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INTRODUCCIÓN
De acuerdo con Paredes (2016), Theobroma cacao crece bajo condiciones de piso térmico cálido, con humedad promedio de 2500 mm anuales y temperatura desde 25 hasta 28°C. La cosecha inicial se produce a los cinco años. El color de la mazorca cambia según su diversidad de amarillo a rojo, y puede llegar a pesar 1 kg.
Muchos fitopatógenos causan detrimento en la producción, afectando los frutos y mazorcas del cacao. La moniliasis es el principal problema fitosanitario y se caracteriza por la aparición de una mancha blanquecina, polvorienta que es altamente invasiva y endémica del cacao (Tuquerres, 2016; Tirado et al., 2016). Esta enfermedad causada por Moniliophthora roreri ha afectado a México desde 2005, y para Phillips-Mora, durante el 2013, las altas temperaturas afectaron el 70% de la producción.
Colombia es el cuarto productor de cacao en América Latina, después de Brasil, Ecuador y República Dominicana. En 2012, el área cultivada con cacao en Colombia fue de 158.000 ha, con una productividad de 460 kg ha-1, que es baja, en comparación con la de Costa de Marfil, el primer productor mundial, con 700 kg ha-1 (Villamizar, 2016).
En Norte de Santander, monilia afecta las 11.655 ha cosechadas por los cacaoteros. Por tanto, el control de esta enfermedad depende en gran parte del conocimiento de la biología de este fitopatógeno, y son necesarios nuevos estudios genéticos; se deben conocer las poblaciones del patógeno (Moniliophthora roreri Cif & Par) con el fin de entender los mecanismos de resistencia y diseñar programas específicos para las regiones productoras en Colombia (Correa et al., 2014).
Se han definido estos marcadores moleculares que son ventajosos para el estudio de cada sujeto y el de la población; de acuerdo con Rocha (2003), se han utilizado para encontrar en plagas, animales y vegetales, muchas formas alélicas de genes; en la producción agronómica han sido importantes en la mejora de plantas, ayudan en los estudios de los genes, que permiten obtener proyecciones de entrecruzamiento génico, para encontrar rasgos génicos, y así poder escoger marcadores para dar continuidad a proyectos sobre la relación génica. Son utilizados para determinar la variación de genes y estudiar filogenia (Shah et al., 1994; Purba et al., 2000; Rey et al., 2003) en la formación de mapas genéticos (Mayes et al., 1997; Chua et al., 2001; Billotte et al., 2001). También como señal, para poder rastrear genes provechosos. Y para Powell et al., 1996, permiten estudiar formas de similaridad y así poder delimitar cruces, manutención de la diversidad genética vegetal y direccionar los recursos heredables (Karp y Edwards, 1997).
La manipulación de los Polimorfismo de Longitud de Fragmentos Amplificados, ha permitido producir nuevas señales a nivel molecular (Vos et al., 1995). Permiten la detección de variabilidad genética, pues ofrecen información sobre las relaciones interespecíficas e intraespecíficas (Osorio, 2012). Empleados por su calidad y cantidad de información, fuerza y reproductibilidad. Tienen capacidad simultánea para screening de muchas regiones diferentes del ADN distribuidas al azar a través del genoma (Mueller and Wolferborger, 1999). El análisis puede ser aplicado al ADN de cualquier origen o complejidad, produciendo un gran número de bandas claras de las cuales más del 10% pueden ser polimórficas con patrones reproducibles. No son monomórficos, generan mucha información, mayor punto de diversificación. Atractivo para el estudio de la variación entre genomas de taxa relativamente cerrada (Innan et al., 1999). Se basan en PCR selectiva de fragmentos de restricción de ADN, bajo estrictas condiciones de PCR (Kardolus et al., 1998; Karp et al., 1997) así los fragmentos amplificados son separados por un gel de secuenciación y visualizados por autorradiografía o fluorescencia (Hong and Chuah, 2003), apreciando de 50 a 100 fragmentos de restricción que son amplificados y detectados en geles denaturantes de poliacrilamida (Vos et al., 1995).
Los AFLP, permiten investigar varios aspectos de la biología molecular y diversidad genética de hongos (Majer et al., 1996). Provee un relativo y potencial análisis en una variedad de aplicaciones, incluyendo fingerprinting o identificación de aislamientos de hongos, y la estimación de la relación filogenética. (Mueller et al., 1996). Son muy eficientes para detectar polimorfismos aun en especies con muy poca variación encontrada por RFLP. Existiendo estudios previos con este marcador en M. roreri en Antioquia, Colombia (Grisales y Afanador, 2007). Previamente varias combinaciones de cebadores PCR +3+3 fueron reportadas para AFLP en monilia (Phillips-Mora, 2003).
