of gene amplification we used TaqMan® probes designed against AKT2, PIK3CA, ERBB2, EGFR, REL and MYC family members. Copy number for each gene was calculated using the delta-delta-CT method, employing ACTB as reference gen and MRC-5 cell line as control sample. In the chemosensitivity assays, we observed a clear decrease in cell viability in the cells treated with taxol, cisplatin and doxorubicin but not in the cells treated with 5-fluorouracil. IC50 values ranging between 0,38± 0,03 µM and 111,3 ±3,58 µM, being the taxol and doxorubicin the most potent drugs. NCI-H292 cell line was the most sensitivity and LSPG8G cell line was the most resistant. Interestingly, NCI-H292 cells did not show increase in the copy numbers for the gene evaluated, in contrast, we observed changes in the gene dosage for cMYC, MYCN, MYCL and AKT2 in LSPG8G cells. These results suggest that gene amplification could contribute to drug resistance in lung cancer cell lines; however, more studies are needed to confirm this hypothesis.

Differential molecular diagnosis Colletotrichum gloeosporioides and Fusarium oxysporum in yam (Dioscorea sp.).

Las enfermedades de origen fúngico son responsables de las mayores pérdidas reportadas en los cultivos de ñame colombianos, entre ellas la antracnosis causada por Colletotrichum spp. se destaca por ser la más devastadora. En los últimos años, hongos con baja prevalencia pero con alto poder de diseminación como Fusarium spp., han ampliado su presencia en los cultivos de ñame favoreciendo el desarrollo de enfermedades como la pudrición del tubérculo en postcosecha. A pesar de la importancia del cultivo de ñame en las regiones de la Costa Atlántica colombiana, el Pacífico y la Amazonia, este es considerado un cultivo huérfano en razón a que son pocos los esfuerzos que en investigación se realizan a nivel mundial y particularmente en Colombia. Con el propósito de aportar al diagnóstico correcto y oportuno de fitopatógenos que afectan el cultivo de ñame, se obtuvieron aislamientos fúngicos a partir de hojas con manchas necróticas. De los aislamientos obtenidos, cinco presentaron morfología propia del género Colletotrichum y tres de Fusarium. La identidad de las especies implicadas se determinó por secuenciación de los ITS del ADNr, correspondiendo a Colletotrichum gloeosporioides y Fusarium oxysporum. La evaluación de marcadores moleculares para la detección de forma diferencial y simultánea de estos patógenos, permitió seleccionar la amplificación del factor de elongación alpha (EF-α) como la mejor prueba de diagnosis. Las pruebas de patogenicidad confirmaron la capacidad de los aislados de C. gloeosporioides para causar sintomatología de antracnosis en foliolos y de los aislados de F. oxysporum para desencadenar pudrición en tubérculo, la presencia de este último en hojas se podría asociar a su fácil y rápida dispersión conidial, a su acentuada incidencia en suelo que es su hábitat natural y a su prolongada sobrevivencia.

Fungal diseases are responsible for the greatest losses in the Colombian yam crop, among these the anthracnose stands out as the most devastating. In recent years, fungi with low prevalence but high spread power such as F. oxysporum have expanded its presence in yam crops favoring the development of rot disease. Despite the importance of yam crop on the Colombian Caribbean Coast, the Pacific and the Amazon, this is considered an orphan crop because are few efforts made in its investigation in the world and particularly in Colombia. In order to contribute to the correct and timely diagnosis of fitopathogens that affect the yam crop, this study obtained fungal isolates from leaves with necrotic spots. Of these isolates, five showed morphological characteristics of Colletotrichum and three of Fusarium genus. The species identity was determined by ITS secuencing, corresponding to Colletotrichum gloeosporioides and Fusarium oxysporum. The evaluation of molecular markers for differential and simultaneous detection of these pathogens allowed to choose the elongation factor alpha (EF-α) as the best diagnostic test. Pathogenicity test confirmed the capacity of C. gloeosporioides to cause anthracnose symptomatology in leaves and F. oxysporum isolates to trigger rot in tuber, whose presence in leaves could been associated to its easy and fast conidial spread, to its heightened incidence in soil which is its natural habitat, and its prolonged survival.

Characterization of Biodiesel obtained from waste cooking oil

Se realizó un análisis físico y químico a cada uno de los siguientes tipos de aceite: desechado proveniente de asaderos de pollo, usado de hogares y fresco adquirido en el mercado local de la ciudad de Florencia, Caquetá (Colombia). Se evaluaron los siguientes parámetros: Peso específico, índice de yodo, índice de saponificación, índice de refracción, humedad y materia volátil, punto de fusión, impurezas insolubles, índice de acidez, coeficiente específico de extinción valores k232< y k270, color y prueba de Kreiss. Igualmente se evaluaron los espectros UV-VIS de los tres tipos de aceite estudiados. Se ensayaron siete diferentes tipos de catalizadores para la reacción de transesterificación manteniendo en todos los casos la proporción de catalizador: aceite 38:190 (v/v), tiempo de reacción (2h) y temperatura de reacción (60°C). Se lograron rendimientos de biodiesel de 75.8% de aceite desechado usando KOH 1,269%p/v/MeOH 99%; 87.50% de aceite usado con KOH 0,537%p/v/MeOH 99% y 86.60% de aceite fresco usando KOH 0,457%p/v/MeOH 99%. Al biodiesel obtenido en cada caso se le determinó peso específico, índice de refracción, humedad y materia volátil, cenizas sulfatadas, carbón residual, corrosión a la lámina de cobre y perfil de ácidos grasos. En todos los casos hubo predominio de ácido palmítico, ácido oléico y ácido esteárico en los aceites usados y desechados. Del análisis por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas se pudo establecer que el contenido total de ésteres metílicos de ácidos grasos es del 98,38% para el biodiesel de aceite desechado; 99,53% para el biodiesel de aceite usado y 97, 69% para el biodiesel de aceite fresco.

