ANÁLISIS DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE GANADO BOVINO LECHERO
DEL TRÓPICO ALTO DE NARIÑO MEDIANTE MARCADORES MOLECULARES
HETERÓLOGOS DE TIPO MICROSATÉLITE

ANALYS IS OF GENETIC DIVERSITY OF DAIRY CATTLE IN THE HIGH TROPIC
OF NARIÑO BY MOLECULAR HETEROLOGOUS MICROSATELLITE MARKERS

L. G. Mejía^1*, R. A. Hernández¹, C. Y. Rosero¹, C. E. Solarte¹

¹ Grupo de Investigación "Producción y Sanidad Animal", Línea de Mejoramiento Genético,
Departamento de Zootecnia, Facultad de Ciencias Pecuarias, Universidad de Nariño.
Cll. 18 Cr. 50, Ciudadela Universitaria Torobajo, Pasto (Colombia).
* Autor para correspondencia: lizethmejia3@gmail.com

Artículo recibido: 22 de abril de 2015 . Aprobado: 17 de julio de 2015

RESUMEN

Cinco razas de ganado bovino (Bos taurus) del trópico alto de Nariño fueron caracterizadas usando once loci microsatélites. Se incluyeron las razas Holstein, Jersey, Normando, Pardo suizo y el ganado Criollo. Las frecuencias alélicas fUeron calculadas y usadas para la caracterización de las razas y el estudio de sus relaciones genéticas. La diversidad genética reflejada en el número de alelos por locus (NPA = 10) y la heterocigosidad observada (Ho = 0,7) fue alta, siendo mayor para la raza Criolla. El AMOVA, evidenció una baja diferenciación genética (FST = 0,0663) para la población total, con una pequeña diferenciación entre Criollo y Holstein (0,006), resultado que fue correspondiente con el análisis de agrupamiento bayesiano, que permitió determinar un grado de absorción del núcleo Criollo del 56% por la raza Holstein. La alta diversidad, supone procesos de adaptación a diferentes ambientes y mezcla de razas, facilitando un continuo flujo genético. Esto puede explicarse por la realización de cruces dirigidos al incremento del volumen de producción teniendo como base la raza Holstein, donde la selección intensiva puede conllevar al detrimento de la pureza del ganado criollo e incidir en su capacidad adaptativa.

Palabras clave: raza, microsatelites, variabilidad, introgresión.

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ABSTRACT

Five populations of cattle (Bos taurus) from tropical high of Narino were characterized with 11 loci microsatellites. The breeds included were Holstein, Jersey, Normande, Brown Swiss and Creole. The molecular characterization of breeds and study genetic relationships were made with Alleles frequencies. Genetic diversity as the number of alleles per locus (NPA = 10) and observed heterozygosity (Ho = 0.7) were high, being higher for the Creole breed. Analysis of molecular variance (AMOVA), showed low genetic differentiation (FST = 0.0663) for the total population, with a small difference between Creole and Holstein (0.006). This result was similar to the Bayesian clustering analysis, which identified a percentage of absorption of 56% to Creole by the Holstein breed. The high diversity assumes processes of adaptation to different environments and miscegenation, showing a continuous gene flow. The above can be explain by cross-breeding to increase the production volume on the basis of the Holstein breed. Detrimental impacts, due to the intensive selection, might this have on the creole cattle and has influence in their adaptive capacity.

Key Words: cattle breed, microsatellite, variability, introgression.

INTRODUCCIÓN

La diversidad genética se considera clave en la conservación de los recursos genéticos y constituye la base de procesos de selección y mejoramiento genético (Bejarano et al. 2012). En bovinos, la pérdida de ésta diversidad no sólo pone en riesgo la desaparición de ciertas razas, sino que además limita los progresos del mejoramiento genético futuros (Pizarro et al. 2009) reduciendo la posibilidad para hacer frente a nuevas condiciones ambientales. De manera que existe un consenso en la conservación de ciertas razas domésticas explicado por el acervo genético contenido en aquellas introducidas décadas atrás y que cumplen un proceso de adaptación en su ecosistema (Barker 2001).

