Aislamiento de bacterias nativas del cultivo de batatas (Ipomoea batatas)

Las bacterias se aislaron de muestras de suelo rizosférico hojas y tallos de diferentes zonas del Caribe Colombiano, se visitaron en total 15 fincas productoras de Batatas representativas de las zonas Valle del Sinú Montes de María, Sabanas Colinadas y Valle del Cesar (Tabla 1).

En cada finca se colectó una muestra de suelo para análisis fisicoquímico y una muestra de suelo rizosférico para análisis microbiológico. Cada muestra compuesta por cinco submuestras colectadas de forma de x. Las muestras fueron refrigeradas y transportadas al laboratorio de microbiología de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (CORPOICA), Centro de Investigación Turipaná, para su procesamiento.

Las muestras de suelo rizosférico fueron homogeneizadas y procesadas en el laboratorio. Se tomó una muestra de 10 g de suelo y se diluyó en 90 mL de NaCl estéril al 0.85%, con una agitación de 150 rpm durante 15 minutos. Se realizaron diluciones seriadas desde 10^-2hasta 10^-7, se inoculó 0,1 mL en medios de cultivo Tripticasa soya Agar (TSA)® para aislamiento de mesófilos aerobios. Segmentos de tallos y hojas fueron sembradas en medio Nfb semi-solido (^{Döbereineret al., 1995}) para aislamiento de Azospirillum, y en medio cultivo Ashby se realizó siembra de gránulos de suelo (^{Fenglerowa, 1965}) para el aislamiento de Azotobacter, las colonias que presentaron características asociadas al género fueron purificadas (Berge & Holt 1994). Los morfotipos puros fueron conservados en microtubos con medio y aceite mineral estéril (^{Carrillo et al., 1998}).

Caracterización molecular de bacterias nativas de cultivos de batatas

La caracterización molecular se realizó mediante la amplificación y secuenciación del gen rpoB. La extracción de ADN de las bacterias seleccionadas se realizó con el kit QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook (QUIAGEN, Alemania) a partir de una suspensión bacteriana cultivada en medio Luria - Bertani (LB) toda la noche. La amplificación del gen rpoB se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante, mediante el Kit PCR Master Mix (ThermoScientific), los primers utilizados en la PCR fueron rpoB1698f (5-AACATCGGTTTGATCAAC-3) y rpoB2041r (5-CGTTGCATGTTGGTACCCAT-3) (^{Dahllof et al., 2000}). La PCR se realizó en un termociclador Multigene Optimax de Labnet. El programa para la PCR fue como sigue: denaturación a 94 °C por 3 minutos seguido por 10 ciclos de denaturación a 94 °C por 1 minuto, alineación a 50°C por 1.5 minutos y extensión por 2 minutos a 72 ºC seguido por 25 ciclos de denaturación por 1 minuto a 94 ºC, alineación a 50 ºC por 1.5 minutos y extensión por 2 minutos a 72 ºC y una extensión final a 72 °C por 10 minutos.

Los productos de PCR se enviaron para su secuenciación a Macrogen - Korea. Las secuencias obtenidas se limpiaron y ensamblaron en una secuencia consenso que fue alineada con secuencias de la base de datos GenBank del NCBI mediante la herramienta BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).

Determinación de la actividad promotora de crecimiento in vitro de bacterias nativas de la rizósfera de cultivos de Batata.

Se realizaron pruebas de habilidades de promoción de crecimiento in vitro, solubilización de fósforo (^{Fiske y Subbarow, 1925}), producción de reguladores de crecimiento vegetal como índoles (^{Glickmann y Dessaux ,1995}) y fijación de nitrógeno (mediante el ensayo de reducción de acetileno) (^{Hardy et al., 1968}). Se realizó la evaluación de la compatibilidad entre bacterias (^{Shank et al., 2011}).