There was performed a physical and chemical analysis to the following types of oils: waste oil taken from chicken steakhouses, waste oil from houses and clean oil taken from the local market at Florencia, Caquetá (Colombia). There were evaluated the following parameters: specific weight, iodine value, saponification value, refractive index, moisture and volatile matter, melting point insoluble impurities acid, specific extinction coefficient k232< and k270 values, color and Kreiss test. Also, there were evaluated the UV-VIS spectra for the three types of oil studied. There were tested seven different types of catalysts for the transesterification reaction, maintaining the same ratio of catalyst for all cases: oil 38:190(v/v), reaction time (2 h) and reaction temperature (60 °C). There was achieved biodiesel yields of 75.8% discarded oil using KOH 1.269%w/v/99%MeOH; 87.50% wasted oil with KOH 0.537% w/v/99%MeOH and 86.60% fresh oil using KOH 0.457% w/v/MeOH99%. For the biodiesel obtained, in each case, was determined specific gravity, refractive index, moisture and volatile matter, sulfated ash, carbon residue, corrosion to the copper foil and fatty acid profile. In all cases, there was a predominance of palmitic, stearic and oleic acids in the waited and discarded oils. From the chromatography gases analysis with the mass spectrometry was established that the total content of fatty acid methyl esters was 98.38 % for biodiesel taken from waste oil; 99.53% for biodiesel taken from wasted oil and 97,69% for biodiesel taken from clean oil.

Comparison of RNA isolation methods for Potato yellow vein virus (PYVV) detection by RT-PCR in different organs of Solanum tuberosum Group Phureja

Potato yellow vein virus (PYVV, Crinivirus/Closteroviridae), contiene genoma tripartita de ssRNA(+), se limita al floema y causa pérdidas en la producción. Es un virus re-emergente y cuarentenario en Europa y Estados Unidos. La detección se ha basado en RT-PCR, NASH y RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR) en muestras de foliolo y tubérculo. Se desconoce como es la distribución del virus en plantas infectadas lo que hace necesario establecer un método de extracción de RNA, que sea eficiente en la obtención de material a partir de diferentes órganos. El objetivo de este trabajo fue comparar tres métodos de extracción de RNA: uno basado en Tioisocianato de guanidina (Trizol® (Invitrogen)), uno que utiliza bromuro de hexadecil trimetil amonio (CTAB) y el método fenol/cloroformo seguido por purificación con columnas de Sephadex; para detectar el virus por RT-PCR en: foliolo, peciolo, pedúnculo floral, pétalos, tallo aéreo y subterráneo, antera y brotes de tubérculo; de plantas infectadas. Los métodos de extracción fueron evaluados en términos de la integridad (relación de la intensidad de las bandas de las subunidades ribosomales 28S/18S), calidad (relación de las lecturas espectrofométricas 260/280nm) y rendimiento de los extractos. PYVV se detectó por RT-PCR en todos los órganos analizados por los tres métodos de extracción. No se presentaron diferencias estadísticamente significativas entre los tres métodos de extracción; sin embargo, Trizol® (Invitrogen) presentó mayor rendimiento, calidad e integridad; además, permitió la detección del virus por RT-PCR en todos los órganos evaluados.

Potato yellow vein virus (PYVV, Crinivirus/Closteroviridae), contains a tripartite genome with ssRNA(+), is phloem limited and can affect yield reduction. PYVV is a re-emergent virus and is a quarantine pathogen in Europe and United States. The detection has been based in RT-PCR, NASH and real time RT-PCR (RT-qPCR) in leaflets and tuber shoots samples. It is not known how is the distribution of PYVV within infected plants, for that is necessary to establish an efficient RNA isolation method for obtaining material from different organs. The objective of the present work was to evaluate three RNA isolation methods: a Trizol® (Invitrogen) based method, a method using hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) and the phenol - chloroform method followed by Sephadex columns purification; for virus detection using RT-PCR in: leaflets, petiole, peduncle, petals, stem, aerial and subterranean roots, anther and shoot tuber; of infected plants. The isolation methods were tested in terms of integrity (ratio of band intensity of 28S and 18S ribosomal subunits), quality (absorbance 260/280 ratio) and total yield. PYVV was detected by RT-PCR in all organs analyzed by the three isolation methods. There were no significant differences found among the three isolation methods, although, Trizol® (Invitrogen) presented high yield, quality and integrity, furthermore Trizol® (Invitrogen) allowed the virus detection using RT-PCR in all analyzed organs.

Expression and purification of rotavirus structural proteins VP5* and VP8* in bacteria E. coli BL21(DE3)

La caracterización de las proteínas estructurales del rotavirus y de las proteínas de la superficie de la célula hospedera implicadas en la unión y penetración del virion requiere de la disponibilidad de cantidades suficientes y de alto grado de pureza de estas proteínas. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue expresar y purificar las proteínas estructurales del rotavirus de la cepa RRV, VP5* y VP8*, y producir anticuerpos policlonales dirigidos contra ellas. Se expresaron las proteínas recombinantes VP5* (rVP5*) y VP8* (rVP8*) en bacterias E. coli BL21(DE3) transfectadas con el plásmido pGEX-4T que contenía sus secuencias codificantes. Se consideraron como variables el medio de crecimiento, número de bacterias antes de inducir la expresión, concentración del inductor y tiempo de inducción. La mayor proporción de rVP8* se obtuvo cuando las bacterias transformadas se cultivaron en medio LB y la inducción se llevó a cabo con 1 mM de IPTG cuando el cultivo alcanzó una OD 600 nm de 0.5 y la inducción se mantuvo durante 6 h. rVP5* alcanzó la mayor proporción cuando células a una OD 600 nm de 0.2 fueron inducidas con 0.5 mM de IPTG durante 4 h en medio 2XYT en presencia de glucosa al 2 %. Las proteínas recombinantes obtenidas, acumuladas en la fracción insoluble, fueron solubilizadas con detergentes iónicos y no iónicos, seguido de purificación mediante cromatografía de afinidad antes de ser empleadas como antígenos para la producción de anticuerpos policlonales en conejos. Estos anticuerpos se caracterizaron mediante su capacidad de reconocimiento de los antígenos correspondientes en ELISA, "Western blotting", y en ensayos de inmunocitoquímica en células infectadas con rotavirus RRV. La cantidad y el grado de pureza de las proteínas recombinantes obtenidas, y los anticuerpos dirigidos contra ellas, anticipan su utilidad como herramientas en la caracterización de la interacción virus-célula.

