INTRODUCCIÓN

El efecto del cambio climatico es una realidad y gases como el metano (CH₄) y dióxido de carbono (CO₂) son los principales responsables de efecto invernadero ¹. Los gases producidos por la fermentación entérica de los alimentos en el sistema digestivo de los rumiantes juega un papel importante en las emisiones de metano y C0₂ a la atmosfera.

Estas emisiones contribuyen con aproximadamente 18% del total de las emisiones antropogénicas de gases efecto invernadero (GEI), causando el calentamiento global y efectos en el cambio climático. Adicionalmente, hay un incremento en la demanda de fuentes de alimento las cuales son comúnmente utilizadas en la nutrición animal debido al incremento en la población en los países en desarrollo que se encuentran en condición de hambre ². Además, estas circunstancias han ocasionado repercusiones en el precio y accesibilidad a los ingredientes de la alimentación animal, lo que hace necesario la evaluación del uso de ingredientes alternativos para consumo animal y que no sean aptos para consumo humano ^3,4. Así mismo, algunos aditivos alimenticios e ingredientes alternativos para dietas de ganado pueden modificar las características de la fermentación ruminal al mejorar la eficiencia alimenticia y la utilización de la energía mientras se reduce la producción de metano ^5,6,7. De este modo, hay un creciente interés en el estudio de los metabolitos secundarios obtenidos de las plantas como modificadores naturales de la fermentación ruminal para reducir las emisiones de metano (por ejemplo, taninos condensados y saponinas). Sin embargo, el proceso de extracción puede ser muy costoso. Debido a esto, investigadores alrededor del mundo están considerando la inclusión de plantas que contienen estos metabolitos. Además, la mayoría de estas plantas no compiten con la alimentación humana y pueden representar una alternativa de bajo costo para la alimentación del ganado de carne, lo cual contribuirá a la reducción de las emisiones de GEI, ya sea como inhibidores de metanógenos y como supresores de la metanogenésis ^8,9,10.

Las curcubitas o calabacillas se han incorporado gradualmente en la industria alimentaria en las últimas décadas del siglo veinte ^11,12,13. Además, la calabacilla loca (CL, Cucurbita foetidissima) fue catalogada como la especie de calabaza más promisoria para su domesticación y utilización, ya que esta planta es considerada como endógena y no necesita condiciones especiales para su crecimiento ¹⁴. Sin embargo, la presencia de factores anti-nutricionales y ciertos metabolitos, como los taninos condensados (TC), excluyen su uso en la alimentación humana ¹¹. Así mismo, pocos estudios han sido dirigidos a su utilización como alimento para rumiantes. No obstante, análisis previos de la composición química de CL indican que es una buena fuente de almidón, aceites escenciales y proteína ^14,15. Debido a lo anterior, se hipotetiza que la inclusión de CL puede reducir la producción de metano en los rumiantes sin afectar las características de fermentación ruminal. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue el de evaluar la inclusión de hojas de CL como sustituto parcial o total del heno de alfalfa (HA) como fuente de forraje en dietas para ganado de carne en la producción de metano y los parámetros de fermentación ruminal in vitro.

MATERIALES Y MÉTODOS

Ingredientes y tratamientos experimentales. La calabacilla loca fue cultivada de manera silvestre y fue recolectada en caminos rurales en Durango, México. Las plantas fueron identificadas por personal del Intituto de Ecología de la Universidad Juárez del Estado de Durango. Las raíces y las frutas fueron removidas y las hojas fueron lavadas y secadas en una estufa de aire de convección forzada a 50°C for 48 h. El heno de alfalfa, maíz molido, harinolina y mexcla de minerales fueron adquiridos en una tienda local. Los tratamientos experimentales fueron formulados para cubrir los requerimientos de ganado de carne de acuerdo a la NRC ¹⁶ con 50% forraje y 50% concentrado del total de la ración. La inclusión de cinco niveles de CL fueron evaluados como sustituto del HA a 0, 25, 50, 75 y 100%, identificados como CON, CL25, CL50, CL75 y CL100, respectivamente.

Análisis químicos. Muestras de las raciones fueron sometidas a análisis químico por triplicado de acuerdo a los procedimientos de la AOAC ¹⁷. La material seca fué determinada después de registrar un peso constante en la muestra a 95°C. La proteína cruda fue analizada con el método de micro-Kjendhal, mientras que el extracto etéreo fue obtenido con una extracción soxhlet de la grasa cruda. De igual manera, la fibra detergente neutra (FDN) y la fibra detergente ácida (FDA) fueron evaluadas como lo propuso Van Soest et al ¹⁸ usando un digestor Ankom (Ankom Technology, USA). La digestibilidad in vitro de la materia seca (DIVMS) fue determinada utilizando el digestor DAISYII (ANKOM Technology, USA) de acuerdo a los procedimientos sugeridos por Ankom ¹⁹. Los análisis de TC y compuestos fenólicos totales (CFT) fueron evaluados de acuerdo a Agostini-Costa et al ²⁰.

