Revista Colombiana de Biotecnología

Evolution in molecular characterization in biological research processes

Anaerobic co-digestion of vinasse and chicken manure: alternative for Colombian agrowaste management

La digestión anaerobia es una tecnología atractiva para el manejo de residuos al producir energía en forma de biogás y estabilizar la materia orgánica. En este estudio, se evaluó el proceso de co-digestión de vinaza y gallinaza de jaula como una alternativa de manejo y estabilización de residuos generados por la agroindustria colombiana. Se llevaron a cabo, ensayos de biometanización en relaciones de mezcla vinaza y gallinaza de 1:0, 3:1, 1:3 y 0:1 en base a VS. La relación de 3:1 de vinaza y gallinaza permitió aumentar la producción específica de metano en un 55% respecto a la producción específica ponderada de 0.65 m³ CH4/kg VS. Las mezclas entre los sustratos presentaron un efecto sinérgico positivo. La gallinaza de jaula mejoró la capacidad de amortiguación de la mezcla, disminuyendo el riesgo de acidificación por cambio drástico en el pH durante la digestión de la vinaza. Por otra parte, la vinaza permitió diluir la concentración total de nitrógeno amoniacal evitando la inhibición de amoniaco. Dado el aumento de la producción de metano, el co-tratamiento de vinaza y gallinaza mejora la recuperación de energía y la viabilidad económica de la instalación de la planta de biogás como parte de la cadena de producción de etanol.

Anaerobic digestion is an attractive technology for waste management meanwhile energy is recovering. This study evaluated the feasibility of codigesting vinasse and chicken manure (CM) as management alternative for Colombian agro industries. Biochemical methane potential was tested for different vinasse to CM ratios of 1:0, 3:1, 1:3 and 0:1 on VS basis. Vinasse and CM ratio of 3:1 increased the specific methane production up to 55% regard to the weighted specific methane production of 0.65 m³CH4/kg VS. Mixtures between the substrates had a positive synergistic effect. CM improved buffer capacity diminishing the risk on acidification by drastic pH shift during vinasse digestion. Furthermore, vinasse allowed dilution of total ammonia nitrogen concentration avoiding ammonia inhibition. Since a higher methane production, vinasse and CM co-treatment improves the energy-recovery and economic feasibility of installing biogas plant as part of the ethanol production chain.

**Formulation prototype based on Rhodotorula mucilaginosa for the control of Botrytis cinerea in Roses**

Los sistemas productivos de Rosas de corte para exportación poseen retos importantes debido a la presencia de diversos agentes fitopatógenos, siendo Botrytis cinerea uno de los más relevantes debido a su persistencia y número de hospederos alternativos. Los mercados internacionales son muy exigentes en el manejo ambientalmente sostenible de los cultivos, por lo que se ha hecho presión para la implementación de estrategias de control biológico de enfermedades. La levadura filosferica Rhodotorula mucilaginosa (Lv20) con potencial biocontrolador contra B. cinérea, fue empleada en este estudio con el objeto de generar un prototipo de formulación en base sólida con el fin de lograr una estabilidad de la actividad y viabilidad celular a través del tiempo. El empleo de mezclas de polímeros sintéticos y de origen natural permitió mantener la viabilidad de esta cepa durante 90 días a unos niveles de 1,90x10(9) células.mL-1 a una temperatura de 25°C en una formulación líquida. Así mismo, el prototipo de formulación, empleando manitol como agente nucleador en una formulación sólida de tipo granulada, logró una viabilidad celular de 1.2x10(8) células.gr-1 a los 90 días de almacenamiento a 4°C, logrando mantener una actividad biocontroladora igual a la cepa fresca sin formular o recién formulada. Estos resultados obtenidos permiten sugerir que los prototipos de formulación empleando como principio activo la levadura R. mucilaginosa, son una alternativa promisoria para el control de B. cinerea en la post cosecha de rosas variedad véndela.

Productive systems of cut roses for exportation, have important challenges due to the presence of various plant pathogens in such crops. Botrytis cinerea is one of the most important pathogen microorganism because of its persistence and number of alternative hosts plants. International markets are very demanding in terms of environmentally sustainable crop management, which has forced for the implementation of strategies for biological control of diseases. The phyllosphere yeast Rhodotorula mucilaginous (Lv20) with biocontrol potential against B. cinerea, was employed in this study in order to generate a solid prototype formulation to achieve both, the stability of its activity and cell viability over time. The use of the mix of synthetic and naturally occurring polymers allowed to maintain the viability of this strain for 90 days at 1,90x10(9) células.mL-1 at a 25 ° C in a liquid formulation. Likewise, the prototype formulation using mannitol as a nucleating agent in a granular solid formulation, allowed obtaining a cell viability of 1.2x10(8) células.gr-1 after 90 days of storage at 4 °C, maintaining a biocontrol activity equal to the fresh strain with or without formulation. These results allow us to suggest that the formulation prototypes using R. mucilaginous yeast, is a promising alternative for the control of B. cinerea in post-harvest management of roses.