The characterization of rotavirus structural proteins and the cell surface proteins involved in virion binding and penetration depends on the availability of substantial amounts of highly purified proteins. The aim of the present work was to express and purify the rotavirus structural proteins VP5* and VP8* in order to produce polyclonal antibodies against them. Recombinant proteins VP5* (rVP5*) and VP8* (rVP8*) were expressed in E. coli cells transfected with pGEX-4T or pET 28a containing their corresponding encoding sequences. Culture medium, bacterial concentration before induction, inductor concentration and induction time were used as variables. The greater proportion of rVP8* was obtained when transfected bacteria were grown in medium LB and induction was started by adding 1 mM IPTG to cells at OD 600 nm 0.5 followed by 6 h-induction. The highest proportion of rVP5* was reached when cells at OD 600 nm 0.2 were induced with 0.5 mM IPTG for 4 h in medium 2XYT containing 2% glucose. The recombinant proteins accumulated in the insoluble fraction were solubilized with ionic and non-ionic detergents, and purified by affinity chromatography before being used as antigens for production of rabbit polyclonal antibodies. The antibodies produced were characterized through their ability to recognize the corresponding antigens in ELISA, Western blotting, and immunochemistry assays in rotavirus infected cells. The amount and purity of recombinant proteins obtained in this work, and the antibodies against them, are expected to be useful for the characterization of the virus-cell interaction.

New alternative for micropropagation in temporary immersion system of plantain cultivar "INIVITPV-2011" (AAB).

El trabajo fue desarrollado en el Laboratorio de Biotecnología Vegetal del Instituto de Investigaciones en Viandas Tropicales (INIVIT) con el objetivo de incrementar el coeficiente de multiplicación en el cultivar de plátano vianda "INIVITPV-2011" (AAB) en el Sistema de Inmersión Temporal (SIT). Se estudiaron diferentes tiempos de inmersión (10, 20 (control) y 30 minutos) y frecuencias de inmersión (3, 6 (control) y 8 horas) en frascos Nalgene de 10 L de capacidad, se estudió además el volumen de medio de cultivo por explante (20, 40 (control) y 60 ml de medio de cultivo/explante), así como el tiempo de subcultivo (15, 18, 21 (control) y 25 días) y la densidad de explantes por frasco (20, 40 (control), 60 y 80 explantes/frasco de cultivo). Se utilizó el medio de cultivo de multiplicación MS suplementado 2,0 mg.L-1 de 6-BAP; 3,5 mg.L-1de AIA; 30,0 g.L-1 de sacarosa; 10,0 mg.L-1 de ácido ascórbico. Los resultados obtenidos permitieron establecer una metodología para la micropropagación en el Sistema de Inmersión Temporal del cultivar de plátano vianda "INIVITPV-2011" (AAB) la cual consistió en utilizar un tiempo de inmersión de 10 minutos con una frecuencia cada 3 horas, es decir, 8 inmersiones al día, además para cada frasco de 10 L se inocularon 60 explantes y la renovación con 3600 ml de medio de cultivo y un tiempo de cultivo de 18 días permitió alcanzar la mayor productividad del material en fase de multiplicación. Estos resultados, utilizando el Sistema de Inmersión Temporal permitieron establecer una metodología eficiente para la micropropagación del cultivar de plátano vianda "INIVITPV-2011" (AAB).

This work was developed at the Plant Biotechnology Laboratory from the Research Institute of Tropical Root and Tuber Crops (INIVIT) in order to increase the multiplication coefficient in plantain cultivar "INIVITPV-2011" (AAB) in Temporary Immersion Systems (TIS). Different immersion times (10, 20 (control) and 30 minutes) and immersion frequencies (3, 6 (control) and 8 hours) in 10 L Nalgene flasks, and culture medium volume per explants (20, 40 (control) and 60 ml culture medium / explants) were studied, as well as, subculture time (15, 18, 21(control) and 25 days) and explants density per flask (20, 40 (control), 60 and 80 explants / culture flask). The multiplication culture medium MS supplemented with 2.0 mg.L-1 6-BAP, 3.5 mg.L-1 IAA, 30.0 gL-1 sucrose, 10.0 mg.L-1 ascorbic acid was used. Results obtained allowed to establish a methodology for micro-propagation of plantain cultivar "INIVITPV-2011" (AAB) in temporary immersion system, which consisted of using a 10 minute immersion time with 3 hour frequency (8 immersions per day). Besides, 60 explants were inoculated in each 10 L flask, and the renewal with 3600 ml culture medium and 18 day culture time allowed to obtain the highest productivity in the multiplication stage. These results, using the temporary immersion system allowed to establish a method for micro-propagation of plantain cultivar "INIVITPV-2011" (AAB).