En Colombia la diversidad genética se representa en una amplia variedad de razas de origen Europeo (Bos taurus taurus) introducidas por los españoles desde el siglo XV. De éstas, el ganado criollo adquirió características adaptativas de gran importancia como la resistencia al estrés en climas tropicales, además de ser más eficiente en el uso de sus recursos (Barrera et al. 2006).

En los últimos treinta años, el acervo genético del ganado bovino criollo ha disminuido por efecto de la selección artificial de cruzamientos dirigidos con fines productivos, hecho que conlleva a la perdida de rasgos adaptativos propios de esta raza (Bejarano et al. 2012). De ahí que el conocimiento del estado actual de esa diversidad es relevante para el mejoramiento genético sustentable y para fomentar estrategias de conservación genética, con el objeto de mantener la máxima heterocigosidad con el mínimo incremento posible de consanguinidad por generación (Alves 2007).

En este contexto, la FAO (Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura) propone un programa integrado para el manejo global de los recursos genéticos de ganado utilizando marcadores moleculares de ADN altamente polimórficos: los microsatélites o short-sequence repeat tandem (SSRT) (González 2003). En respuesta a éste propósito diversas investigaciones se ha realizado en poblaciones de bovinos priorizando los esquemas de conservación (Piñero 2008).

En América, el análisis genético de estas poblaciones ha sido llevado a cabo por diversos autores, quienes han utilizado loci microsatélites para la caracterización genética. Entre los estudios relevantes se puede mencionar el de Quiroz (2007), para establecer relaciones de parentesco entre bovinos criollos mexicanos y otras razas. Los resultados con 27 loci SSRT evidencian una estructura genética común con diferencias en regiones geográficas, producto de la introgresión de otras razas sin pérdida de identidad genética.

Zamorano et al. (1998), usando ocho SSRT caracterizaron poblaciones de bovino criollo argentino encontrando alta diversidad genética. De otro lado, el estudio realizado por Aquino et al. (2008) en Perú, reporta con cinco SSRT baja diferenciación genética entre poblaciones como resultado del origen común del bovino criollo peruano y el proceso tradicional de la selección para cruzamientos.

En Brasil, el uso de 10 SSRT en poblaciones de la raza criolla Pe-Duro, evidenció alta diversidad genética, desviaciones en los valores de equilibrio Hardy-Weinberg y valores de F_IS significativos, sugiriendo la práctica de cruces endogámicos que resulta en altos niveles de genotipos homocigotos (Ferreira 2008).

En Colombia, Moreno et al. (2001) usaron cinco SSRT con el fin de establecer relaciones filogenéticas en razas criollas y Cebú. Los autores encontraron un posible mestizaje entre las razas Cebú y Casanareño por la ausencia de núcleos de animales considerados como puros.

Más recientemente, Bejarano et al. (2012) determinaron la diversidad genética de la raza Romosinuano con doce marcadores microsatélites encontrando: índices de fijación en genotipos homocigotos y déficit de heterocigotos, alta diversidad genética total y valores moderados de homocigosidad dentro de las poblaciones de estudio. Los autores concluyen la necesidad del manejo del flujo genético con el propósito de reducir los valores de consanguinidad (Bejarano et al. 2012).

En este contexto, el presente estudio enfatiza la necesidad de caracterizar la diversidad genética de las razas de la especie Bos taurus del trópico alto de Nariño con el fin de incorporarlas a los programas de conservación, selección y mejora genética. Se podrán realizar asociaciones con caracteres de producción, entre ellos calidad de la leche, longevidad y fertilidad (Egito et al. 2007).

En esta investigación, se propone estimar la diversidad genética intra e inter núcleos raciales Holstein, Normando, Pardo Suizo, Jersey y Criollo del trópico alto de Nariño, estableciendo el grado de absorción de la raza Criolla en la región.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestra y localización

Para la caracterización molecular de los cinco núcleos de las razas Holstein, Normando, Pardo Suizo, Jersey y Criollo se tomaron aleatoriamente 30 ejemplares de cada raza, distribuidos en los distritos lecheros de Pasto, Pupiales y Guachucal del departamento de Nariño (Colombia), para un total de 150 individuos.

