Introducción

Las fitoalexinas son metabolitos secundarios (actualmente conocidos como especializados) producidos por las plantas para protegerse contra patógenos, metales pesados y radiación ultravioleta; se constituyen como compuestos cruciales de los mecanismos de defensa de las plantas ^[1]. Entre las fitoalexinas liberadas por las cruciferas (Brassicaceae), la brassinina tiene un papel fundamental, no solo como respuesta defensiva, sino también en la vía biosintética de aquellas derivadas de ʟ-triptófano, dado que es un precursor importante de varias fitoalexinas, por ejemplo, ciclobrassinina, brasilexina, espirobrassinina, entre otras ^[2]. Este tipo de compuestos ha generado gran importancia por su actividad biológica frente a patógenos como Alternaria brasiccola, Botrytis cinérea, Leptosphaeria maculans, Rhizoctonia solani, entre otros ^[3], ^[4]. Recientemente, el grupo Integrado de Investigaciones en Química Bioorgánica (InQuiBio), de la Universidad Militar Nueva Granada, ha orientado sus investigaciones hacia la síntesis de análogos de fitoalexinas indólicas, utilizando 2-aminoácidos convencionales como precursores sintéticos, los cuales puedan comportarse como bioisósteros de fitoalexinas heterocíclicas para ser usados como agentes antifúngicos contra Fusarium oxysporum ^{[ 5]-[8]}. Estos antecedentes han inspirado la búsqueda de nuevas moléculas bioactivas que tengan núcleos estructurales interesantes, de los cuales ya se cuenta con un conocimiento previo sobre su potencial actividad biológica.

Dando continuidad a nuestro propósito, hemos estudiado varios grupos funcionales; buscando identificar su relevancia en la actividad biológica de las fitoalexinas. Particularmente, hemos iniciado la exploración de grupos funcionales nitrogenados, como las bases de Schiff y en especial las amidas N-alquilsustituidas, las cuales han sido identificadas como farmacóforos ^[9]-^[14]. Dada su relevancia, la síntesis de amidas se ha convertido en un tema de investigación relevante en la síntesis química, dirigido al desarrollo de moléculas biológicamente activas con potenciales actividades anticancerígenas, antibacteriales, analgésicas, antiinflamatorias y antifúngicas ^[15]-^[21]. Las metodologías tradicionales para la síntesis de amidas involucran el uso de aminas primarias y secundarias, y derivados de ácidos carboxílicos activados ^[22], por ejemplo, cloruros de acilo o anhídridos. Sin embargo, el uso de agentes de acoplamiento C-N, a partir de la activación del grupo ácido carboxílico, como la formación de ésteres activados con carbodiimidas, con EDC y DCC, la formación de cloruro de ácido con cloruro de tionilo y cloruro de oxalilo como reactivos preferidos, y CDI, cloruro de pivaloílo (PivCl), cloroformiato de isobutilo (IBCF) y anhídrido de ácido n-propanofosfónico (T3P) para la preparación de anhídridos mixtos ^[23], resulta tóxico, costoso y genera gran cantidad de residuos nocivos para el medioambiente. Algunas de estas metodologías suelen presentar dificultades debido a los tiempos largos de reacción y bajos rendimientos, y dan lugar a grandes cantidades de subproductos que conllevan procedimientos de purificación difíciles ^[24]. Por tal motivo, en los últimos años se han planteado nuevas estrategias que involucran el uso de catalizadores ácidos de Lewis o empleando catálisis básica mediante aminas ^[25]-^[27]. Por otro lado, la utilización de la irradiación por microondas (MW) ha permitido mejoras significativas en los porcentajes de rendimiento y cortos tiempos de reacción ^[28], ^[29], específicamente para la síntesis de N-acilendiaminas ^[30], ^[31], amidas monosustituidas ^[32], amidas N-heterocíclicas ^[33], entre otras.