Evaluation of cellulolytic enzymes produced by native fungi through solid state fermentation (SSF) using sugarcane harvesting residues

Los residuos agrícolas de cosecha de caña de azúcar (RAC), se constituyen en una materia prima alternativa para la producción de etanol carburante, dado su contenido de celulosa próximo al 40%. El aprovechamiento de la celulosa depende de la aplicación de tratamientos fisicoquímicos o bioquímicos, que permitan la liberación de la glucosa y su posterior utilización en procesos fermentativos. La hidrólisis enzimática de estos residuos requiere un complejo celulolítico producido por microorganismos, comprendido por tres actividades enzimáticas: Endoglucanasas, Exoglucanasas y β-Glucosidasas. En el presente estudio, se evaluaron las enzimas celulolíticas producidas por dos hongos nativos del género Aspergillus spp., CH 2016 y CH 2001, mediante procesos de fermentación en estado sólido utilizando como sustrato RAC pre-tratados con organosolventes (deslignificado) y sin este pre-tratamiento. La cepa CH 2016 presentó la mayor actividad endoglucanasa 11,0773 U/mL en el sustrato sin pre-tratar el día siete de fermentación; esta misma cepa, en el sustrato deslignificado presentó la mayor actividad exoglucanasa (0,042 U/mL) y celulasa total (0,287 UPF/mL) en el día cinco de fermentación. La cepa CH 2001 presentó la mayor actividad β-glucosidasa (0,1778 U/mL) en el sustrato sin pre-tratar el día cinco de fermentación. Se observó que las variables sustrato y tiempo de fermentación, inciden en la expresión de las enzimas celulolíticas obteniendo en este trabajo extractos enzimáticos que pueden llevar a cabo una acción hidrolítica sinérgica sobre la celulosa.

Sugarcane harvesting residues are considered as a raw material for fuel ethanol production due its high content of cellulose, around 40% DS. The use of cellulose depends of the application of physicochemical or biochemical treatments that allow the release of glucose and its subsequent uses in fermentation processes. The enzymatic hydrolysis of these residues requires a cellulolytic complex produced by microorganisms, including three enzymatic activities: Endoglucanases, β-Glucosidases and Exoglucanases. In the present study, cellulolytic enzymes produced by two native fungi Aspergillus spp., CH 2016 and CH 2001 was assessment, through of solid-state fermentation processes using as raw substrate RAC and pre-treated with organosolvents (delignified). Strain CH 2016 had the highest endoglucanase activity 11.0773 U/mL in the raw substrate on day seven of fermentation, the same strain, in the delignified substrate showed the highest activity exoglucanasa (0.042 U/mL ) and total cellulase (0.287 UPF/mL) on day five of fermentation. Strain CH 2001 got the highest β-glucosidase activity (0.1778 U/mL) in the substrate without pre-treatment on day 5 of fermentation. It was observed that the variables as substrate and fermentation time affected the expression of cellulolytic enzymes.

Importance of strain and concentration range of conidia in the effect of Trichoderma asperellum on the growth of tomato seedlings Solanum lycopersicum L.

El crecimiento longitudinal de tallos y raíces fue investigado en plántulas de tomate (Solanum lycopersicum L), luego de la aplicación de cuatro aislamientos de Trichoderma asperellum: T25, T46, T84 y T109. Sólo la aplicación del aislamiento T109 causó un incremento significativo (p ≤ 0,05) del crecimiento longitudinal de tallos y raíces. El peso seco de las plántulas también fue estimulado desde la primera semana luego de la aplicación de T109. El crecimiento fue estimulado significativamente (p ≤ 0,05) por la aplicación de 10(5) y 10(6) conidias/ml, pero no lo fue por la aplicación de 10(4), 10(7) y 10(8) conidias/ml. Estos resultados indican que el estímulo del crecimiento producido por T. asperellum en plántulas de tomate, sólo ocurre con aislamientos particulares y un rangos de concentración específicos.

Longitudinal growth of shoot and roots was investigated in tomato seedlings (Solanum lycopersicum L) after application of four isolates of T. asperellum (T25, T46, T84 y T109). Only the isolate T109 caused a significant (p ≤ 0.05) increase of longitudinal growth of roots and shoots, and dry weight of seedlings was also stimulated from the first week after T109 application. The growth was significantly (p ≤ 0.05) stimulated by 10(5) and 10(6) conidia/ml, but it was not by 10(4), 10(7) and 10(8) conidia/ml. These results indicate that growth stimulus caused by T. asperellum in tomato seedlings, occurs only with specific isolates and at a specific concentration ranges.

In vitro inhibition from native isolates of Trichoderma against commercial strain T22.

El objetivo de este trabajo fue evaluar 14 aislamientos nativos del género Trichoderma (Tn) obtenidos de la rizósfera del cultivo de caña de azúcar de acuerdo con su efecto de inhibición in vitro en cultivos duales contra la cepa comercial de Trichoderma harzianum (T22). Los aislamientos nativos con mayor índice de inhibición fueron los denominados Palma (T12) y Hubero (T11), con un valor de 2, mientras que T01, T04, T05 y T08 presentaron un valor de 1. Además, el mayor porcentaje de inhibición fue causado por el aislamiento T03, con una media de 92.32 ± 2.64%, sin diferencias estadísticas con los nativos T07, con un valor inhibición de 88.99 ± 1.46%, T01 87.93 ± 2.28%, y T12; 87.71 ± 3.16. En este caso, los aislamientos T07 y T12 mostraron capacidad inhibitoria con mayores atributos para su selección como agentes de control biológico. Al evaluar la tolerancia in vitro de los aislamientos nativos de Trichoderma a la actividad del agua (a w), se observó efecto significativo sobre el desarrollo micelial de los aislamientos de Trichoderma nativo evaluados. Los aislamientos T03 (7919.3 ± 932.53) y T12 (6388.2 ± 623.40) presentaron el mejor desarrollo radial. Estos resultados sugieren que los aislamientos T03 y T12 podrían desarrollarse mejor bajo condiciones de estrés hídrico. Por lo anterior, concluimos que los aislamientos T07 y T12, son los mejores candidatos como agentes inhibidores y se sugiere evaluarlos in vitro o invernadero contra el agente causal de la enfermedad del muermo rojo en caña de azúcar (Colletotrichum falcatum).