Real Time PCR: a useful methodology for detection and quantitation of granulovirus

El uso de baculovirus como agentes de control biológico de insectos plaga, se ha convertido en una estrategia efectiva que se ha implementado gradualmente en diferentes sistemas productivos a nivel mundial. Para el desarrollo de un bioplaguicida a base de baculovirus, es necesario contar con una metodología para determinar el título viral en el producto en proceso y terminado. Para tal fin, en este trabajo se diseñó y optimizó una técnica de cuantificación viral (Betabaculovirus) mediante PCR cuantitativo (q-PCR). Se utilizó una sonda TaqMan diseñada sobre el gen de granulina, altamente conservado. Para la técnica de q-PCR se determinó la especificidad, sensibilidad y reproducibilidad, encontrando que puede detectar y cuantificar aislamientos del género Betabaculovirus provenientes de cinco especies diferentes de insectos (granulovirus de Tecia solanivora, Phthorimaea operculella,Erinnyis ello, Tuta absoluta y Spodoptera frugiperda) incluso de diferente origen geográfico, pero no detecta aislamientos del género Alphabaculovirus (nucleopoliedrovirus de Spodoptera ornithogalli, Diatraea saccharalis o S. frugiperda). El límite mínimo de detección de la técnica fue de 6,4 x 10-4 ng de ADN, lo que equivale a 1,25 x 10(5) copias del gen. Así mismo, la variación intra e inter ensayos fue mínima, demostrando la reproducibilidad de la misma. La aplicabilidad de la técnica fue evaluada para la detección de granulovirus en muestras de larva, suelo, y para determinar la concentración viral en un bioplaguicida formulado como concentrado emulsionable. En conclusión, la técnica de q-PCR desarrollada fue reproducible, sensible y específica, con aplicabilidad en estudios de persistencia viral en campo, control de infecciones en crías de insectos y control de calidad de bioplaguicidas a base de betabaculovirus.

The use of baculovirus as a biocontrol agent is an effective strategy, which has been gradually implemented in different production systems worldwide. For the development of a biopesticide based on baculovirus, it is necessary to have a methodology to determine the viral concentration in the process and in the finished product. In this study, a technique for viral quantification by quantitative PCR (q-PCR) was designed and optimized; therefore we used a TaqMan probe designed on granulin gene which is highly conserved. The specificity, sensitivity and reproducibility of the technique were determined. The q-PCR was able to detect and quantify isolates from the genus Betabaculovirus from five different insects species (granulovirus from Tecia solanivora, Phthorimaea operculella, Erinnys ello, Tuta absoluta and Spodoptera frugiperda) even from different geographic origins, while other isolates of baculovirus as from the genus Alphabaculovirus (nucleopolyhedrovirus from Spodoptera ornithogalli, Diatraea saccharallis or S. frugiperda) were not detected. The minimum detection limit of the technique was 6.4 x 10-4 ng /µl of DNA, equivalent to 1.25 x 10³ gene copies. Additionally, intra- and inter-assays variation was minimal, demonstrating the reproducibility of technique. The applicability of the technique was evaluated for detecting granulovirus from samples of larva and soil, and to determine the virus concentration in the biopesticide formulated as emulsifiable concentrate. In conclusion, quantitative PCR was a technique reproducible, sensitive and specific to allow viral persistence studies in field, viral infection control in rearing and quality control of a biopesticide based on betabaculovirus.

Preservation methods for actinobacterias with phosphate solubilizing activity

El objetivo de esta investigación fue evaluar diferentes métodos de conservación para actinobacterias solubilizadoras de fósforo debido a la poca información de métodos específicos reportados para estos microorganismos. Los métodos de conservación se evaluaron a 3 diferentes periodos de tiempo; largo, mediano y corto plazo, usando métodos de congelación y liofilización; arcilla, sílica, arena y transferencia periódica, respectivamente. Para ello se usaron 15 aislamientos de 3 localidades diferentes (La Vega, Maní y Tota) y un banco de referencia de la Unidad de Investigaciones Agropecuarias de la Pontificia Universidad Javeriana. Se prepararon todos los inóculos en solución salina al 0,85% (p/v) y se ajustaron a una concentración de 10(8) cel/mL, seguido a ello se inocularon los viales de cada método de conservación con sus respectivos crioprotectantes, glicerol 20% (v/v), 30% (v/v) para congelación y skim milk 18% (p/v) para liofilización. Los métodos a mediano plazo se ejecutaron de igual manera, el inóculo se agregó a 10 perlas de arcilla, 10 g de arena y 5 g de sílica, posteriormente se almacenaron a 4 °C. El método de corto plazo se evaluó en agar avena (15 g/L). La evaluación se realizó mediante recuento directo en cámara de Neubauer por la técnica de azul de tripán, además de la caracterización macroscópica y microscópica de cada aislamiento en transferencia periódica. Se estableció que la actividad solubilizadora de fósforo se mantuvo más estable en los métodos de glicerol 30 % (p/v) y liofilización según el análisis estadístico.