El tamaño de la muestra se estimó de acuerdo con lo indicado por Chakraborty (1992), sobre la base de la frecuencia mínima alélica.

Toma de muestras

Se tomaron 5 ml de sangre de cada individuo mediante punción en la vena coccígea, que fueron almacenados en tubos Vacutainer® con EDTA como anticoagulante. Las muestras se transportaron en nevera con hielo seco hasta el laboratorio de Mejoramiento Genético Animal de la Universidad de Nariño, donde se almacenaron a una temperatura promedio de 4°C hasta realizar la extracción de ADN. Adicionalmente, se tomaron muestras de una parte de tejido sanguíneo en tarjetas FTA®, para ello, se impregnó rápida y cuidadosamente el fluido en uno de los pozos de la tarjeta a partir de la aguja estéril. Las muestras se dejaron secar a temperatura ambiente en un lugar aséptico, para evitar contaminación, luego se envolvieron en papel aluminio y se conservaron en el laboratorio.

Extracción de ADN

La obtención de ADN se realizó mediante el método Salting Out descrito por Sambrook y Rusell (2001) con modificaciones implementadas en el Laboratorio de Mejoramiento Genético Animal. La cuantificación de ADN se llevó a cabo en un espectrofotómetro (Jenway, Génova), por medio de la relación de absorbancia a 260 nm y 280 nm y además por comparación visual con una muestra control de concentraciones conocidas y equivalentes a 100 ng/pl y 10 ng/ pl (Biorad). La extracción de ADN a partir de muestras de sangre conservadas en tarjetas FTA, se realizó usando el kit FTA® de Whatman Bioscience. El ADN contenido en cuatro discos de 1.2mL fue obtenido por calentamiento a 95°C durante 30 minutos, en 30 pl de agua ultrapura libre de nucleasas.

PCR loci microsatélites

De acuerdo a lo recomendado por la Sociedad Internacional de Genética Animal (ISAG), fueron seleccionados 11 microsatélites para ser analizados usando el Kit Stockmarks for Cattle Bovine Genotyping (Applied Biosystems, División Perkin-Elmer, Foster City, CA), descritos en la Tabla 1.

En la Tabla 2, se presentan las condiciones utilizadas para la reacción multiplex de amplificación de los 11 loci microsatélites. Cada reacción de 15 pL, incluyó 1 pL de ADN molde en concentración de 50 ng.

La reacción de amplificación se llevó a cabo en el termociclador Mycler de Biorad^TM, usando una fase de denaturalización inicial de 15 min a 95°C, seguido por 31 ciclos de 45'' a 94°C, 45'' a 61°C y 1 min a 72°C para la hibridización. Una extensión final fue programada a 72°C por 1 h y luego a 25°C por 2 h.

Los productos amplificados fueron visualizados en geles de agarosa al 2% y posteriormente identificados por detección de fluorescencia, mediante electroforesis capilar en secuenciador automático ABI^TM 3500 del Instituto de Genética de la Universidad Nacional de Colombia, usando el Dye Set DS-32 (Filter Set F): fluorocromos 5-FAM, JOE, NED y el GeneScan-500 ROX Size Standard (Applied Biosystems). Los datos de genotipificación fueron colectados y analizados en el programa Gene Mapper versión 4.1.5.

Análisis estadístico

A partir de los datos de genotipificación se realizó la revisión de posibles patrones de corrida electroforética (stuttering), amplificación predominante de alelos pequeños (dropout) y detección de alelos nulos, mediante el programa Microchecker v.2.2.3 (Oosterhout et al. 2004). Posteriormente, se estimaron las frecuencias alélicas y los parámetros de diversidad de locus tales como el número promedio de alelos por locus (Na), el numero efectivo de alelos por locus (Ne) y la diversidad genética de Nei (H) para todos los marcadores microsatélites en todas las razas, usando el software GenAIEx versión 6.1 (Peakall et al. 2006) y el índice de información polimórfica (PIC) con el programa Cervus v.3.0. (Marshall et al. 1998). El cálculo de los estimadores de heterocigosidad observada (Ho) y esperada (He), así como los estadísticos F de Wright F_Is (coeficiente de endogamia) y F_ST (Diferenciación genética) se realizó con el programa FSTAT v.2.9.3 (Goudet 2002), incluyendo el cálculo de R_ST (Slatkin 1991).