Fermentaciones in vitro. La producción de gas in vitro fue desarrollada de acuerdo a Cornou et al ²¹, aproximadamente 1 g de muestra de cada tratamiento fue colocado en módulos de vidrio equipados con un transductor electrónico de presión (ANKOM Technology, USA). Soluciones minerales amortiguadoras fueron mezcladas en una proporción 2:1 con liquido ruminal obtenido de un novillo fistulado cruzado y alimentado con una dieta a base de heno de alfalfa. Aproximadamente 120 ml de esta solución fue colocada dentro de cada módulo, purgando con CO₂ para remover el oxígeno del espacio de cabeza; los módulos fueron colocados en una incubadora con agitación a 39°C por triplicado. La presión de gas acumulada fue registrada cada hora desde las 0 hasta las 96 h de tiempo de incubación para cada tratamiento. Adicionalmente, dos muestras de cada tratamiento fueron incubadas durante 24 h y colectadas de los módulos de vidrio y centrifugados a 1400 RFC por 5 minutos. Las muestras centrifugadas fueron colocadas en viales de borosilicato previamente preparados con ácido sulfúrico y ácido metafosfórico para evaluar nitrógeno amoniacal (N-NH₃) y ácidos grasos de cadena corta (AGCC), de acuerdo a los procedimientos propuestos por Galyean ²².

Antes de abrir los módulos para recolectar las muestras para cuantificar N-NH₃ y AGCC, se colectó 1 ml de gas del espacio de cabeza para determinar las concentraciones de metano y C0₂ de las fermentaciones usando un GOW MAC 580 GC (GOW-MAC Instrument Co, USA) con un Hayesep Q column (8 x 1/8 en SS packed 80/100 malla; Valco Instruments Co. Inc., USA). La temperatura de la columna, el detector y el inyector fueron de 40, 64 y 67°C, respectivamente, y se utilizó nitrógeno como gas acarreador.

Cálculos y análisis estadístico. La cinética de producción de gas fue calculada con los volumenes acumulados obtenidos a los diferentes tiempos. Los datos obtenidos fueron ajustados al modelo de Gompertz ⁽¹⁰⁾ mediante los procedimientos NLIN de SAS (SAS, NY, USA)

GP = A*exp[-L*(exp(-b*t))]

Donde GP es la producción total de gas acumulado (ml) al tiempo t; A representa la maxima producción de gas (ml/g); b es la tasa específica de producción de gas (ml/h); y L representa el periodo de latencia (fase lag) antes de empezar la producción de gas (h). La energía metabolizable (EM) fue calculada utilizando la ecuación empleada por Boga et al ⁽²³⁾:

EM (MJ/kg DM) = 2.2 + 0.136PG₂₄ + 0.0057PC + 0.000292EE²,

Donde PG₂₄ es la producción neta de gas a las 24 h (ml/g MS); PC y EE son proteína cruda y extracto etéreo (g/kg MS), respectivamente.

La producción de proteína microbiana (PPM) fue estimada de acuerdo a Blümmel et al ²⁴:

PPM (mg/g DM) = DIVMS - (PG₄₈*2.2),

Donde PG₄₈ es la producción neta de gas a las 48 h (ml/g DM).

Todos los datos fueron analizados con un diseño completamente al azar utilizando el procedimiento (SAS, NY, USA). El modelo usado fue: Y = µ + Ti + e, donde µ es la media general, Ti es el efecto del tratamiento y e es el término del error. La diferencia entre medias fue identificada y considerada significante con una p<0.05 usando la prueba de comparación de medias de Tukey. Adicionalmente, una prueba de contrastes de polinomios ortogonales fue utilizada para definir efectos lineales y cuadráticos de la inclusión de CL en los tratamientos experimentales.

RESULTADOS

Composición química y digestibilidad in vitro. La composición química del HA y de la CL se presentan en la Tabla 1. Los contenidos de materia orgánica (MO) y fibra detergente neutra (FDN) fueron más altos en CL que en el HA (p<0.05). De igual forma las concentraciones de TC y CFT fueron mayores en CL que en HA (p<0.05). Por otro lado, la DIVMS fue mas alta en HA que en CL (p<0.05). Los contenidos de proteína cruda y el EE fueron similares entre forrajes (p>0.05).