The aim of this research was to evaluate different methods of preservation for actinobacteria with phosphate solubilization activity due to there are a few specific methods reported for these organisms. The methods were evaluated at three different time periods; long, medium and short-term and employing methods as cryopreservation and dry-freezing; clay, silica and sand; and periodically plating, respectively. Therefore 15 isolates from 3 different locations (La Vega, Maní and Tota) and a bank reference from Livestock Research Unit of the Pontificia Universidad Javeriana were used. All inocula were prepared in 0.85% saline solution (w/v) which were adjusted to a concentration of 10(8) cells/mL, followed each vial was inoculated with their respective storage cryoprotectants , glycerol 20% (v/v), 30% (v/v) to freeze and 18% skim milk (w/v) for dry-freezing. Medium-term methods were performed similarly; the inoculum was added to 10 clay beads, 10 g of sand and 5 g of silica and then stored at 4 °C. The short-term method was evaluated in oatmeal agar (15 g/L). The evaluation was performed by direct counting in a Neubauer chamberusing trypan blue staining technique, in addition to macroscopic and microscopic characterization of each isolate in periodic plating. It was established that the phosphorus solubilizing activity was more stable in glycerol 30% (w/v) and lyophilization for statistical analysis.

**Quantification of diazotrophs bacteria isolated from cocoa soils (Theobroma cacao L.), by the technique of Most Probable Number (MPN)**

Esta investigación tuvo como objetivo cuantificar bacterias diazótrofas y comparar fisicoquímicamente suelos rizosféricos de tres cacaotales (Theobroma cacao L.) del Departamento Norte de Santander, Colombia; para lo cual se caracterizaron, diferenciándose en área cultivada, manejo agronómico y edad del cultivo. A partir de diluciones seriadas de las muestras y empleando la técnica de Número Más Probable (NMP), en medios de cultivo semiselectivos (NFb, JMV, LGI, JNFb) semisólidos, se cuantificaron las diazótrofas, evaluando como positivo la formación de una película subsuperficial en el medio contenido en viales sellados; muestras pares se enviaron al laboratorio Bioambiental (UNET) para los análisis fisicoquímicos. Como resultado, las muestras evaluadas mostraron deficiencias en el porcentaje de materia orgánica y elementos como Potasio, Fósforo y Magnesio. Se reportaron estadísticamente diferencias altamente significativas en NMP. La mayor cuantificación de diazótrofas se reportó en la finca Florilandia, que se caracterizó por tener riego por goteo. La mayor cuantificación de diazotrófas se registró en los medios NFb y JMV, demostrándose una mayor presencia de los presuntos géneros Azospirillum sp. y Burkholderia sp. los cuales son fácilmente aislados de suelos rizosféricos, a diferencia de los géneros Herbaspirillum sp. y Gluconacetobacter sp. que por su carácter endófito suelen ser menos predominantes en este tipo de muestras. Se concluye además, que las características fisicoquímicas del suelo, la humedad y las relaciones climáticas al momento de la toma de las muestras, condicionan la cantidad de exudados de las raíces y por tanto son factores que condicionaron la presencia de diazótrofas en las muestras.

The objective of this research was to quantify diazotrophic bacteria and compare physicochemically rhizospheric soils of three cocoa plantations (Theobroma cacao L.) in Norte de Santander Department, Colombia; for which they were characterized, differing in cultivated area, agronomic management and crop age. From serial dilutions of the samples and using the technique of Most Probable Number (MPN), In semisolid culture media (NFb, JMV, LGI, JNFb), the diazotrophs were quantified, evaluating as positive the formation of a subsurface film in the medium contained in sealed vials; equal samples were sent to the Bioambiental laboratory (UNET) for physicochemical analyzes. As a result, the evaluated samples showed deficiencies in the percentage of organic matter and elements such as Potassium, Phosphorus and Magnesium. Statistically highly significant differences in MPN were reported. The highest quantification of diazotrophs was reported in the Florilandia farm, which was characterized by drip irrigation. The highest quantification of diazotrophs was recorded in the media NFb and JMV, demonstrating a greater presence of the presumed genera Azospirillum sp. and Burkholderia sp. which are easily isolated from rhizospheric soils, unlike the genera Herbaspirillum sp. and Gluconacetobacter sp. which by their endophytic character tend to be less predominant in this type of samples. It is also concluded that the physicochemical characteristics of the soil, humidity and climatic relationships at the moment of sampling, condition the amount of root exudates and therefore are factors that conditioned the presence of diazotrophs in the samples.

Cloning, expression and characterization of a novel esterase derived from colombian agricultural soils metagenomes

El presente trabajo tuvo como objetivo la bioprospección de ADN metagenómico derivado de comunidades microbianas asociadas a un agroecosistema de importancia nacional. Este análisis permitió realizar la producción, expresión, purificación y caracterización de una enzima novedosa con actividad esterasa. Esta enzima, denominada LipM, había sido previamente identificada en clones metagenómicos derivados de suelos dedicados al cultivo de papa criolla (Solanum pureja), mediante secuencia de nueva generación y análisis bioinformáticos. La secuencia codificante de la enzima fue clonada en el vector pBADgiii y expresada en E. coli como sistema de expresión, lo que permitió optimizar el proceso de producción recombinante y su posterior purificación. Funcionalmente la enzima presentó una mayor afinidad por sustratos de p-nitrofenil con ácidos grasos de cadena corta (The present work had as a main objective to bioprospect metagenomic DNA from microbial communities associated with an agro-ecosystem of national importance. This analysis allowed the production, expression, purification and characterization of a novel enzyme with esterase activity. This enzyme, named here as LipM, was previously identified in metagenomic clones derived from soils dedicated to creole potato (Solanum pureja) crops by means of next-generation sequencing and bioinformatics analyses. The coding sequence of the enzyme was cloned into pBADgiii vector and expressed in E. coli as an expression system, allowing to optimize its recombinant production process and its further purification. The enzyme functionally showed a greater affinity for p-nitrophenyl substrates with short-chain fatty acids (