Basándonos en los antecedentes descritos anteriormente y la estructura molecular de algunas fitoalexinas indólicas biológicamente activas, en este artículo se discute la síntesis asistida por irradiación de microondas, de amidas N-alquilsustituidas derivadas de 2-aminoácidos (i. e., L-triptófano, L-alanina, L-fenilalanina y L-tirosina); se evalúa el uso de tricloruro de aluminio (que actúa como catalizador) y el de 4-dimetilaminopiridina (con un rol como auxiliar nucleofílico). Se discuten las propuestas mecanísticas de cada método de reacción para la formación de amidas N-alquilsustituidas. Finalmente, los compuestos obtenidos fueron evaluados frente a Fusarium oxysporum en un medio suplementado; se determinó el valor del IC₅₀ de cada compuesto, demostrando su actividad antifúngica a diferentes niveles, lo cual se interpretó en razón del efecto de la amida acíclica como bioisóstero de fitoalexinas heterocíclicas.

Materiales y métodos

Resultados y discusión

Para la síntesis de amidas N-sustituidas se planteó un modelo de estudio buscando aplicar la metodología optimizada para la síntesis de enaminas previamente descrita en la literatura ^[8]. En esta etapa inicial, los 2-aminoésteres fueron obtenidos mediante la reacción entre el z-triptófano y el respectivo alcohol (MeOH, EtOH) en cloruro de trimetilsililo (TMSCl), para posteriormente adicionar trietilamina (Et₃N) y malonato de dietilo (DEM). La mezcla de reacción se calentó bajo reflujo hasta que se evidenció consumo mayoritario de los reactivos (tiempo de reacción entre 20 y 30 h). El perfil cromatográfico por CCD evidenció la presencia de múltiples bandas difíciles de separar y una banda en el origen correspondiente al aminoácido de partida. Además, el DEM fue recuperado con acetato de etilo a partir del crudo de reacción. Estos resultados permitieron concluir que el DEM es poco reactivo bajo estas condiciones y que, posiblemente, los 2-aminoésteres de alquilo derivados del L-triptófano se hidrolizaron al permanecer en una atmósfera húmeda y en tiempos prolongados de reacción, lo que permitió deducir que la metodología evaluada no era sintéticamente adecuada. Por tal motivo, fue necesario explorar otros métodos de síntesis alternativos orientados a la activación del DEM.

El uso de ácidos de Lewis se emplea para activar el grupo carbonilo de los ésteres por polarización, ya que es uno de los métodos más confiables para inducir la formación de amidas a partir de ésteres ^[36]. Por otro lado, la activación de esta clase de compuestos puede realizarse con un nucleófilo tipo amina; por ejemplo, DMAP. Este compuesto ha sido utilizado ampliamente para muchas reacciones orgánicas, como la reacción de Baylis-Hillman, la síntesis de β-lactamas monocíclicas de N-sulfonilo ^[37] y de β-cetoamidas a partir de β-cetoésteres ^[38]. Teniendo en cuenta estos antecedentes, después de obtener los 2-aminoésteres de alquilo bajo irradiación por MW, se evaluó el uso tanto de AlCl₃ como de DMAP, para lo cual se plantearon dos experimentos: en el primero, se preparó una mezcla con DEM, tolueno, AlCl₃ y ácido acético (método A), la cual se dispuso en un tubo de reacción y se irradió bajo MW a diferentes temperaturas (80, 100, 120 y 150 °C) y a diferentes tiempos de reacción. Los resultados del seguimiento de las reacciones por CCD permitieron establecer que el DEM reaccionó completamente a 150 °C durante 20 min. Después de este tiempo, la reacción se acidificó con HCl diluido, hasta pH entre 5-6, para liberar el AlCl₃ y, posteriormente, se realizó extracción con acetato de etilo (5x 10 mL). El crudo de reacción se concentró a sequedad y fue purificado por cromatografía en columna, separando el producto mayoritario; en el segundo experimento (método B), se empleó DMAP como auxiliar nucleofílico. Así, después de obtener los 2-aminoésteres de alquilo, se adicionó Et₃N para neutralizar el exceso de HCl y liberar el grupo amino y mantenerlo como base libre, y garantizando medio básico. Posteriormente, se adicionó DEM y DMAP y se irradió bajo MW a distintas temperaturas (100, 120 y 150 °C) y a diferentes tiempos de reacción. Los resultados del seguimiento de las reacciones por CCD indicaron que el DEM reaccionó completamente a 140 °C y 20 min, y se formó el mismo producto que en el método A.