The objective of this work was to evaluate 14 native e Trichoderma genus isolates (Tn) obtained from the rhyzosphere of sugarcane plantations in accordance with their inhibitory in vitro effect on dual cultures against a commercial strain of Trichoderma harzianum (T22 strain). The native isolates with the highest inhibition levels were the named Palma (T12) and Hubero (T11), with a type value 2, although the T01, T04, T05 and T08 presented activity type 1. The highest percentage of inhibition of the strain T22 was caused by the isolate T03 (average of 92.32 ± 2.64%), with no statistical difference (P >0.05) from the natives isolates T07 (inhibition average of the 88.99 ± 1.46%), T01 (average 87.93 ± 2.28%), and T12 (average 87.71 ± 3.16%). In this case, T07 and T12 isolates showed inhibitory capacity in more attributes for selection as biological control agents. In assessing tolerance in vitro native isolates of Trichoderma to water activity (a w), we observed significant effect on mycelia growth of native Trichoderma isolates evaluated. In addition, isolates T03 (average 7919.3 ± 932.53) and T12 (average 6388.2 ± 623.40) had the best radial development. These results suggest that the isolates T03 and T12 could develop better under water stress conditions. Therefore, we conclude that the isolates T07 and T12 are the best candidates as inhibitory agents and we suggest evaluating under in vitro condition or in greenhouse against with the causal agent of the red rot disease from the sugarcane (Colletotrichum falcatum).

Characterization of Opuntia ficus-indica for using as a natural coagulant

Actualmente municipios de la Costa Atlántica Colombiana no cuentan con suministro de agua potable. La aplicación artesanal de la Tuna (Opuntia ficus-indica) como coagulante es una práctica tradicional en comunidades rurales. En esta investigación se realiza la caracterización del tallo de la Tuna que crece de manera silvestre en el departamento de Bolívar, y del polvo extraído de esta planta, con el fin de identificar componentes asociados a su poder coagulante para la remoción de turbidez y de color en aguas crudas. Las pencas de la planta se sometieron a operaciones de corte, pelado, secado, molienda, tamizado y despigmentado para obtener el coagulante. El rendimiento del proceso global fue de 65g de coagulante/Kg de material vegetal. Los resultados indicaron que la penca contiene alto porcentaje de humedad y pequeñas proporciones de saponinas, flavonoides, sales minerales de calcio y hierro; lo cual permitió concluir que estos metabolitos y sales no son los responsables de su poder coagulante debido a las cantidades poco significativas en las que se encuentran. Se consideró que otras especies química tales como el ácido poligalacturónico y compuestos algínicos son realmente los que le confieran la cualidad al biomaterial. También, se evaluó el poder coagulante del material extraído, se analizó el efecto de tres dosis sobre el color, la turbidez y el pH del agua tratada. Los resultados indicaron que tiene la capacidad de remover 50% del color y 70% de turbidez de aguas crudas con alta turbidez inicial, y que no altera significativamente su pH.

Currently, municipalities in the Colombian Atlantic Coast do not have potable water supply. The implementation of the Tuna as a coagulant is a traditional practice in rural communities, but is used in craft way. In the present investigation, the characterization of the stalk of Tuna (Opuntia ficus-indica) growing in the wild in the Bolivar department, and of the powder extracted from this plant was realized with the purpose to identify components associated with its coagulant power to remove color and turbidity in raw water. The stalks of this plant were subjected to cutting, peeling, drying, grinding, sieving and depigment for obtaining the coagulant. The overall process yield was 65g of coagulant/kg of vegetal material. The results also indicated that the stalk of Tuna contains high moisture content and low amounts of saponins, flavonoids, minerals, calcium and iron. It allowed concluding that these metabolites and salts are not responsible of the coagulant power of plant due to the insignificant amounts in which they are present. Therefore, it is presumed that other chemical species such as polygalacturonic acid and alginic compounds are those that confer the quality to the biomaterial. Also, the coagulant power of extracted material was evaluated. The effect of three dosis on the color, turbidity and pH of trated water was analized. The results indicated that it has the capacity to remove 50% of color and 70% of turbity from crude water with high initial turbidity. Also, it does not affect significantly its pH.

Detection of Ca Liberibacter solanacearum and phytoplasma in potato crop (Solanum tuberosum L.) in Toluca Valley

En México y Centro América se han detectado tubérculos de papa con manchado interno. Recientemente en Texas EUA a esta enfermedad se le ha denominado "Zebra Chip" (ZC) o rayado de la papa, los síntomas foliares se asemejan al síndrome denominado "Punta Morada de la Papa" (PMP) o enfermedad del "amarillamiento por psilidos" la cual es asociada con la presencia de "Candidatus Liberibacter solanacearum". El objetivo de esta investigación fue detectar la presencia de esta bacteria y de fitoplasmas en plantas de papa que presentaban la coloración purpura de los foliolos. Durante el ciclo primavera - verano 2011 y 2012 se hizo un muestreo en los municipios de Tenango del Valle, Zinacantepec, Villa de Allende y San José del Rincón, del Estado de México. La detección de ambos patógenos se realizó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con los iniciadores específicos para fitoplasmas: P1/P7, R16mF2/R16mR1 y para Ca Liberibacter solanacearum: OA2/Oi2c, resultando el 35,8% de las plantas positivas para fitoplasmas y el 11,6% para la bacteria. Los resultados indican que en algunas regiones productoras de papa del Estado de México, los dos presuntos agentes causales del síndrome de PMP, fitoplasmas y Ca. Liberibacter solanacearum, pueden estar asociados.

In Mexico and Central America have been detected stained potato tubers with internal browning; recently in Texas, USA, this disease has been called "Zebra Chip" (ZC) or striped potato, foliar symptoms resemble the syndrome called "Potato Purple Top" (PPT) or "psyllid yellows" disease which is associated with the presence of "Candidatus Liberibacter solanacearum". The aim of the current work was to detect the presence of this bacterium and phytoplasma in potato plants with purple top symptoms. During 2011 and 2012 Spring - Summer cycle, a directed sampling was carried out in Tenango del Valle, Zinacantepec, Villa de Allende and San José del Rincón, State of México. The detection of both pathogens was performed by Polymerase Chain Reaction (PCR) with specific primers for phytoplasmas: P1/ P7, R16mF2/R16mR1 and for Ca Liberacter solanacearum: OA2/Oi2c, being 35,8 % from the positive plants for phytoplasmas and 11,6 % for this bacterium. These results indicated that in some areas these two PPT syndrome suspected causative agents, phytoplasmas and Ca. Liberibacter solanacearum, could be associated in the State of Mexico potato-producing region.