**First report of a begomovirus presents in yellow passionfruit [Passiflora edulis f. flavicarpa (Degene)] in Valle del Cauca, Colombia**

El maracuyá amarillo es un cultivo de importancia económica para el Valle del Cauca, pero en los últimos años ha presentado una reducción de hasta un 80% en la producción debido a problemas virales. El objetivo del presente trabajo fue detectar y caracterizar parcialmente begomovirus que podrían estar afectando los cultivos de maracuyá amarillo localizados en dos zonas productoras del Valle del Cauca (La Unión y Palmira). Se colectaron hojas de maracuyá con síntomas típicos de enfermedad viral, se purificó su DNA genómico y se detectó la presencia de begomovirus bipartitas mediante PCR empleando cebadores específicos para el componente A y B, respectivamente. Cinco fragmentos de DNA correspondientes al genoma geminiviral A y B, fueron clonados, secuenciados y analizados con herramientas bioinformáticas. Los resultados evidencian por primera vez en Colombia de la presencia de un begomovirus en maracuyá amarillo. El análisis de la secuencias de nucleótidos indica que este begomovirus está más relacionado con el virus del mosaico enano del frijol, un geminivirus que afecta frijol en Colombia, y no con el virus de la distorsión severa de la hoja de maracuyá, el cual se reportó afectando maracuyá amarillo en Brasil. A la fecha, este resultado constituiría el primer reporte de un begomovirus (perteneciente a la familia Geminiviridae) que afecta maracuyá amarillo en Colombia y que podría ser diferente de otros begomovirus previamente reportados a nivel mundial afectando este cultivo.

The yellow passion fruit is a crop of economic importance to the Valle del Cauca, but in recent years has been a reduction of up to 80% in production due to viral problems. The aim of this study was to detect and characterize partially begomovirus that could be affecting crops of yellow passionfruit located in two growing areas of the Valle del Cauca (La Union and Palmira). Passionfruit leaves with typical symptoms of viral disease were collected, purified genomic DNA and its bipartite begomovirus were detected by PCR using primers specific for component A and B, respectively. Five DNA fragments corresponding to geminiviral A and B genome were cloned, sequenced and analyzed with bioinformatics tools. The results show for the first time in Colombia the presence of a begomovirus in yellow passionfruit. The analysis of the nucleotide sequences indicates that this begomovirus is more related to bean BDMV, a geminivirus affecting beans in Colombia, not PSLDV, which was reported affecting yellow passionfruit in Brazil. To date, this result would be the first report of a begomovirus (belonging to the family Geminiviridae) affecting yellow passion fruit in Colombia, and that might be different from other begomovirus previously reported worldwide affecting this crop.

**Cassava friable embryogenic calli infection with Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam)**

Las nuevas tecnologías para la edición de genomas, como los TALEN y el sistema CRISPR/Cas9, representan una gran oportunidad para mejorar características deseables en diferentes organismos. Los TALEN son el resultado del acoplamiento de nucleasas a los TALE (Transcription Activator-Like Effectors), los cuales son efectores naturales de gran importancia en la patogénesis de las especies de Xanthomonas. Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) es el agente causal del añublo bacteriano de la yuca, quien durante el proceso patogénico es capaz de translocar sus efectores a la célula vegetal mediante el sistema de secreción tipo tres (SSTT). Actualmente no hay protocolos estándar para la edición de genomas en yuca. En este estudio se exploró la posibilidad de translocar efectores sobre callo embriogénico friable (CEF) a través de la inoculación con Xam, con el fin de determinar el potencial de este patógeno como sistema de entrega de TALEN. El CEF de dos variedades de yuca susceptibles (COL2215 y cv. 60444) se cocultivaron con la cepa Xam668 a diferentes tiempos. Posteriormente, se evaluó la expresión de marcadores correspondientes a los genes blanco conocidos para los TALE presentes en esta cepa bacteriana. Aunque no se logró demostrar la translocación de los mismos en el tejido embriogénico, sí se lograron establecer condiciones adecuadas de cocultivo con Xam y el efecto que la infección bacteriana tiene sobre la regeneración de embriones a partir de este tejido.

New technologies for genome edition, such as TALENs and CRISPR/Cas9 system, are a great opportunity to improve desirable features in different organisms. TALENs are the result from coupling nucleases and TALEs (Transcription Activator-Like Effectors), which are natural effectors with an important role in pathogenicity for the Xanthomonas species. Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) is the cassava bacterial blight causal agent, and this pathogen is able to translocate its effectors to the plant cell during pathogenesis by using the type-three secretion system (TTSS). Currently, there are no standard protocols for genome edition in cassava. In this study, we explored the possibility to translocate effectors to friable embryogenic calli (FEC) through Xam inoculation, in order to establish the potential of this pathogen as a TALEN delivery system. Friable embryogenic calli derived from two different susceptible varieties (COL2215 and cv. 60444) were co-cultured with the strain Xam668 using different culture times. Subsequently, we evaluated the expression of makers corresponding to reported target genes for TALEs present in this bacterial strain. Although we were not able to demonstrate effector translocation, we established the conditions for co-culturing cassava calli and Xam and determined the effects derived from bacterial infection on embryo regeneration from FECs.