La determinación cuantitativa de solubilización de fósforo se realizó mediante la determinación de ortofosfatos en medio SRSM-PR modificado con roca fosfórica al 0.5% como fuente de fósforo (gl^-1: glucosa 10, extracto de levadura 0,5; NH₄(SO₄)2 0,5; KCl 0,2; MgSO₄7H₂O 0,3; MnSO₄ 7H₂O 0,004; FeSO₄7H₂O 0.2; pH: 7,2). Las muestras se incubaron por 5 días a 30 ± 2 °C a 150 rpm (^{Sánchez et al., 2012}), la medición y lectura se realizó mediante la técnica de azul de fosfomolibdeno a una absorbancia de 712 nm (^{Fiske y Subbarow, 1925}).

La producción de índoles totales se evaluó mediante el ensayo colorimétrico descrito por ^{Glickmann y Dessaux (1995)}. Para esto se empleó el medio de cultivo K-lactato suplementado con triptófano a 100 mgL^-1 (^{Sánchez et al., 2012}) incubándose los cultivos a 30 ± 2 °C durante 72 h a 150 rpm en la oscuridad. Para la lectura se empleó el reactivo de Salkowsky (FeCl₃7H₂O 12 gl^-1en H₂SO₄ 7,9M) en una relación 1:1 con la suspensión bacteriana, dejándose reaccionar durante 30 min en oscuridad. La lectura de absorbancia se realizó a 450 nm.

Para determinar la capacidad de fijación de nitrógeno se realizó el ensayo de reducción de acetileno (ARA). Los aislamientos seleccionados fueron reactivados y posteriormente cultivados en tubos de 10 mL con medio NFB semisólido, 72 horas después del cultivo se agregó a la atmósfera 1mL de acetileno y se incubó a 30 °C por 24 horas. El total de la atmosfera (6 mL) se extrajo y se almacenó en tubos vacutainer. La producción de acetileno fue medida usando un cromatógrafo de gases (Agilent Technologies 7890A) con detector de ionización de llama y columna HayeSepN 80-100 mesh. 20 ft x 1/8” x 20 mm Ultimetal (^{Hardy et al., 1968}).

Para la prueba de compatibilidad las cepas se incubaron hasta una densidad óptica de 0,5 en caldo LB, posteriormente la primera cepa se colocó en placas de LB y se cultivaron durante cinco días a 30ºC. La segunda cepa se diluyó en agar LB [1,5% (peso / vol)] que se había fundido y enfriado a una temperatura de 30°C y se vertió en placas hasta solidificación, posteriormente trozos de la segunda cepa se voltearon sobre la primera cepa. Después del crecimiento durante 24 horas a 30°C, se observaron las placas, la presencia de halos indicó incompatibilidad de las cepas (^{Shanket al., 2011}).

Evaluación de bacterias asociadas al cultivo de batata, capaces de promover el crecimiento vegetal en plántulas de batata en casa de malla.

Se realizó una evaluación bajo condiciones de casa de malla con plántulas de Ipomoea batatas de la variedad 15020063 obtenidas in vitro con el protocolo código I-PL-INV-01-01 y proporcionado por el laboratorio de biotecnología del Centro de Investigación Turipaná. Las plántulas de batata se establecieron en bandejas de 28 alveolos con muestras de suelos sin esterilizar procedentes de las zonas de aislamiento de las bacterias seleccionadas. Las plántulas fueron inoculadas con 5 mL de la suspensión bacteriana, correspondiente a una concentración celular de 1x10⁸ UFC.mL^-1 en medio nutritivo (g/L¹: glucosa 0,5; extracto de levadura 0,5; peptona 0,5; caseína 0,5; almidón 0,5; K₂HP0₄0,30; MgS0₄0,05; 17,0 pH: 7). Se realizaron dos inoculaciones a los 10 y 30 días después de la siembra. El diseño experimental fue completamente al azar con 5 repeticiones por tratamiento (3 plantas/Unidad Experimental) y se determinó un control absoluto para cada zona. Como variables respuesta se establecieron la altura de la parte aérea y radicular (cm), masa seca de la parte aérea y radicular (g) evaluadas 45 días después de crecimiento.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se llevó a cabo empleando el software SPSS 22.00 para Windows. Los datos obtenidos se procesaron mediante un análisis de varianza (ANOVA) y para discriminar entre las medias se utilizó el procedimiento de diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher con un 95% de confianza.