Evaluation of the stability of Trichoderma sp. and Azotobacter sp. preserved by different methods

En el Laboratorio de Microbiología Aplicada de la Universidad Francisco de Paula Santander (Cúcuta, Colombia) constantemente ingresan al Banco de Cepas, cultivos microbianos de interés biotecnológico, especialmente del sector agrícola, los cuales son utilizados en las actividades de docencia e investigación. Por esta razón, existe el interés de mantener viables a través del tiempo estos cultivos microbianos, para lo cual se realizó en esta investigación, la evaluación de la estabilidad de los aislados de Trichoderma sp. y Azotobacter sp., utilizando las técnicas de conservación en viales con solución salina estéril (0,85% NaCl) en refrigeración (4°C) y temperatura ambiente (30°C), suelo estéril en refrigeración (4°C), comparados con la metodología de repiques sucesivos como tratamiento control. Los resultados no mostraron diferencias significativas según el Test de Duncan (Pd"0,05) en la tasa de supervivencia microbiana entre los métodos de conservación. Sin embargo, se observó en las técnicas de viales con solución salina estéril y suelo estéril mantenidos en refrigeración, mayor estabilidad en la concentración celular durante los cuatros meses de evaluación, sin registrar contaminación en los cultivos. Así mismo, se registró un óptimo crecimiento macroscópico de los cultivos microbianos y sus características microscópicas se mantuvieron estables en estos dos métodos de conservación. Por esta razón, se seleccionaron como técnicas de conservación de estos microorganismos, teniendo en cuenta además, ventajas como la facilidad de la técnica, disponibilidad de equipos, materiales y personal con los que se cuenta en el laboratorio.

In the Laboratory of Applied Microbiology of the University Francisco de Paula Santander (Cúcuta, Colombia), strains of microbial cultures of biotechnological interest are constantly entering, particularly from the agricultural sector, which are used for teaching and research activities. There is an interest in keeping them viable over time, which was the main reason of this research: To evaluate the stability of the isolates of Trichoderma sp. and Azotobacter sp., using different conservation techniques: vials with saline solution (0,85% NaCl) in two temperature conditions: refrigeration (4°C) and room temperature (30°C), sterile soil under refrigeration (4°C), and successive peals methodology as the control treatment. Results showed no significant differences according to Duncan test (P d" 0.05) in the microbial survival ratio between preservation methods. However, a greater stability in cell concentration was observed with the techniques of vials with sterile saline solution and sterile soil -both under refrigeration-, during the four-month evaluation, with no register of contamination on cultures. Also, there was an optimum growth of microbial cultures macroscopically and the microscopic characteristics were stable in these two methods of preservation for both strains. For this reason, we suggest these conservation techniques for the two microorganisms, considering further advantages such as ease of technology, availability of equipment, materials and personnel available in the laboratory.

Growth and biochemical composition of Limnothrix sp. at different salinities and concentrations of nitrate

Se evalúo el efecto de la salinidad (15, 25 y 35 UPS) y concentración de nitrato (4, 8 y 16 mmoles L-1) sobre el crecimiento y composición bioquímica de la cianobacteria Limnothrix sp. (LAEP- 52) con miras a su explotación para fines biotecnológicos. La cianobacteria se cultivó durante 20 días a 25°C, 98 µmol m-2s-1, fotoperiodo 12:12 y aireación continua (200 mL min-1). El crecimiento fue evaluado cada 48 horas a través de la medición de la densidad óptica a 730 nm. Se evidenció que la salinidad y la concentración de nitrato modulan el crecimiento y la composición bioquímica de Limnothrix sp. El mayor crecimiento (6.3 ± 0.38 mg mL-1), contenidos de proteínas (57 ± 4.56 %), ficocianina (170.3 ± 13.6 µg mL-1) y clorofila a (16 ± 1.28 µg mL-1) se obtuvieron a la menor salinidad (15 UPS) y mayor concentración de nitrato (16 mmoles L-1). Por el contrario, las mayores concentraciones de lípidos (21.3± 1.19 %), carbohidratos (14.47 ± 1.15 %) y carotenoides (6 ± 0.48 µg mL-1) se lograron en la mayor salinidad (35 UPS) y menor concentración de nitrato (4 mmoles L-1). La producción de exopolisacáridos sólo fue influenciada por la salinidad, llegando a alcanzar sus mayores valores a 35 UPS (1600 ± 112.25 mg L-1). Los contenidos de proteínas, lípidos, carbohidratos y pigmentos obtenidos en esta cianobacteria permiten catalogarla como un organismo que puede ser usado en las industrias biotecnológicas, ya sea como alimento para organismos cultivados o como fuente de metabolitos de interés industrial.