La desviación de los sistemas microsatélites con respecto al equilibrio Hardy-Weinberg (H-W) para cada locus y para cada población se calculó mediante el programa Arlequín versión 3.01 (Excoffier et al. 2005) usando el método de Cadenas de Markov para 10,000 permutaciones (Guo et al. 1992).

La estimación de la estructura genética se realizó por Análisis de Varianza Molecular-AMOVA ejecutando 10.000 permutaciones con el programa Arlequín versión 2005 (Excoffier et al. 2005). Con la información de la distancia genética según Nei (1973), obtenida por el mismo paquete estadístico, se construyó un dendrograma por agrupamiento UPGMA modificado del método NEIGHBOR de PHYLIP Versión 3.5 y empleando el programa POPGEN versión 1.32 (Yeh et al. 1999).

Basado en los genotipos de los 11 microsatélites, los individuos fueron agrupados en un determinado número de poblaciones y asignados probabilísticamente a grupos inferidos por la metodología Bayesiana implementada en el programa Structure v 2.23 (Falush et al. 2007). Los ensayos fueron realizados con base en el modelo de miscigenación (Admixture model) donde las frecuencias alélicas fueron correlacionadas. Para determinar el número apropiado de poblaciones, fueron realizados varios análisis con k (número de poblaciones inferidas) variando de 1 a 5 y 100,000 iteraciones con 10 repeticiones independientes para cada uno de los análisis. Los valores reales de K fueron obtenidos a partir de la magnitud de AK, valor en función de K según lo propuesto por Evanno et al. (2005) y obtenido en el programa Structure Harvester website (Earl et al. 2012). Finalmente, a partir del coeficiente Q, coeficiente de membresía, obtenido del método de agrupamiento del programa Structure v 2.2.3, se estimó el grado de absorción del núcleo criollo por la raza Holstein.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Marcadores microsatélites

La extracción de ADN genémico (Salting Out) permitió obtener concentraciones entre 30 y 1200 ng/pl. La extracción con el kit FTA resultó efectiva utilizando 1 pl de este producto en el mix de PCR.

Los 11 microsatélites evaluados resultaron altamente polimórficos en la población bovina de estudio, de acuerdo con lo esperado (isAG). Todos los loci analizados fueron informativos (PiC = 0,50) y por lo tanto útiles para detectar variabilidad genética, tal como se indica en la Tabla 3. De estos, el locus TGLA227 fue el más polimórfico con un valor de 0,873, coincidente con los estudios reportados previamente por alves (2007); Bejarano et al. (2012) y Boujenane y Ouragh (2010).

Diversidad genética

El número efectivo de alelos (Na) con un promedio por locus de 10 para el total de la población evaluada (Tabla 3) y valores promedio de heterocigosidad observada (Ho) superiores a 0,6 para cada raza en el total de loci (Tabla 4), reflejan una cantidad significativamente alta de diversidad genética en las poblaciones.

Los altos niveles de diversidad observados que apoyan investigaciones previas realizadas para bovinos (Aves 2007; Ruiz 2010; Bejarano et al. 2012) podrían explicarse por la miscegenación de razas de orígenes geográficos distintos, y que se han adaptado a condiciones ambientales propias de un país tropical. En este estudio el análisis resultante de los loci BM2113, ETH3, ETH225, TGLA226 y TGLA227 evidenció mayor diversidad genética en la raza Criolla, estimada en mayores valores de alelos por locus y heterocigosidad observada (Tabla 4).