Design and evaluation of a biosystem water treatment pilot-scale tannery through Eichhornia crassipes

Desde el punto de vista ambiental, el sector de curtiembres siempre ha sido catalogado como altamente contaminante, donde su proceso productivo del cuero a partir de un tratamiento físico-químico de pieles de animales genera contaminantes químicos como el cromo y desechos orgánicos que causan impactos ambientales negativos sobre los ecosistemas. Los ecosistemas naturales, tales como los humedales, son los sistemas más productivos en el mundo como resultado de la abundancia de luz, agua, nutrientes. Debido a esta abundancia y favorabilidad es común encontrar la presencia de plantas que han desarrollado adaptaciones morfológicas y bioquímicas permitiéndoles aprovechar al máximo las ventajas de estas condiciones de su entorno, las cuales han sido comúnmente denominadas malezas acuáticas. Entre estas malezas flotantes (macrofitas) se encuentra el Jacinto de Agua (Eichornia crassipes), el cual tiene una amplia presencia en los cuerpos húmedos de Cundinamarca (Colombia), presentan un alta capacidad invasiva desarrollando un esparcimiento elevado en estos sistemas acuáticos. Pero esta planta tiene la capacidad de transformar la materia orgánica y sobre todo acumular diferentes metales pesados en su morfología. En la presente investigación, se diseñó y construyó un biosistema de tratamiento para la remoción y retención de cromo de aguas contaminadas por los residuos del proceso de las curtiembres, siendo la Eichhornia crassipes, el agente retenedor de estos compuestos contaminantes, donde se evidencio una solución económica y tecnológicamente viable para el sector industrial.

From the environmental point of view, the sector of tanneries always has been catalogued like highly pollutant, where his productive process of the leather from a treatment leather physicist - chemist of animals generates chemical pollutants as the chrome and organic waste that cause environmental negative impacts on the ecosystems. The natural, such ecosystems as the wetlands, they are the most productive systems in the world as result of the abundance of light, water, nutrients. Due to this abundance and favorabilidad is common to find the presence of plants that have developed morphologic and biochemical adjustments allowing them to take advantage to the maximum of the advantages of these conditions of his environment, which have been named commonly aquatic undergrowths. Between these floating undergrowths (macrofitas) one finds the Water hyacinth (Eichhornia crassipes), which has a wide presence in Cundinamarca's humid bodies (Colombia); they present a high invasive capacity developing a scattering raised in these aquatic systems. But this plant has the aptitude to transform the organic matter and especially accumulate different metals weighed in his morphology. In the present investigation, a biosistema of treatment was designed and constructed for the removal and retention of chrome of waters contaminated by the residues of the process of the tanneries, being the Eichhornia crassipes, the agent retainer of these pollutant compounds, where I demonstrate an economic and technologically viable solution for the industrial sector.

Molecular, cytogenetic and anatomohistopatologic diagnostic of freemartin syndrome on females cattle in

El síndrome Freemartin es un estado de intersexualidad de muchas de las hembras bovinas provenientes de parto múltiple heterosexual (macho - hembra). Éste se origina en la vida fetal entre los 30 y 40 días de gestación producto del intercambio transplacentario de células mediante anastomosis vasculares, presentándose fenómenos de quimerismo 60XX/XY en varios tejidos, y esterilidad consecuente. En el presente trabajo se tomaron 106 muestras de sangre de terneras provenientes de parto múltiple heterosexual, se realizó extracción de ADN de leucocitos y se buscó la amplificación del gen SRY asociado al cromosoma "Y" mediante PCR y lectura en gel de agarosa. 90 terneras (84.9%) de las 106 amplificaron SRY, verificando el quimerismo 60XX/XY, y 16 terneras (15.1%) que no amplificaron el gen, libres del síndrome quimérico y por lo tanto, aptas reproductivamente. El análisis citogenético realizado mediante cultivo de linfocitos demostró la presencia del cromosoma "Y" en linfocitos de hembras positivas a SRY y la ausencia del quimerismo en hembras SRY negativas. El análisis anatómico post mortem de tractos reproductivos de hembras positivas a SRY detectó anormalidades características del síndrome tales como, clítoris hipertrofiados y atresias ductales cervicales. El análisis histopatológico de placas de gónadas de estos animales evidenció la presencia de ovotestículos. El presente estudio confirma la utilidad de las técnicas de biología molecular como herramientas diagnósticas del síndrome, para el aprovechamiento de hembras de reemplazo al servicio del hato bovino.