Aislamiento de bacterias nativas del cultivo de batatas (Ipomoea batatas)

Se aislaron 113 morfotipos bacterianos, de estos microorganismos se seleccionaron 10 morfotipos con características asociadas a los géneros Azotobacter, Azospirillum y Pseudomonas reportados como promotores de crecimiento vegetal (^{Mahendran et al., 1996}; ^{Faccini et al., 2007}; ^{Ahmad et al., 2008}; ^{Dawwam et al., 2013}; ^{Ghyselincka et al., 2013}; ^{Singh, 2013}), dos morfotipos para las zonas de los Montes de María, Sabanas Colinadas y Valle del Cesar y cuatro para el Valle del Cesar.

Caracterización molecular de bacterias nativas de cultivos de batatas.

Los microorganismos seleccionados fueron caracterizados mediante la amplificación del gen rpoB, las baterías obtenidas corresponden a Azotobacter vinelandii, Azotobacter chroococcum, Azospirillum lipoferum, Azospirillum brasilense y Pseudomonas denitrificans (Tabla 2). Las bacterias identificadas presentan riesgo biológico del grupo 1 por tanto la probabilidad de que cause enfermedad en seres humanos es baja. Se puede distribuir sin restricciones teniendo en cuenta las medidas básicas de bioseguridad (Tabla 2). Los aislados fueron considerados no patógenos de plantas porque no se presentaron en el catálogo de la Colección Nacional de bacterias patógenas de plantas del Reino Unido (Tabla 2).

Tabla 2 Caracterización molecular de bacterias con potencial como biofertilizantes aisladas de la rizósfera de batata en diferentes zonas del Caribe colombiano. 

^a Tomado del catálogo de la colección Bélgica de microorganismos http://bccm.belspo.be/catalogues/lmg-catalogue-search

^b Tomado del catálogo de la Colección Nacional de bacterias patógenas de plantas del Reino Unido.http://www.ncppb.com

Determinación de la actividad promotora de crecimiento in vitro de bacterias nativas de la rizósfera de cultivos de Batata.

En las bacterias seleccionadas se realizaron pruebas bioquímicas de habilidades de promoción de crecimiento in vitro como solubilización de fósforo y producción de índoles (Tabla 3).

Tabla 3 Determinación de actividad promotora de crecimiento vegetal de cepas bacterianas aisladas de la rizósfera de cultivos de batata en diferentes zonas del Caribe colombiano. 

Los resultados indican que todas las bacterias seleccionadas presentan actividad como promotoras de crecimiento vegetal ya que son capaces de solubilizar fósforo y producir índoles in vitro, habilidades que caracterizan a las PGPR (^{Rokhbakhsh-Zamin et al., 2011}; ^{Dawwam et al., 2013}; ^{Souza et al., 2013}; Souza et al., 2015; ^{Marques et al., 2015}).

La solubilización de fosforo, medida como la disponibilidad de ortofosfatos, se encuentra en el rango de 4 a 23 ppm, estos valores son inferiores si se compara con reportes obtenidos por ^{Park et al. (2010)} y ^{Dawwam et al. (2013)} que indican que bacterias aisladas de plantas tuberosas de los géneros Bacillus, Enterobacter y Pseudomonas, solubilizan fósforo en un rango de 100 a 290 µg.mL^-1, los géneros bacterianos Bacillus y Pseudomonas son ampliamente reportados como potenciales solubilizadores de fósforo (^{Guang-Can et al., 2008}; ^{Khan et al., 2009}; Sánchez et al., 2016).