El objetivo de este proyecto de investigación fue determinar la diversidad genética de Moniliophthora roreri mediante Polimorfismo de Longitud de Fragmentos Amplificados de 56 muestras de Moniliophthora roreri, obtenidas en nueve municipios de Norte de Santander.
MATERIALES Y MÉTODOS
Toma de muestras y aislamiento
Las mazorcas de cacao con los síntomas de M. roreri, fueron recolectadas y registradas con datos del municipio, finca, altitud, temperatura, condiciones climáticas, información sobre el cultivo y daños (Suárez, 2006). El método de aislamiento se realizó según (Suárez y Rangel, 2013).
Conservación de las cepas
Los aislamientos de M. roreri, crecidos en PDA, según Suárez (2006), fueron conservados en tubos y cajas Petri, mantenidos en oscuridad a temperatura ambiente (28°C), y otros en refrigeración. El micelio obtenido, se dejó crecer de 11 a 15 d, y se cultivaron en PDB a 25°C.
Extracción del ADN genómico y cuantificación
La extracción del ADN de M. roreri, fue realizada según lo propuesto por (Suárez, 2005; 2016). La cantidad y la calidad del ADN fue observada en geles de agarosa al 0,9% (w/v) utilizando como intercalante bromuro de etidio (0,5 µg mL) y se detectó en un transiluminador con luz UV.
Técnica de AFLPs
Se estandarizó según el kit Analysis System II. Se evaluaron diez combinaciones de cebadores para AFLP, se utilizaron 10 muestras con el control positivo y negativo, y se escogieron las combinaciones de cebadores con más polimorfismo que se aplicaron a las 56 muestras.
Las combinaciones utilizadas fueron las propuestas por Phillips-Mora (2003), E-AGC/ M-CAG, E-ACA/ M-CAG, E-ACT/ M-CAG, E-ACG/ M-CAG, E-ACA/ M-CAA, E-ACT/ M-CAA, E-ACG/ M-CAA, E-ACC/ M-CAA, E-AAC/ M-CAA, E-AA/ M-CAA. Donde M es el cebador complementario a la secuencia adaptadora MseI; E el cebador complementario a EcoRI; A, C, G y T fueron los nucleótidos selectivos adaptados al final 3’ de los cebadores.
Digestión, restricción del ADN y ligación
Se realizó en un volúmen final de 25 µL, adicionando al ADN dos enzimas (2U de MseI y 2U de EcoRI). La mezcla de la reacción fue de 2,5 µL de ADN (50 ng µL-1), 1,0 µL EcoRI/MseI, 2,5 µL de 5x de buffer de reacción (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, con 50 mM de acetato de magnesio, y con 250 mM de acetato de potasio) en 6,5 µL de agua nanopura. Luego, la reacción se dejó a 37°C por 2 h, seguida por inactivación con calor a 70°C durante 15 min, y almacenadas a 4°C.
La ligación se realizó con 25 µL del ADN digerido, 12 µL de ligación de adaptadores (EcoRI/MseI; con 0,4 mM de ATP; Tris-HCL 10 mM y acetato de potasio 50 mM), se adicionó 0,5 µL de T4 DNA ligasa (1 U/µL) 12 µL de solución de adaptador-ligador para el tubo de digestión a 20°C por 2 h y después se hizo la dilución 1:10 (10 mL y 90 µL buffer TE).
Reacciones de preamplificación
Para la reacción con los primers con una base selectiva (PCR+1) se hizó en microtubos de 0,2 mL, así: 2,5 µL de mezcla de dilución de ligación de 1:10, 20 µL de mezcla de cebadores para la preamplificación; Mix II: 2,5 µL de buffer 10X PCR (que contenía MgCl2 15 mM), 0,5 µL de taq DNA polimerasa (5 U/µL) y 0,5 µL de 0,2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP, y dTTP. La mezcla se dejó en un termociclador, programado así: 94°C durante 30 s (denaturación), 56°C/1 min (anillamiento) y 72°C/1 min (extensión) durante 20 ciclos. Los productos de la amplificaciones se separaron en gel de agarosa 1% (w/v) utilizando el bromuro de etidio (0,5 µg mL-1) como intercalante y observados en luz UV. Sucesivamente los productos de la preamplificación PCR+1 fueron diluidos por 1:50 en buffer TE (3 y 147 µL).
Amplificaciones AFLP selectivas
La PCR+3 se realizó en un volumen de 20 µL. La reacción contenía 5 µL de ADN (PCR+1 diluido 1:10), 2 µL de tampón 10X (Tris-HCl 200 mM, pH 8,4; MgCl2 15 mM y KCl 500 mM), 0,2 µL de EcoRI-cebador y 4,5 µL de MseI-cebador; 7,9 µL de agua destilada y 0,3 µL de Taq DNA polimerasa (5U/µL). Las combinaciones de primers utilizadas fueron las sugeridas por Phillip (2003).