Freemartin syndrome is a intersexuality condition developed in many of the female calfs born from heterosexual multiple calvings (male female). This originates in the fetal development between 30 and 40 days of gestation with transplacental exchange of cells through vascular anastomosis, occurring 60XX/XY chimerism in various tissues, and consequent sterility. In this paper was took blood samples from 106 female calves born from a multiple heterosexual calving. DNA was extracted from leucocytes and searched the SRY gene amplification associated with the Y chromosome by PCR and reading in agarose gel. 90 of 106 samples (84.9%) was amplified the SRY gene, verifying the 60XX/XY chimerism, and 16 samples (15.1%) that did not amplify the gene. Cytogenetic analysis using lymphocytes cell cultures showed the presence of Y chromosome in samples positive for SRY and absence of chimerism in SRY negative samples. The postmortem analysis of female reproductive tracts of SRY positive calves, shows anatomical abnormalities such as clitoris hypertrophia and cervical atresia. Histological examination of gonads of these animals confirmed the presence of ovotestis. This study confirms the usefulness of molecular biology techniques as diagnostic tools of the syndrome, for the use of replacement females in cattle.

In silico design and functional assessment of semisynthetic genes that confer tolerance to phosphinothricin

La tolerancia a herbicidas es una de las características más usadas en los cultivos GM, con resultados positivos para los agricultores y el ambiente. El punto de partida, es el desarrollo de casetes de expresión que expresen la característica de interés, inicialmente construidos mediante técnicas de biología molecular convencionales. Actualmente, con herramientas de bioinformática y biología sintética, es posible diseñar y probar el constructo in silico, para luego contratar su síntesis. Esta aproximación, permite optimizar la expresión mediante la modificación del uso codónico. En este trabajo se diseñaron y evaluaron en Nicotiana benthamiana versiones semisintéticas de genes que confieren tolerancia al herbicida fosfinotricina. Se realizó un análisis de libertad de operación, con el fin de asegurar que los constructos diseñados no violen derechos de propiedad intelectual en Colombia. Se obtuvieron dos casetes de expresión con libertad de operación, que expresan versiones del gen bar.

Herbicide tolerance is one of the features most used in GM crops, which has shown positive results for farmers and the environment. The starting point is the development of expression cassettes that express the characteristic of interest, they are initially constructed by standard molecular biology techniques. Currently, by bioinformatics and synthetic biology tools, it is possible to design and test the construct in silico, and then hire their synthesis. This approach allows optimizing expression by modifying the codon usage. In this work there were designed and evaluated semi-synthetic versions of genes in Nicotiana benthamiana, these genes confer tolerance to the herbicide phosphinothricin. It was made an analysis of freedom to operate in order to ensure that the designed constructs not violate intellectual property in Colombia. There were obtained two expression cassettes with freedom to operate, which express versions of the bar gene.

**Strategies to reduce the apical necrosis in vitro multiplication and rooting of Pistachio**

El pistacho (Pistacia sp.) es uno de los frutales menos explotados, entre las principales causas está el elevado costo del material vegetal por las dificultades de propagación de la especie. La propagación in vitro ofrece un gran potencial para la industria de esta especie por la multiplicación a gran escala de clones seleccionados. El objetivo del presente trabajo fue controlar la necrosis apical de los brotes en la propagación in vitro del pistacho. A partir de brotes jóvenes de plantas de esta especie mantenidas en casas de cultivo, se procedió a su desinfección con hipoclorito de sodio al 1% durante diferentes tiempos. Las yemas apicales y axilares se establecieron en el medio de cultivo Murashige & Skoog (1962) modificado y enriquecido con 1 mg/L de Metatopolina. Se evaluaron diferentes tipos de frascos, número y tipo de explantes y formulaciones de medios de cultivo durante dos subcultivos de multiplicación y en el enraizamiento. El frasco de cristal de 200 ml de capacidad, la línea prolifera y el medio de cultivo DKW lograron los valores más bajo de necrosis apical. En la fase de multiplicación se presentaron valores bajo en todos los tratamientos ensayados sin diferencia estadísticas entre ellos en comparación con el enraizamiento donde la necrosis apical alcanzó valores superiores. El medio DKW y las líneas prolíferas lograron los menores valores. El medio de cultivo MS modificado, favoreció el número de segmentos enraizados y el DKW (Driver & Kuniyuki, 1984) el número de segmentos que brotaron, presentando este último menor incidencia de necrosis apical.

The pistachio (Pistacia sp.) is one of the least exploited fruit among the main causes is the high cost of plant material by the difficulties of propagation of the species. The propagation in vitro offers great potential for the industry of this species by multiplication scale of selected clones. The aim of this study was to control the apical necrosis of outbreaks in the in vitro propagation Pistachio. From young shoots of plants of this species kept in growing houses, proceeded to disinfection with sodium hypochlorite 1% for different times. The apical and axillary buds were established in the culture medium Murashige and Skoog (1962) modified and supplemented with 1 mg/L Metatopolina. Different types of bottles, number and type of explants and culture media formulations for two subcultures multiplication and rooting were evaluated. Glass flask of 200 ml capacity, and line proliferates DKW medium achieved the lowest values apical necrosis. In the multiplication phase values were low in all treatments tested no statistical difference between them compared to rooting where apical necrosis reached higher values. The average DKW and prolific lines obtained lower values. MS medium modified crop, favored the number of segments rooted and DKW (Driver and Kuniyuki, 1984) the number of segments that sprouted, the latter having lower incidence of apical necrosis.