A continuación, se describe la caracterización por espectroscopía del compuesto 1, el cual fue aislado y purificado tanto para el método A como para el método B. En el espectro de RMN ¹H del compuesto 1 se observaron señales que corresponden a hidrógenos aromáticos del grupo indol en la región de desplazamiento químico entre 7,00 y 7,50 ppm. A δ_H 4,93 ppm aparece una señal como multiplete que corresponde al hidrógeno del carbono quiral; la señal a campo alto como singlete a δ_H 3,63 ppm fue asignada al grupo metoxilo del éster. El fragmento etoxilo del malonato de dietilo puede verse como señales a δ_H 4,12 ppm (grupo CH₂O) y la señal triplete a δ_H 1,22 ppm del grupo CH₃. La señal tipo doblete a δ_H 7,50 ppm fue asignada al protón del grupo NH de la amida. La señal a δ_H 3,28 ppm, que aparece doblete, corresponde al CH₂ adyacente a los grupos C=O (Figura 1a). En el espectro de RMN ¹³C del compuesto 1 se pueden apreciar 18 señales, las cuales se asignan a continuación. Las señales a δ_C 172,1; 168,9 y 164,2 ppm corresponden a los grupos carbonilo, mientras que las señales a δ_C 136,2; 127,6; 122,9; 122,3; 119,7; 118,7; 111,3 y 110,1 ppm fueron asignadas a los carbonos aromáticos del grupo indol. Así mismo, se observaron dos señales para el grupo amida, i. e., el átomo de carbono directamente unido al grupo NH que resuena a δ_C 163,0 ppm y el grupo CH₂ adyacente a los dos C=O que resuena a δ_C 41.4 ppm (Figura 1b).

Figura 1 Experimentos RMN uni y bidimensionales del compuesto 1, a) RMN ¹H, b) RMN ¹³C, c) HSQC, d) HMBC. 

El experimento HSQC evidenció que la señal a δ_C 7,50 ppm no muestra ninguna correlación, lo que indica que esta señal corresponde al NH de la amida. La señal a δ_C 3,27 ppm mostró una correlación directa con la señal a δ_C 41,4 ppm, lo cual confirmó la asignación realizada al grupo CH₂ adyacente a los grupos C=O (Figura 1c). Una vez establecidas las condiciones óptimas de reacción, estas fueron empleadas en las reacciones con los restantes precursores. Los rendimientos obtenidos para el método A se presentan en color azul y para el método B en color rojo (Figura 2). Los compuestos 2-16 fueron análogamente elucidados. Sus datos espectroscópicos se reportan en la sección Materiales y métodos. Los espectros de masas de alta resolución (HRMS) de los compuestos 12, 14, 15 y 16, los cuales fueron seleccionados aleatoriamente del grupo total de compuestos para esta determinación, mostraron señales para los iones [M+Na]⁺ con errores menores que 5 ppm, lo cual confirmó la estructura propuesta para los compuestos 1-16.

Figura 2 Síntesis de amidas N-alquilsustituidas 1-16 por el método A y el método B. 

Los rendimientos de los compuestos 1-16 variaron con respecto a la metodología empleada, a pesar de que se empleó la irradiación por MW. En el método A se observa que los rendimientos son menores del 15%, mientras que para el método B se evidencia una mejora significativa (2060%). Los bajos rendimientos obtenidos por el método A pueden explicarse debido a la posible formación de un quelato entre el DEM y el centro metálico, lo que forma un complejo estable ^[39]. Es sabido que un centro metálico que se comporte como ácido de Lewis, como el AlCl₃, tiene una fuerte tendencia a los alcóxidos metálicos para formar oligómeros con "puente alcóxido" para alcanzar números de coordinación más altos. El grado de oligomerización está inversamente correlacionado con el tamaño del grupo alcóxido. Esta tendencia a formar oligómeros se mantiene después de la modificación con otros ligandos orgánicos como compuestos dicarbonílicos como acetilacetona, acetoacetato de etilo incluso, DEM. Lichtenberger y colaboradores ^[40] han reportado que, aunque DEM y otros ésteres de alquilo, derivados del ácido malónico, tienen una menor reactividad hacia los alcóxidos de aluminio a temperatura ambiente en comparación con los 2-cetoésteres, a temperaturas más altas reaccionan formando complejos estables. Dichos compuestos pueden formarse al reaccionar Al(OR)₃ (adicionado como reactivo o formado in situ) con DEM en una relación estequiométrica 1:3. Dado que en nuestras condiciones de reacción estudiadas se cuenta con presencia de grupos RO- y de un exceso de DEM, es de esperar la formación de dichos complejos, lo cual reduce significativamente el porcentaje de rendimiento de los compuestos 1-16. Por lo tanto, a partir de los resultados por este método se deduce que la eficiencia de la reacción no está dependiendo de la naturaleza estructural del aminoácido, dado que los rendimientos son similares al comparar cada uno de dichos precursores. El mecanismo de reacción se presenta en la Figura 3. La activación catalizada por el AlCl₃ del grupo carboxilato del malonato de dietilo (DEM) inicia la reacción tras la formación del quelato, lo cual hace que se incremente la electrofilicidad del grupo C=O coordinado con el aluminio y, de esta manera, permite el ataque nucleofílico del grupo NH₂ del 2-aminoéster de alquilo. Una vez ocurre este ataque, se da la formación de un intermediario catiónico, el cual cuenta con un hidrógeno ácido sobre el grupo NH₂ ⁺ que posteriormente reacciona con Et₃N, lo que da lugar a la formación del intermediario tetraédrico. Sin embargo, este intermediario no es estable y cuenta con un buen grupo saliente como el alcóxido, el cual se libera y conlleva la formación de la amida.