Por lo tanto se esperaría que sea una raza donde se ejerce baja presión de selección como aislamiento geográfico y manipulación biológica (Barrera et al. 2006) con patrones de manejo tradicional, como lo observado para otras razas de bovinos en el departamento de Nariño (Solarte et al. 2011).

En las poblaciones de bovino Criollo se encontró además, el mayor número de alelos exclusivos y equivalente a 8, resultado que podría estar correlacionado con la antigüedad de la raza y su capacidad adaptativa por dispersión y colonización evidenciando la presencia de polimorfismos ancestrales, (Borgen 1997). Por su parte, la raza Normando, presentó el valor más bajo de diversidad genética (Tabla 4) posiblemente relacionado con un proceso intensivo de mejora genética (Alves 2007).

Equilibrio Hardy - Weinberg

El análisis multilocus permitió detectar desviaciones al equilibrio Hardy-Weinberg para el locus TGLA53 en las cinco razas de estudio (p < 0,05) como se evidencia en la Tabla 5, esta ausencia de equilibrio puede ser explicada por la presencia de alelos nulos en este locus según el método descrito por Brookfield (1996) y por un exceso de homocigotos (F_is = 0,43). en la especie Bos indiens resultados similares se atribuyen a la endogamia, efecto Wahlund y selección en contra de los heterocigotos (Escobar et al. 2009).

La raza Pardo Suizo presentó una desviación al equilibrio en el locus BM2113, también por un exceso de homocigotos (F_IS = 0,16). Por su parte, para la raza Normando se encontró una desviación del equilibrio para el locus INRA23, por un moderado exceso de heterocigotos (F = -0,054) y explicado además por posibles errores en la genotipificación, a la selección por sobredominancia o al cruzamiento entre las poblaciones (Egito et al. 2007).

El cálculo de F_IS, es un estadístico que toma valores entre -1 a 1; valores negativos evidencian exceso de heterocigotos y valores positivos un exceso de homocigotos. Además, valores entre 0 y 0,005 describen bajos niveles de endogamia; valores entre 0,006 y 0,15 moderados; entre 0,16 y 0,25 altos, y muy altos cuando son mayores que 0,25 (Martinez 2008). En la Tabla 5, se observan los valores de la determinación del estadístico F_IS para medir endogamia en las razas. Se observa que las razas Criollo, Holstein, Jersey y Pardo Suizo presentan valores moderados de endogamia, resultado correspondiente al encontrado en estudios previos para el trópico alto de Nariño con bovinos lecheros principalmente Holstein, donde se encontró un porcentaje de endogamia más elevado que el recomendado (Solarte 2011). Por su parte, un nivel alto de endogamia se encontró en la raza Normando, hecho que puede reflejar un manejo reproductivo más intenso con el uso de un relativo número pequeño de toros de alto valor como donadores de semen en las prácticas de reproducción asistida (Escobar et al. 2009).

Diferenciación genética y relaciones entre razas

El análisis molecular de varianza (AMOYA) reveló que el 5,26% de la variación total está atribuido a diferencias entre poblaciones y el 94,7% a la diferenciación existente entre los individuos dentro de las razas (Tabla 6).

El cálculo del índice de fijación F_ST, mostró una baja diferenciación genética entre razas y ausencia de estructura genética, equivalente a 6,63% (F _T = 0,06) de variación (resultados significativos después de la corrección de Bonferroni p < 0,05). El índice R_ST como estimador específico para marcadores microsatélites fue menor que para F_ST (R_ST = 0,057), resultado que sugiere que la moderada diferenciación entre las razas involucra principalmente las frecuencias alélicas más que las diferencias en el tamaño de los alelos debido al comportamiento mutacional de los microsatélites (Cervini et al. 2006).

Las distancias genéticas de Nei indicaron que la raza Criollo y la Holstein son las más cercanas genéticamente al presentar el menor valor de distancia y el mayor valor de identidad. Mientras que valores mayores de distancia y con la menor identidad fueron observados entre la raza Criolla y Normando (Tabla 7).