Characterisation of Moringa oleifera's oils from different extraction methods

La Moringa oleífera es una planta que se utiliza como materia prima en diferentes industrias, como la alimentaria, farmacéutica y cosmética. Una de las partes aprovechables del árbol es la semilla debido a su contenido entre un 30 y 45 % de aceite. Sus propiedades terapéuticas potencian su uso en el tratamiento de más de 300 enfermedades. En esta investigación se caracterizó el aceite extraído de las semillas de Moringa oleífera de las variedades de origen cubano Supergenious, Plain y Nicaragua, a partir de extracciones sólido-líquido con hexano y etanol como disolventes y por el método de prensado mecánico de la variedad Nicaragua. A través de un diseño de experimento 2K se analizaron las variables relación soluto-disolvente, tiempo de extracción, y la granulometría seleccionándose las corridas con mayores valores de porcentaje de extracción. Los aceites correspondientes a la selección se caracterizaron fisicoquímica y fitoquímicamente y los valores se compararon con variedades de diferentes regiones reportadas en la literatura. Se demostró que el método de prensado es eficiente, económico y no influye en las propiedades del producto obtenido.

Moringa oleífera is a plant that is used as raw material in various industries, including those related to the field of chemistry such as food, pharmaceuticals and cosmetics. One of the usable parts of the tree is the seed because the content between 30 and 45% oil. They enhance its therapeutic use in the treatment of more than 300 diseases. In this research the oil extracted from the seeds of Moringa oleífera varieties of Cuban origin Supergenious, Plain and Nicaragua is characterized from solid-liquid extraction with hexane and ethanol as solvents and by the method of mechanical pressing of the species Nicaragua . Through a design of experiment 2K solute-solvent variable ratio, extraction time were analyzed, and the grain size selected runs with values greater percentage of oil extracted. Oils corresponding to the selection were characterized physic-chemical and phytochemically and were compared with varieties from different regions reported in the literature. It was shown that the pressing method is efficient, economical and has no influence on the product properties obtained.

**Compared anatomy of Dioscorea alata L. clone Caraqueño plants cultivated in three in vitro growth environments**

La conservación in vitro de Dioscorea alata L. clon Caraqueño es fundamental para garantizar la propagación y distribución de material de plantación sano a los productores, y disponer de un banco in vitro de un clon de gran valor agronómico y comercial en la región oriental de Cuba. Con el fin de evaluar las modificaciones anatómicas que se producen en plantas de ñame en tres condiciones de cultivo in vitro: plantas conservadas por métodos de mínimo crecimiento, plantas regeneradas y plantas en fase de multiplicación en el medio MS 75 %, se realizó un análisis de la anatomía foliar y caulinar a partir de cortes transversales de la lámina foliar y del tallo, y cortes longitudinales y transversales de microtubérculos formados durante el proceso de conservación. Las hojas de las plantas conservadas mostraron menor espesor del mesófilo y la epidermis y el área de los haces conductores del tallo también fue menor, debido al proceso de stress durante la conservación in vitro. Sin embargo, durante la recuperación del material conservado a través de la regeneración y la multiplicación in vitro se restablecieron de manera normal estos parámetros. También se evidenció que los microtubérculos formados en la conservación in vitro, poseen parénquima amilífero con abundantes gránulos de almidón, capa delgada de parénquima cortical, y haces conductores poco desarrollados, todo lo cual indica la presencia de actividad meristemática.

The in vitro conservation of Dioscorea alata L. clone Caraqueño is fundamental to guarantee the propagation and distribution of healthy plantation material to the farmers and the establishment of one in vitro bank of this clone of great agronomic and commercial value in the Oriental Region of Cuba. With the purpose of evaluating the anatomical modifications that take place in yam plants under three in vitro culture conditions: conserved plants by slow growth, regenerated plants and in plants multiplication phase in MS 75% medium, was carried out an analysis of the foliar and caulinar anatomy from transversal cuts of the foliar sheet and of the stem, and longitudinal and transversal cuts of microtubers formed during the conservation process. Smaller thickness of the mesophyll and of the epidermis in the leaves of the conserved plants were showed and the conductive sheaves area of the stem were also smaller, due to the stress process during the in vitro conservation. However during the recovery of the conserved material through the regeneration and the in vitro multiplication were reestablished to their normal state these parameters. It was also evidenced that the microtubers formed in the in vitro conservation, have reserve parenchyma with abundant starch granules, thin cortical parenchyma and conductive sheaves little developed were determined. All this characteristics indicated the presence of meristematic activity.

Main promoters used in plant genetic transformation

El conocimiento pleno de los promotores determina el éxito en la obtención de nuevos cultivares de plantas a través de técnicas biotecnológicas, ya que dicha secuencia del ADN regula la transcripción de otras regiones adyacentes o cercanas, encontrándose los siguientes promotores: constitutivos, tejido-específicos o estadio-específicos, inducibles y sintéticos. En esta revisión se resume de manera precisa los conceptos, ventajas y limitaciones de los distintos tipos de promotores, con ejemplos claros de ello.

Full knowledge of promoters determines success in obtaining new plant cultivars through biotechnology techniques. This DNA sequence regulates the transcription of adjacent or nearby regions, which are mainly constitutive, tissue-specific or stage-specific, inducible and synthetic. This review summarizes the precise concepts, advantages and limitations of different types of promoters, including clear examples of them.