Figura 3 Mecanismo de reacción propuesto para la síntesis de amidas (método A). 

Para el método B, el hecho de emplear un auxiliar nucleofílico, como la DMAP, fue esencial para mejorar los rendimientos ya que, en ausencia de esta, la reacción no procedió; esto demostró una participación nucleofílica de DMAP en el avance de la reacción. Este reactivo ha sido empleado en diversas reacciones, de las cuales sobresalen las de esterificación de Steglich y la de Yamaguchi ^[41]-^[43]. En la primera, se lleva a cabo la conversión de sustratos estéticamente impedidos usando DCC (diciclohexilcarbodiimida) y el ácido carboxílico puede formar un intermedio de O-acilisourea, que ofrece una reactividad similar al anhídrido de ácido carboxílico correspondiente. El alcohol puede agregarse al ácido carboxílico activado para formar la diciclohexilurea (DHU) estable y el éster. Sin embargo, los nucleófilos fuertes, por ejemplo las aminas, reaccionan fácilmente con la O-acilisourea, lo cual se explica por el comportamiento nucleofílico del DMAP, más fuerte que el alcohol, que reacciona con la O-acilisourea dando lugar a una amida reactiva. Este intermediario tipo amida no puede formar productos secundarios intramoleculares, pero reacciona rápidamente con los nucleófilos del medio, en este caso particular, con los alcoholes. Así, DMAP actúa como un reactivo de transferencia de acilo al contar con un grupo acilo polarizado. Como el DMAP es un buen grupo saliente, permite una reacción rápida con el nucleófilo del medio. En las reacciones estudiadas en el presente estudio, DEM y DAMP reaccionan dando lugar a la formación de un intermediario similar, el cual es más reactivo que el grupo éster del DEM, permitiendo el posterior ataque nucleofílico de la amina del éster de alquilo derivado del aminoácido y la salida del DMAP para dar la formación de la amida iV-alquilsustituida. Para esta metodología se observó que, empleando el aminoácido z-alanina como precursor, los porcentajes de rendimiento fueron los más bajos (< 25%), lo cual puede ser explicado a partir de reacciones colaterales, tipo condensación de Claisen cruzada, que pueden ocurrir por desprotonación del hidrógeno sobre el carbono quiral, por medio de una base orgánica. Esto no se evidenció en los restantes aminoácidos; se entiende que dicho átomo de hidrógeno se encuentra menos expuesto al ataque de la base cuando la cadena lateral del aminoácido es un grupo más voluminoso que el grupo metilo. El mecanismo de reacción propuesto para el método B se presenta en la Figura 4. El DMAP hace un ataque nucleofílico sobre uno de los carboxilatos del DEM, formando un intermediario tetraédrico zwitteriónico que libera un grupo alcóxido para generar un catión 4-(dimetilamino)-1-(3-etoxi-3-oxopropanoil)piridinio estabilizado por resonancia. Posteriormente, se lleva a cabo el ataque nucleofílico del 2-aminoéster de alquilo sobre el grupo C=O tipo amida, formando el intermediario hemiacetalaminal. Finalmente, dadas las condiciones básicas del medio, se da la salida del fragmento DMAP y, por ende, la formación de la amida.