En concordancia con estos resultados, la reconstrucción filogenética del dendrograma UPGMA basado en las distancias genéticas, muestra a las razas Criolla y Hosltein cercanamente relacionadas y separadas de otros clúster (Figura 1), lo que podría sugerir un mayor indicio de introgresión de genes en estas dos razas, resultados similares a los encontrados en el departamento del Valle del Cauca (Escobar et al. 2009).

El análisis bayesiano soporta la presencia de dos poblaciones genéticas (k = 2, con un AK = 5,0), que agrupan las cinco razas de estudio en dos clúster. El diagrama muestra que ha ocurrido mezcla, resultado semejante a la agrupación UPGMA para razas (Figura 2). Así mismo, los resultados de la asignación de individuos a clúster indica una fuerte coincidencia genética entre los individuos de las razas Holstein y Criollo, con indicaciones de una introgresión de genes en ambas direcciones, mientras que los individuos de la raza Jersey presentan la menor coincidencia genética con respecto a al resto de razas.

De otra parte, existe un flujo genético entre las razas analizadas el cual se podría deber a los cruzamientos dirigidos para incrementar el volumen de leche/día, teniendo como base la Holstein. Resultados similares se explican en estudios previos realizados por el Programa de Mejoramiento Genético Animal (Solarte et al. 2009). Estas prácticas promueven el flujo genético entre regiones lo que resulta en una homogenización recurrente de las frecuencias alélicas por lo que también se evidencia una ausencia de sub-estructura genética para cada raza.

La raza Jersey por su parte, al presentar un menor grado de mezcla, refleja su introducción reciente en el trópico alto de Nariño y explica la presencia de un número mayor de hatos puros.

En cuanto a las razas Criollo y Holstein, su manejo dentro de los actuales sistemas de producción da cuenta del indicio de introgresión de genes en ambas razas (Figura 3). el grado de absorción de 56% por parte de la raza especializada Hosltein, afectaría la pureza existente de esta con una consecuente pérdida de combinaciones alélicas en diferentes loci (haplotipos) que suelen ser la base de las adaptaciones locales (amador 2013) y de características como la alta calidad de la leche que se ha hecho evidente para hatos del trópico alto de nariño (Solarte et al. 2009).

Estos análisis de agrupamiento implementados en el estudio indican la alta identidad genética entre las razas Criollo y Holstein, explicado posiblemente por un intenso flujo genético reciente o a un pasado común. Para el trópico alto de nariño, la similitud entre estas dos razas se explica en gran medida por el uso de reproductores únicos en un tiempo reciente y porque la mayoría de los ejemplares de los hatos existentes en la región, e incluidos en este estudio, sean el resultado del cruce entre ellas.

De acuerdo con los resultados obtenidos, se espera que a largo plazo el uso recurrente de cruces dirigidos al incremento de producción, influya en la pérdida de la adaptación resultado de la selección natural y la posibilidad de desarrollar razas tropicales competitivas y eficientes (Bejarano et al. 2012; Lirón et al. 2002). es por ello que algunos autores recomiendan la necesidad de restringir el uso de germoplasma importado (de razas especializadas como la Holstein) e iniciar programas de selección en las poblaciones de razas criollas bovinas.

CONCLUSIONES

Los 11 microsatélites resultaron altamente informativos para evaluar estructura poblacional.

Los grados de heterocigosidad resultaron similares a otros hatos de América Latina.

Los F_ST son indicadores de intenso flujo genético.

Se aconseja la implementación de programas de conservación tendientes a mantener la variabilidad genética observada.

REFERENCIAS

Article citation:

Mejía LG, Hernández RA, Rosero CY, Solarte CE. 2015. Análisis de la diversidad genética de ganado bovino lechero del trópico alto de Nariño mediante marcadores moleculares heterólogos de tipo microsatélite [Analysis of genetic diversity of dairy cattle in the high tropic of Nariño by molecular heterologous microsatellite markers]. Rev Med Vet Zoot. 62(3): 18-33. Doi: http://dx.doi.org/10.15446/rfmvz.v62n3.54938.