Aunque el género Azotobacter no ha sido reportado como buen solubilizador de fósforo ^{Kumar y Narula (1999)} reportaron que cepas mutantes de Azotobacter chroococcum fueron capaces de solubilizar roca fosfórica en el rango de 0,19 - 0,22 μgmL^-1 valores inferiores a los obtenidos en esta investigación (Tabla 3). La bacteria IBVC69 (Azotobacter chroococcum) aislada del Valle del Cesar logró solubilizar la mayor cantidad de fósforo (23,34ppm). ^{Sashidhar y Podile (2009)} reportaron la capacidad de solubilización de fosforó por cepas de Azotobacter vinelandii modificadas genéticamente. En el presente estudio las cepas de Azotobacter vinelandii nativas de la rizósfera de Ipomoea batatas fueron capaces de solubilizar roca fosfórica alcanzando un valor de ortofosfatos de 20,71 ppm por la cepa IBVS13 aislada del Valle del Sinú, considerándose un reporte significativo para esta especie.

Bacterias del genero Azospirillum al igual que de Azotobacter no se consideran buenas solubilizadoras de fósforo sin embargo existen reportes en los cuales destacan la capacidad solubilizadoras de estas bacterias ^{Rodríguez et al. (2004)} reportaron por primera vez la producción de ácido glucónico y la solubilización directa de fosfato por cepas de Azospirillum brasilense, en el mismo sentido ^{Ratti et al. (2001}) entre sus resultados indican que existe una respuesta de actividad fosfatasa acida, de la bacteria Azospirillum brasilense, a la adición de fosfato tricálcico que indican la capacidad solubilizadoras de estas bacterias. En esta investigación con la cepa de Azospirillum brasilense (IBVC76) aislada del Valle del Cesar se alcanzó un valor de 19,58 ppm de ortofosfato disponible, confirmando la capacidad de solubilización de fósforo de esta cepa.

La producción de índoles por las bacterias aisladas de la rizósfera de batata en diferentes regiones del Caribe colombiano está en el rango de 7 a 138 µgmL^-1, resultados que están por encima de los reportados por ^{Yasmin, et al (2010)} de 4,97 - 46,66 µgmL^-1 y ^{Dawwam et al. (2013)} de 0,6 a 10,73 µgmL^-1en bacterias aisladas de la rizósfera de batata. La cepa con la mayor producción de índoles es la bacteria Azotobacter chroococcum (IBVC69) con 138,75 µgmL^-1, seguida de la bacteria Azotobacter vinelandii (IBVC74) con 65,60 µgmL^-1 y Azospirillum brasilense IBVC76 con 65,08 µgmL^-1 (Tabla 3) todas aisladas de la zona del Valle del Cesar. ^{Ahmad et al. (2005)} han reportado la producción de índoles para bacterias del género Azotobacter en el rango de 7,30 - 32,80 µgmL^-1, valores inferiores a los obtenidos por las bacterias de Azotobacter en esta investigación, de igual forma ^{Malhotra y Srivastava (2009)} reportan que cepas de Azospirillum brasilense producen índoles en el rango de 20 - 25 µgmL^-1 inferiores a los obtenidos en esta investigación, resultados que perfilan a las bacterias obtenidas como potenciales productoras de índoles.

Los resultados obtenidos en el ensayo de reducción de acetileno indican que las cepas Azotobacter vinelandii (IBVC74), Azospirillum brasilense (IBVC76) y Azospirillum lipoferum (IBSC7) presentan una reducción estadísticamente significativa de acetileno con respecto al control (Tabla 4), resultados que sugieren que estas bacterias presentan la capacidad de fijación de nitrógeno característica ampliamente reportada para estas especies bacterianas (^{Steenhoudt & Vanderleyden, 2000}; ^{Faccini et al., 2007}; ^{Ahmad et al., 2008}; ^{Yasmin et al., 2010}).

Evaluación de bacterias asociadas al cultivo de batata, capaces de promover el crecimiento vegetal en plántulas de Ipomea batata VAR.corpoica -15020063 en invernadero.