El Tabla 2 presenta los ingredientes, la composición química, la digstibilidad in vitro, los compuestos fenólicos y la energía metabolizable de los tratamientos experimentales. No se observaron cambios en EE, PC, DIVMS y EM debido a la inclusión de CL en los tratamientos experimentales (p>0.05). La concentración de FDN, TC, y CFT se incrementaron (p<0.05) a medida que se incrementó el nivel de CL en los tratamientos, mientras que la MO se redujo (p<0.05). Por otro lado, la lignina disminuyó cuando se incrementó la cantidad de CL en los tratamientos experimentales, presentando reducciones de 50% con la mayor cantidad de CL (p<0.05). Sin embargo, la concentración de lignina en CON (16% MS) es 138% mas alta que CL100 (6.7% MS; p<0.05). Las concentraciones de TC y CFT se encontraron en el rango de 11.8 a 20.8 (µg/mg MS) y 35.2 a 50.7 (µg/mg MS), respectivamente.

Cinética de producción de gas in vitro. En el Tabla 3 se presenta la cinética de producción de gas de los tratamientos experimentales. Los niveles más altos de CL en los tratamientos experimentales redujeron la producción de gas (p<0.05), la cual va de 334.6 a 259.5 ml/g MS con el reemplazo total de HA en CL100. Sin embargo, la tasa específica de producción de gas y el periodo de latencia no fueron afectados por la inclusión de CL (p>0.05). De igual manera, la PPM no fue afectada por la inclusión de CL en los tratamientos experimentales (p>0.05). Por otro lado, N-NH₃ se incrementó cerca de 30% con el nivel más alto de inclusión de CL en los tratamientos experimentales (p<0.05). Adicionalmente, en la Figura 1 se presenta la gráfica de la producción de gas acumulada.

Figura 1 Producción de gas acumulada de los tratamientos erxperimentales. 

Producción de gases y ácidos grasos volátiles. La producción de gas a las 24 h de fermentación no fue afectada por la inclusión de CL (p>0.05; Tabla 4). Sin embargo, las concentraciones del total de ácidos grasos de cadena corta (TAGCC) y propionato fueron diferentes entre tratamientos (p<0.05). El propionato se incrementó linealmente cerca de 42% con la mas alta inclusión de CL comparada con CON (p<0.05). Además, TAGCC aumentó linealmente con la inclusión de CL, presentando incrementos de cerca del 32% en CL75 (p<0.05). El acetato y el butirato presentaron valores similares entre tratamientos (p>0.05).

Por otro lado, PG₂₄ presentó valores similares entre tratamientos. Sin embargo, la producción de CH₄ se redujo linealmente con la inclusión gradual de CL (p<0.05). En este sentido, las reducciones observadas en CL100 comparadas con CON fueron de 39%. Adicionalmente, la relación CH₄:CO₂ disminuyó linealmente debido a la inclusión de CL (p<0.05). Por otra parte, la producción de CO₂ presentó valores similares entre tratamientos (p>0.05).

DISCUSIÓN

Las diferencias en la composición química entre la CL y HA afectaron algunas características nutricionales de los tratamientos experimentales (Tabla 2). La materia orgánica en los tratamientos experimentales disminuyó debido a un mayor contenido de cenizas en CL. Sin embargo, la fracción de lignina se redujo por efecto de la inclusión de CL, la cual puede haber afectado los complejos lignocelulósicos. Moreira et al ²⁵ observaron que los complejos lignocelulósicos limitan la disponibilidad de la superficie para la degradación microbiana al evitar su adhesión a la pared celular. Así, si la fracción de lignina es reducida, los microbios pueden adherirse libremente a los carbohidratos contenidos en la pared celular con lo cual se incrementa la degradabilidad de la MO y MS. De hecho, no hubo cambios en la DIVMS entre los tratamientos lo cual puede ser atribuido a las disminuciones en la fracción de lignina. Resultados similares fueron observados por Tufarelli et al ²⁶. Además, los incrementos en los CFT y en los TC en los tratamientos debido a la inclusión de CL no afectaron la DIVMS ya que las concentraciones de TC también son muy bajas para mostrar efectos en la digestibilidad, como lo comentó anteriormente Jones et al ²⁷. De igual forma, Costa et al ²⁸ reportaron que si hay presentes bajas concentraciones de TC, las bacterias proteolíticas pueden (después de un corto periodo de adaptación) responder mediante modificaciones en su metabolismo. Además, los valores observados de EM en los tratamientos (7.3±0.86 Mcal/kg, como EM promedio entre los tratamientos experimentales) son capaces de cubrir los requerimientos de energía neta de mantenimiento y ganacia para novillos de 300 kg de peso vivo (6.57 Mcal/kg, recomendado por la NRC ¹⁶).