Figura 4 Mecanismo de reacción propuesto para la síntesis de amidas yV-alquilsustituidas (método B). 

La evaluación de la actividad antifúngica in vitro sobre F. oxysporum se realizó empleando el ensayo de medio suplementado a microescala ^[35]. Los resultados se expresaron como la concentración inhibitoria media (IC₅₀ en mM) para cada compuesto, utilizando una regresión no lineal, cuyos valores se presentan en la Tabla 1. Los valores de IC₅₀ medidos para las amidas iV-alquilsustituidas 1-16 oscilaron entre 0,40 y 29,1 mM.

Los resultados de la actividad antifúngica in vitro de las amidas N-alquilsustituidas mostraron que 2 y 10 presentaron menores valores de IC₅₀ (0,40 y 0,44 mM, respectivamente). Estos resultados permitieron establecer que, en algunos casos, el tamaño del fragmento aromático del aminoácido podría mejorar la actividad frente a F. oxysporum. Sin embargo, la actividad antifúngica se vio influenciada por la cadena lateral del aminoácido precursor, dado que los compuestos más activos presentan tanto grupo 1H-indol como 4-hidroxifenilo. Esto sugiere que la presencia de un sistema aromático y un grupo, tanto donor como aceptor de puente de hidrógeno (i. e., NH u OH), favorece la actividad antifúngica, debido a la interacción plausible con algunos objetivos bioquímicos relevantes en el metabolismo de Fusarium oxysporum, como se ha reportado previamente ^[8]. Estos resultados también pueden explicarse a favor de la presencia del grupo amida acíclica como un bioisóstero no clásico de ciertos heterocíclicos (e. g., triazol, tiazol, imidazol) y ditiocarbamatos, comúnmente presentes en fitoalexinas de crucíferas ^[44], el cual puede modular la actividad biológica como sustitutos debido al favorecimiento en el tamaño molecular, forma, distribución electrónica, polarizabilidad, lipofilicidad, polaridad, entre otros ^[45]. En este sentido, diversas investigaciones han demostrado que compuestos que contienen grupo amida han sido evaluados contra fitopatógenos fúngicos ^[46]. Wu y colaboradores ^[47] sintetizaron diferentes compuestos derivados de amida de pirazol que tienen un fragmento de hidrazona. Estos compuestos se evaluaron frente a F. oxysporum; sus porcentajes de inhibición fueron de alrededor del 40% ^[47]-^[49]. Recientemente, nuevos derivados de amidas de pirazol fueron sintetizados por Zhang y colaboradores, los cuales fueron evaluados a escala in vitro sobre F. oxysporum a una concentración de 20 mg/mL. Los resultados obtenidos mostraron que este tipo de compuestos presentaron una moderada actividad antifúngica con porcentajes de inhibición entre 20 y 60% ^[50]. Pese a que resulta necesario involucrar un espacio químico más amplio para establecer un modelo de correlación estructura-actividad que permita establecer con mayor fidelidad el efecto del grupo amida, los resultados discutidos en este manuscrito evidencian un comportamiento promisorio de este grupo funcional en derivados de 2-aminoácidos hacia un rol como toxóforo contra F. oxysporum en razón de su bioisosterismo no clásico en fitoalexinas.

Conclusiones

En el presente estudio se obtuvieron nuevas amidas N-sustituidas 1-16 empleando dos metodologías de síntesis. El uso de DMAP generó mejores porcentajes de rendimiento respecto al uso de AlCl₃ como ácido de Lewis. Los resultados de la actividad antifúngica frente a F oxysporum de las amidas N-sustituidas 1-16 permitieron establecer que la variabilidad estructural influencia la actividad, principalmente debido a la presencia de grupos 1H-indol y 4-hidroxifenilo en los ésteres de etilo de los 2-aminoácidos respectivos (i. e., compuestos 2 y 10). Lo anterior demostró el potencial de esta clase de derivados de 2-aminoácidos convencionales como bioactivos antifúngicos contra F. oxysporum debido al bioisosterismo no clásico de la amida acíclica con fragmentos heterocíclicos de fitoalexinas.