Update on molecular characterization for yeast of industrial interest

Las levaduras, además de ser un modelo de la investigación biomédica, tienen diversas aplicaciones en la industria alimentaria, en agricultura y la producción de etanol combustible. Dado que la calidad y la cantidad del producto dependen de la dinámica y la frecuencia de los microorganismos presentes en la fermentación, el uso de herramientas de caracterización molecular se ha incrementado y popularizado en las industrias que emplean levaduras. Estas técnicas se basan en la amplificación o análisis por enzimas de restricción de una porción del ADN genómico de levadura y se clasifican de acuerdo a su capacidad de resolución taxonómica para discriminar a nivel inter o intra-específica. La primera parte de la revisión incluye pruebas interespecíficas tales como, análisis de restricción o RFLP para las regiones ITS2, ITS1-5.8, D1 / D2 de los genes 26S ribosomal DNA. La segunda parte incluye, pruebas de uso común para caracterización nivel de cepa, tales como: la amplificación aleatoria del ADN polimórfico (RAPD), análisis cromosómico por electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), análisis de restricción del ADN mitocondrial (ADNmt- RFLP) análisis por mini / micro satélites y la huella genética de ADN por amplificación de regiones interdelta de los transposones Ty. Esta revisión describe y discute los detalles técnicos de los métodos más utilizados para la caracterización molecular de las levaduras y algunos ejemplos de sus aplicaciones en el contexto industrial.

Yeasts, besides being a model of biomedical research, have various applications in the food industry, in agriculture and the production of ethanol fuel. Since the quality and quantity of the product depend on the dynamics and frequency of microorganisms present in the fermentation, the use of molecular characterization tools has been increased and popularized in the industries that use yeast. These techniques are based on amplification or analysis by restriction enzyme of a portion of yeast genomic DNA and are classified according their ability of taxonomic resolution to discriminate at inter- or intra-specific level. The first part of this review includes interspecific tests such as, restriction analysis or RFLP for the ITS2 regions, ITS1-5.8, D1 / D2 of ribosomal DNA 26S genes. The second part includes, tests commonly used for characterization at strain level, such as random amplified DNA polymorphism (RAPD), Chromosome analysis by pulsed gel field electrophoresis (PFGE), restriction analysis of mitochondrial DNA (ADNmt- RFLP), analysis of the mini / micro satellites and DNA fingerprinting by amplifying interdelta regions of Ty transposons. This review describes and discuses technical details of the most commonly used methods for molecular characterization of yeast and some examples of their applications in the industrial context.

Activated Carbon and dark conditions in banana micropropagation Variety Nanicão

El objetivo del trabajo fue evaluar los efectos del carbón activado y las condiciones de oscuridad inicial sobre la propagación in vitro de banana (Musa spp.) variedad Nanicão. Fueron empleados 64 ápices provenientes de hijuelos de 20 - 30 cm. Los tratamientos consistieron en la combinación de dos concentraciones de carbón activado (2 y 3 g/l) y dos condiciones de oscuridad inicial (15 y 30 días). El diseño experimental utilizado fue completamente al azar con arreglo factorial 2 x 2 y cuatro repeticiones. Cada unidad experimental estuvo constituida por cuatro ápices. Las variables evaluadas fueron la tasa media de multiplicación, el porcentaje de supervivencia, oxidación, contaminación y aclimatización de plántulas. El análisis estadístico consistió en el ANAVA con un nivel de significancia del 5 %. Las medias fueron comparadas a través del test de Tukey al 5 % de probabilidad. Los resultados mostraron que la combinación de 2 g/l de carbón activado y 15 días de oscuridad inicial promovió el mayor porcentaje de supervivencia del primer subcultivo que alcanzo 57,30 %. En la fase de establecimiento el porcentaje de contaminación de los ápices de 39,06 % mientras que en el primer subcultivo de 22,39 %. La oxidación en la fase de establecimiento fue de 9,37 % y en el primer subcultivo fue de 8,85 %. Se concluye que la combinación entre la concentración de 2 g/l de carbón activado y 15 días de período de incubación inicial resulta efectiva en el aumento de la supervivencia de los ápices.

The objective of this work was to evaluate the effects of activated charcoal and the initial darkness conditions in the propagation in vitro of banana (Musa spp.) variety Nanicão. Were employed 64 apexes coming from shoots of approximately 20 to 30 cm. The treatments consisted in the combination of two concentrations of activated charcoal (2 and 3 g/l) and two initial dark conditions (15 and 30 days). The experimental design went completely randomized with 2 x 2 factorial arrangement and four replications. Each experimental unit consisted of four apexes. Statistical analysis consisted ANOVA with significance level of 5 %. The variables were the average rate of multiplication, survival percentage, oxidation, contamination and acclimatization of plantlets. Means were compared by Tukey test at 5 % of probability. The results showed significant difference in the interaction between the concentration of 2 g/l of activated charcoal and 15 days of initial darkness at the survival percentage from the first subculture which reached 57.30 %. In the establishment phase the percentage of contamination of the apexes was 39.06 % while that in the first subculture was 22.39 %. The oxidation in the establishment phase was 9.37 % and in the first subculture was 8.85 %. It is concluded the interaction between the concentration of 2 g/l of activated charcoal and 15 days of initial incubation period is effective in increasing survival.