Aderao et al ²⁹ observaron un efecto negativo por el alto contenido de FDN en la producción de gas debido a la reducción de la actividad microbiana. De esta manera, las reducciones en la máxima producción de gas (parámetro “A”) de los tratamientos experimentales puede ser una consecuencia de la degradación de la celulosa y hemicelulosa, la cual es una reacción que consume mucho tiempo (Tabla 2). Murillo et al ³⁰⁾ observaron que un incremento de la fibra en las dietas, aumentan el tiempo de adaptación (L) y disminuye la tasa especifica de producción de gas (b). Sin embargo, este efecto no fue observado en el presente estudio, ya que se observaron valores similares de de “L” y “b” entre los tratamientos. Por otra parte, no se observaron cambios en la PPM en los tratamientos lo que sugiere que la inclusión de CL no afectó a los micoorganismos. No obstante, un cambio en las poblaciones microbianas debido a la presencia de TC en CL no puede ser despreciado. A pesar de los TC son más propensos a unirse a las proteínas para formar complejos más estables que los formados con los micoorganismos, hay evidencia de la formación de complejos TC-protozoarios en las fermentaciones ruminales. En este sentido, Goel and Makkar ³¹ mencionan que hay dos posibles causas para incrementar la producción de nitrógeno bacteriano: a) mejorar la utilización de la urea vía captación microbiana de nitrógeno uréico reciclado al rumen en respuesta a la baja concentración de amoniaco ruminal, y b) efecto “preservación bacteriana” derivado de la reducción del número de protozoarios, lo que da como resultado una disminución en la depredación de bacterias. De esta manera, dado que el N-NH₃ aumentó, la primera aseveración puede ser rechazada y la segunda podría ser considerada (Tabla 2). Además, si los complejos TC-protozoarios estan formados, las bacterias proteolíticas podrán estar libres para adherirse y degradar proteínas, lo cual puede explicar el incremento en el N-NH₃ ruminal. Hartanto et al ³² observaron un comportamiento similar cuando suplementaron monensina y aceites escenciales en dietas para cabras, sugiriendo una reducción en el crecimiento de los protozoarios. De igual forma, Díaz-Carrasco et al ³³ observaron resultados similares con incrementos en la producción de nitrógeno bacteriano en dietas que contenían CL sobre las que no lo contenían. La Figura 1 muestra que el comportamiento asintótico para la producción de gas en los tratamientos se presenta después de las 40 h. Sin embargo, claras reducciones en la producción de gas acumulado son observadas, afectando de esta manera la producción neta.

A pesar de que la PG₂₄ no fue afectada por la inclusión de CL en los tratamientos (Tabla 4), la máxima producción de gas (A) presentó cambios (p<0.05; Tabla 3). Sin embargo, estos resultados sugieren que los efectos de la inclusión de CL pueden ser representativos después de las 48 h de tiempo de fermentación. Por otro lado, cambios sustanciales en los AGCC fueron observados a las 24 h de tiempo de fermentación (Tabla 4). Hassanat and Benchaar ³⁴ observaron un comportamiento similar con TC obtenidos de Acacia mearnsii al incrementar las proporciones molares de propionato in vitro. Mediante el incremento en la proporción molar de propionato ruminal, una de las rutas más importantes para suministrar energía en los rumiantes debe de ser mejorada. La absorción de propionato a través de la pared del rumen contribuye a la síntesis de glucosa como resultado de la ruta de la gluconeogénesis que se lleva a cabo en el hígado ^35,36. Williams and Coleman ³⁷ reportaron que el acetato y el propionato son los mayores productos de la fermentación. Sin embargo, en este trabajo de investigación, el acetato no fue afectado por la inclusión de CL. Por otro lado, el incremento en los TAGCC sugiere una mejora de la fermentación, lo cual puede ser explicado a través del incremento en la degradabilidad ruminal de la proteína debido a la formación de complejos TC-protozoarios (Tabla 4). Adicionalmente, los bajos valores en la relación A:P en los tratamientos experimentales indican que la producción de ácido acético fue menor que el ácido propiónico (Tabla 4). También, Williams y Coleman ³⁷ afirmaron que estas reducciones en la relación A:P son consistentes con una disminución en las bacterias Gram-positivas, las cuales son productoras de acetato; la relación A:P esta positivamente correlacionada con la proliferación de bacterias Gram-negativas, las cuales son productoras de propionato. Con base en lo anterior, hay un incremento en el N-NH₃ lo cual sugiere de manera indirecta un incremento en la proteína microbiana; sin embargo, los valores de la PPM obtenidos en este estudio fueron similares entre los tratamientos, por lo que esta teoría no puede ser soportada. Por otra parte, es más probable que ocurra un cambio en la proliferación de bacterias Gram positivas y negativas.