Los resultados del efecto de la inoculación de bacterias en los parámetros de crecimiento altura de la parte aérea y radicular (cm), masa seca de la parte aérea y radicular (g) respecto al tratamiento control en invernadero se resumen en la Tabla 5.

Los resultados indican que asociada a la rizósfera de cultivos de Ipomoea batatas en todas las zonas muestreadas se encuentran bacterias nativas capaces de promover el crecimiento vegetal en invernadero. Las bacterias Azospirillum brasilense y Azospirillum lipoferum han sido reportadas como promotoras de crecimiento vegetal en plantas tuberosas obteniendo incrementos en los parámetros de crecimiento como materia seca, longitud radical y altura (^{Mahendran et al., 1996}; ^{Farzana y Radizah, 2005}; ^{Dawwam et al., 2013}) resultados similares a los obtenidos en esta investigación para la zona de Sabanas Colinadas en donde la longitud radicular presentó un incremento significativo de 42% con la inoculación de Azospirillum lipoferum (IBSC7) (Tabla 5) y en la zona del valle del Cesar la longitud radicular se incrementó en un 17% con la bacteria Azospirillum brasilense (IBVC76) (Tabla 5).

Los resultados obtenidos con la bacteria Azotobacter chroococcum indican que para la zona de Sabanas Colinadas con la inoculación de la bacteria Azotobacter chroococcum (IBCR19) se observa un incremento estadísticamente significativo en la altura (18%), peso seco aéreo (22%) y peso radicular (17%) de plántulas de Ipomoea batatas respecto al control sin inoculación. En Valle del Cesar se logró un incremento significativo en la altura (73%), longitud radicular (51%) y peso seco de la parte aérea (35%) con la inoculación de la bacteria Azotobacter chroococcum (IBVC69) (Tabla 5), resultados similares fueron obtenidos por ^{Alarcón et al. (2008}) quienes reportaron un incremento en el rendimiento de tubérculos de batata con la inoculación de Azotobacter chroococcum.

La bacteria Azotobacter vinelandii ha sido reportada como promotora de crecimiento vegetal para diferentes tipos de cultivos como girasol (^{Shaukat et al., 2006}), tomate (^{Sánchez et al., 2012}) y trigo (^{Aly et al., 2012}), los resultados de esta investigación sugieren que esta bacteria promueve el crecimiento en Ipomea batata. Para la zona de los Montes de María con la inoculación de la bacteria Azotobacter sp. (IBCB10) se obtuvo un incremento significativo de 39% en la altura de las plántulas de batata respecto al control sin inoculación mientras que el peso seco radicular se incrementó cerca de un 10% con la inoculación de la bacteria Azotobacter vinelandii (IBCB15) (Tabla 5). Para el Valle del Cesar se alcanzó un incremento de 49% en el peso seco radicular con Azotobacter vinelandii (IBVC74) respecto al control sin inoculación (Tabla 5).

La bacteria Pseudomonas denitrificans ha sido reportada para cultivos de trigo, maíz y tomate (^{Belimov et al., 2001}). En los resultados obtenidos en esta investigación para el Valle del Sinú tanto la altura como la longitud radicular de plántulas de Ipomoea batatas se incrementaron significativamente respecto al control sin inoculación en un 44% y 20% respectivamente con la bacteria Pseudomonas denitrificans (IBVS2) (Tabla 5).

Las bacterias aisladas de la rizósfera de batata en las diferentes regiones del Caribe Colombiano presentaron características de microorganismos promotores de crecimiento vegetal y demostraron ser eficientes en invernadero en plántulas de Ipomoea batatas, incrementando los parámetros de crecimiento respecto al control sin inoculación. Estas bacterias se perfilan como potenciales componentes de biofertilizantes puesto que favorecen la circulación de nutrientes en las plantas y permiten reducir la necesidad del uso de fertilizantes de síntesis química (^{Sureshbabu et al., 2016}) logrando en consecuencia mejorar la fertilidad del suelo y la productividad de los cultivos.