In this research we evaluate the effect of salinity (15, 25 and 35 UPS) and nitrate concentration (4, 8 and 16 mmoles L-1) on growth and biochemical composition of the cyanobacterium Limnothrix sp. (LAEP-52) with a view to exploitation for biotechnological purposes. The cyanobacterium was grown in volumes of 1 L for 20 days. The culture conditions included 25 °C, irradiance of 98 µmol m-2 s-1, photoperiod 12:12 and continuous aeration (200 mL min-1). Growth was evaluated every 48 hours through the measurement of optical density at 730 nm. It showed that salinity and concentration of nitrate modulate the growth and biochemical composition of Limnothrix sp. The highest values of growth (6.3 ± 0.38 mg mL-1), protein content (57 ± 4.56%), phycocyanin (170.3 ± 13.6 mg mL-1) and chlorophyll a (16 ± 1.28 mg mL-1) were obtained at the lowest salinity (15 UPS) and highest levels of nitrate (16 mmolesL-1). By contrast, higher concentrations of lipids (21.3 ± 1.19%), carbohydrate (14.47 ± 1.15%) and carotenoids (6 ± 0.48 mg mL-1) were achieved in the highest salinity (35 UPS) and the lowest concentrations of nitrate (4 mmoles L-1). The production of exopolysaccharides was only influenced by salinity, reaching its highest values at 35 UPS (1600 ± 112.25 mg L-1). The content of proteins, lipids, carbohydrates and pigments obtained in this cyanobacterium allow cataloged as an organism which can be used in biotechnology industries, either as feed for farmed organisms or as a source of metabolites of industrial interest.

Mannitol and silver nitrate effect of taro (Xanthosoma spp.) in vitro conservation

El mantenimiento en campo de los Bancos de Germoplasma resulta muy costoso, además de los riesgos a que se exponen. El cultivo de tejidos constituye una solución a estos problemas siendo conveniente utilizar una combinación de técnicas de almacenamiento en los cultivos de propagación vegetativa para no depender de una sola. El cultivo in vitro ofrece nuevas alternativas para el mejoramiento de la productividad y la producción de material de siembra sano en malanga (Xanthosoma spp.). La presente investigación se desarrolló en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Instituto de Investigaciones de Viandas Tropicales (INIVIT), Cuba, con el objetivo de estudiar las condiciones para la conservación en crecimiento mínimo in vitro de germoplasma de esta especie. Como material vegetal se utilizó el clon de Malanga Xanthosoma "INIVIT MX-2008". El establecimiento del material vegetal y su posterior multiplicación fueron realizadas según la metodología recomendada por García et al. (1999). Para la conservación en medio de cultivo de crecimiento mínimo se utilizó el medio basal MS y se estudiaron 15 tratamientos que combinaron concentraciones de Manitol (regulador osmótico) (1,5; 3 y 4%) y Nitrato de plata (inhibidor de la acción etileno) (0, 2, 4, 8, 10 mg.L-1). Se concluye que es posible conservar in vitro los recursos genéticos de malanga Xanthosoma durante más de 10 meses, en un medio de cultivo compuesto por sales y vitaminas MS suplementado con 4% de manitol y 4 mg.L-1 de Nitrato de plata. Las plantas propagadas a partir de este medio de cultivo se recuperaron exitosamente. La mayor concentración de manitol en el medio de cultivo pudo haber influido en la mejor recuperación del material conservado.

Maintenance field genebanks are costly, in addition to the risks they face; to that effect on tissue culture is a solution to these problems. In vegetative propagated crops is desirable to use a combination of storage technology rather than relying on just one. in vitro culture provides an alternative for improving productivity and production of healthy planting material of taro (Xanthosoma spp.). This research was conducted in the Tissue Culture Laboratory of the Research Institute of Tropical Crops. Our objective was study the conditions for minimal growth conservation in vitro germplasm in this species. As plant material was used clone of Taro Xanthosoma 'INIVIT MX-2008'. The establishment of the plant material and its subsequent multiplication were carried out according to the methodology recommended by García et al. (1999). For the maintenance in culture of minimal growth basal medium MS was used and studied 15 treatments with combined concentrations of mannitol (osmotic regulator) (1.5, 3 and 4%) and silver nitrate (Ethylene inhibitor) (0, 2, 4, 8, 10 mg.L-1). It concludes that it is possible to conserve taro Xanthosoma genetic resources in vitro, for over 10 months in a culture medium composed of MS salts and vitamins and supplemented with 4% mannitol and 4 mg.L-1 of silver nitrate. Plants propagated from this culture medium were recovered successfully. The presence of higher concentrations of mannitol, may have influenced that increases survival of preserved material. O3

Comparison of DNA extraction methods from formalin-fixed paraffin sections for RCP amplification

Los tejidos fijados en formol e incluidos en parafina son una fuente de material para hallazgos moleculares en el ámbito clínico y científico, demostrándose que el ADN extraído de éstos, es adecuado para amplificación a través de la reacción en cadena de la polimerasa (RCP). En este estudio, se ensayaron tres métodos de extracción de ADN en tejidos incluidos en parafina, con el objetivo de comparar la eficiencia de estos para obtener ADN adecuado, además se analizó su utilidad en amplificación por RCP. Se emplearon tres muestras, correspondientes a una biopsia de pulmón, legrado endometrial y ganglio linfático, todas fijadas en formaldehido al 10% e incluidas en parafina. Utilizándose tres métodos diferentes de extracción de ADN (extracción por salting out, método modificado de Sambrook y kit comercial) El ADN obtenido se cuantificó por espectrofotometría, además se realizó electroforesis en gel de agarosa al 1%, para comprobar si el ADN era de buena calidad y se realizó RCP para el exón 3 del gen caveolina 1. Todos los métodos dieron como resultado una buen producto de ADN genómico, observándose mayor cantidad y pureza en los métodos de salting out y kit comercial, asimismo se obtuvo amplificación del producto esperado por estos dos métodos, no hubo buenos resultados con el ADN extraído por el método modificado "Preparation of Genomic DNA from Mouse Tails y Other Small samples, según Sambrook". El ADN obtenido a partir de tejidos FFIP puede ser amplificado por varios métodos, entre estos, la extracción por salting out es útil y con poca toxicidad, permite obtener ADN de buena calidad para amplificación por RCP.