Murillo-Ortiz et al ¹⁰ observaron reducciones en la producción de metano con Eichhornia crassipes como sustituto del HA, lo cual también afectó la producción de CO₂. Estos autores atribuyen estos cambios a la presencia de TC en Eichhornia crassipes, reportando concentraciones de TC en un rango de 28 a 400 µg/mg. A pesar de las bajas concentraciones de TC presentes en este estudio, no se observaron cambios en la producción de CO_2. No obstante, basados en las observaciones hechas por Gomaa et al ⁸, estas reducciones en la producción de metano se pueden atribuir al contenido de TC en CL. Estos autores proponen dos mecanismos para reducir las emisiones de metano en los rumiantes debido a la presencia de TC: a) mediante la disminución en la digestión de la fibra se reduce la síntesis de metano obtenido del CO₂, lo que afecta la metanogénesis, o b) mediante la inhibición directa de metanogenos y/o su expresión. La producción de CO₂ no es afectada por la inclusión de CL en los tratamientos experimentales, pero el metano sí. A través de las mediciones en la relación CH₄:CO_2, algunas rutas pueden ser dilucidadas. Una reducción en el metano y un incremento en el CO₂ fueron observados, afectando así la ruta de la reducción de CO₂. Sin embargo, es constante la producción de CO₂ y una reducción en la generación de metano. Estos cambios permiten una reducción en la relación CH₄:CO₂, indicando un consumo de CO₂.

Murillo-Ortiz et al ¹⁰ observaron un comportamiento similar y sugirieron dos posibles rutas para la reducción de metano: a) la producción de metano estaba siendo afectada a través de la ruta del acetato, y b) la presencia de TC ofrece una acción inhibitoria en el crecimiento y/o expresión de los metanógenos. Por lo tanto, el incremento observado en el acetato, y basado en los mecanismos antes mencionados de reducción de la producción de metano, la vía del acetato no es posible que ocurra. Además, el acetato y el propionato se incrementaron proporcionalmente como lo representa la relación A:P. Asimismo, la capacidad de los metanógenos de producir metano a partir de la oxidación del acetato no es tan abundante en el rumen y el tiempo requerido para que ocurra la reacción es limitado ³⁷. Los resultados presentados en este estudio están de acuerdo con los reportado por Saminathan et al ³⁸, quienes observaron PPM similares y detectaron que la mayoría de los metanógenos se redujeron con la presencia de TC, pero se incrementaron algunas otras arqueas. Igualmente, Jafari et al ³⁹ observaron una reducción en los metanógenos y un incremento en las bacterias totales al sustituir HA por hojas de Carica papaya. De igual forma, Hartanto et al ³² observaron una correlación negativa entre la producción de protozoarios y la producción de metano in vitro, indicando que un aumento de la producción de CO₂ puede ser esperada mediante la reducción de las poblaciones de metanógenos, ya que no habría más microorganismos consumiéndolo. Sin embargo, estos cambios no fueron observados, lo que sugiere que es más probable que ocurra una inhibición de la metanogenésis endógena.

Como conclusión, los resultados obtenidos sugieren una reducción en la síntesis de metano endógena. La inclusión en la dieta del 75% de CL redujo 31% la producción de metano ruminal in vitro sin afectar la producción de CO₂ y los parámetros fermentativos como el acetato, butirato y la cinética de producción de gas. Por lo tanto, la inclusión de CL dentro de la ración como reemplazo parcial de fuentes de forrajes convencionales (por ejemplo, HA y heno de avena) emerge como una forma sostenible de utilizar forrajes no convencionales en las dietas de ganado bovino, la cual requiere un mínimo acondicionamiento de producción y no compite con la alimentación humana.

Conflictos de Interés

Los autores declaran que no hay conflicto de intereses con los datos publicados en este manuscrito.

Agradecimiento

Los autores desean agradecer al personal del Instituto de Ecología de la Universidad Juárez del Estado de Durango por la identificación virtual de las plantas recolectadas. Esta investigación no recibió ninguna subvención específica de agencias de financiación en los sectores público, comercial o sin fines de lucro. Sin embargo, las instituciones colaboradoras y los investigadores contribuyeron con sus instalaciones y equipos para la ejecución del presente estudio.