Formalin-fixed and paraffin-embedded tissues are a source of important molecular findings in clinical and scientific, demonstrating that the DNA extracted from these is suitable for amplification by polymerase chain reaction (PCR). In this study, we tested three methods of DNA extraction, in order to compare the efficiency of these DNA for RCP amplification. Three samples were used, corresponding to a lung biopsy, endometrial curettage and lymph node, all fixed in 10% formaldehyde and embedded in paraffin. Three different methods were used for DNA extraction (extraction by salting out, modified Sambrook method and commercial kit) The DNA obtained was analyzed by spectrophotometry, and gel electrophoresis was performed in 1% agarose to check if the DNA was amplifiable. PCR was performed for exon 3 of caveolin-1 gene. All methods resulted in a good product of genomic DNA, obtaining more quality and purity in the salting out and commercial kit methods. Also, we obtained amplification of the product by these two methods, without favorable results with the DNA extracted by the modified "Preparation of Genomic DNA from Mouse Tails and Other Small samples, according to Sambrook et al." The DNA obtained from FFPE can be amplified by several methods, among them, salting out extraction is an easy, effective and low toxicity for obtaining good quality DNA for PCR amplification.

Endospore formation in Clostridium and its interaction with solventogenesis

La solventogénesis y la esporulación son mecanismos de las células de Clostridium para resistir ambientes hostiles. Este segundo proceso ha sido estudiado utilizando como modelo lo que sucede con Bacillus, aunque se reconocen diferencias marcadas entre los dos géneros especialmente en el inicio, específicamente en los eventos por medio de los que se da la fosforilación del regulador maestro Spo0A. En la actualidad se ha avalado la teoría que afirma que tres histidin quinasas huérfanas, diferentes a las proteínas Spo0B (histidin quinasa) y Spo0F(fosfotransferasa) en Bacillus, son las encargadas de fosforilar en Clostridium de forma directa a Spo0A, que posteriormente activa la transcripción de diferentes factores sigma relacionados, de forma similar en los dos géneros bacterianos. La proteína Spo0A, perteneciente a la familia de reguladores de respuesta, se comporta como una entidad regulatoria global que tiene injerencia sobre los procesos de formación de esporas y solventes, modulando genes necesarios para que se produzcan acetona y butanol, además de genes de esporulación. El entendimiento de este proceso ha llevado a los investigadores a emplear diferentes técnicas moleculares que permitan incrementar la producción de solventes, así como eliminar la propiedad de las células de producir endosporas. Por tal razón, este escrito presenta un resumen de estas dos redes de expresión de genes, conectadas por el regulador maestro Spo0A.

Solventogenesis and sporulation are mechanisms used by Clostridium cells to resist hostile environments. Sporulation has been studied using as a model what happens with Bacillus, but marked differences were recognized, particularly in the events that led the phosphorylation of the master controller Spo0A. Currently, a theory that claims that three orphan histidine kinases, different from Spo0B (histidin kinase) and spo0F (phosphotransferase) proteins in Bacillus, phosphorilate directly Spo0A in Clostridium activating transcription of different sigma factors which are similar in the two bacterial genera, has been supported. Spo0A protein, which belongs to the family of response regulators, behaves as an entity that has global regulatory interference on the processes of spore formation and solvents, modulating genes necessary to produce acetone and butanol. The understanding of this process has led researchers to employ different molecular techniques that increase the production of solvents, and remove the property of the cells to produce endospores. Reason why, this paper presents an updated summary of these two gene expression networks, connected by the master regulator spo0A.

Somatic embryogenesis of Citrus macrophylla Wester using Pectimorf® and analogues of brassinosteroids

Los cítricos son frutales muy utilizados como patrones de injerto. Para incrementar la cantidad de estos cultivos en las plantaciones citrícolas, se pueden usar técnicas de propagación in vitro como la embriogénesis somática, que requiere medios de cultivos artificiales y fitohormonas. Debido a los altos costos de las fitohormonas, una alternativa cubana es el uso de biorreguladores del crecimiento de producción nacional como: los análogos de brasinoesteroides: 25(R) 2± , 3± , dihidroxi 5± espirostan- 6-ona (Biobras-6) y C: 25(R) 2± , 3± , 5± , trihidroxiespirostan-6-ona (MH-5) y una mezcla de oligogalacturónido de grado de polimerización entre 10-14 (Pectimorf®). Estos biorreguladores son efectivos en los procesos morfogenéticos como sustitutos o complemento de las auxinas y citoquininas. El presente trabajo estuvo dirigido a determinar el efecto del Pectimorf® y los brasinoesteroides como sustitutos de las fitohormonas tradicionales en el desarrollo de la embriogénesis somática y en la obtención de una línea celular embriogénica de Citrus macrophylla Wester. Se utilizó el medio de cultivo de Murashige y Skoog (MS) (1962), suplementado con los biorreguladores del crecimiento MH-5, Biobras-6 y Pectimorf®. Mediante la embriogénesis somática se obtuvieron embriones, raíces y plántulas, en todos los tratamientos. En la formación de plántulas estos biorreguladores fueron muy efectivos.

Citrus fruits are widely used as rootstock. To increase the amount of these crops in plantations, in vitro propagation techniques such as somatic embryogenesis can be used, which requires artificial culture media and plant hormones. Due to the high cost of the plant hormone, a Cuban alternative is the use of cuban bioregulators growth as the analogs of brassinosteroids, 25(R) 2± , 3± , dihidroxi 5± espirostan- 6-ona (Biobras-6) y C: 25(R) 2± , 3± , 5± , trihidroxiespirostan-6-ona (MH-5) and oligogalacturonic mixed degree polimerization between 10-14 (Pectimorf ®). These bioregulators are effective in morphogenetic processes as a substitute or complement for auxins and cytokinins. Our work was aimed to determine the effect of Pectimorf ® and brassinosteroids (MH-5 and Biobras-6) in morphogenetic development and to obtain embryogenic cell line of Citrus macrophylla Wester. We used the medium of Murashige and Skoog (MS) (1962), supplemented with MH-5, Biobras-6 and Pectimorf ®. Embryos, roots and seedlings were obtained through somatic embryogenesis in all treatments. These products were effective in plant regeneration.

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