Las amplificaciones por PCR fueron realizadas en 20 µL con 5 µL de la preamplificación, y la PCR se realizó por 30 s a 94°C, 30 s a 65°C y 60 s a 72°C, para 1 ciclo. La temperatura de alineamiento se bajó 0,7°C en cada ciclo durante 12 ciclos (touch down) y se siguió con 30 s a 94°C, 30 s a 56°C, y 60 s a 72°C, por 25 ciclos. El producto se conservó a 4°C.
Preparación de muestra
Las amplificaciones selectivas (5 µL) se les adicionó 5 µL de buffer de carga (6,4 mL de formamida al 99%, 560 µL 10× TBE, 200 µL de 50 mM EDTA, 0,01 g 0,1% (w/v) Xilen-cianol, 0,1 g (w/v) azul de bromofenol y 2.840 µL de agua nanopura.
Preparación del vidrio y cámara de secuenciación
Con Alcanox, se lavaron los vidrios y luego se les adicionó agua, después se secaron y se frotaron con 95% de alcohol con kinwipes. Se aplicó una capa de solución de 1 mL de ácido acético al 5% y etanol al 95% con 3 µL de bind silane, al lado interno del vidrio. Se colocaron dos espaciadores a lo largo del vidrio y el peine. El vidrio fue fijado al sistema de ajuste de la cámara que se limpió con alcohol al 90% y luego con 1 mL de repel silane.
Preparación del gel de poliacrilamida
Las amplificaciones AFLP se separaron en gel de poliacrilamida denaturante 7%, para el gel de 80 mL se preparó una mezcla de 22,4 mL de solución concentrada (19:1 acrilamida: bisacrilamida) 49,6 mL de solución diluyente (urea 7M y TBE 1X), 32 µL de Temed y 500 µL de solución de persulfato de amonio fresca (0,1 mg mL-1). Y el grosor fue de 0,4 mm. Se insertó el peine y se dejó polimerizar el gel por 2 h.
Electroforesis en gel de poliacrilamida a baja temperatura PAGE
El gel se montó en la cámara de secuenciación, que se llenó con buffer 1X TBE. Se pre corrió por una hora a 40 W para precalentar los vidrios. Las muestras fueron incubadas a 90°C durante 3 min y mantenidas en hielo. Se cargaron 5 µL de muestra en cada pozo. Y se corrió la electroforesis a 40 W por 2 h y 30 min.
Procesamiento del gel y tinción con plata
El gel se conservó en solución fijadora por 20 min, y luego fue lavado con agua dos veces -cada lavado se dejó 3 min teñido con una solución de nitrato de plata, se lavó con agua por 4 s y se dejó en solución de revelado hasta observar bandas. Para la fijación se adicionó 250 mL de ácido acético y se agitó por 30 min. Luego se lavó tres veces con agua destilada (por 2 min cada lavado), y en la solución de nitrato de plata permaneció con agitación por 30 min. Se enjuagó en 250 mL de agua por 20 s y se dejó en una bandeja pre enfriada con solución de revelado y agitación lenta, se transfirió a una solución de parada por 10 min en agitación.
Los fragmentos de restricción se marcaron por observación y las bandas fueron registradas. Los datos de los resultados se almacenaron en Microsoft Excel para el análisis.
Análisis de datos
El polimórfismo se detectó con la luz blanca en el transiluminador, y de acuerdo con la definición de Nei y Li (1979), la matriz binaria de datos se convirtió en una matriz de similaridad. La distancia genética se refiere a cualquier medida cuantitativa de la diferencia genética, a nivel de frecuencias alélicas o de secuencias de ADN estimada entre individuos, poblaciones o especies (Marquéz, 2003).
El dendrograma de similitud o distancias genéticas de Nei, se construyó con el algoritmo UPGMA, y se utilizó el paquete estadístico NTSYSpc Versión 2.01i. para el correspondiente análisis de coordenadas principales.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El protocolo utiliza las características de las enzimas de restricción como su rapidez, y el poder de la reacción en cadena de la polimerasa para encontrar formas alternas de los genes (Vos et al., 1995), también ha sido utilizada para conseguir señales moleculares en eucariotes como procariotes (Galeano, 2005; Barcelos, 2002). En el caso de plantas como la palma ha sido aprovechado para observar la variabilidad génica de Elaeis, ha sido importante para poder conocer entrecruzamiento génico y algunos rasgos como grueso del cuesco (Billotte et al., 2001).
Para AFLP se emplearon las enzimas (EcoRI, MseI) y 10 composiciones de cebadores provenientes de la digestión de estas enzimas de los cuales nueve correspondían a cebadores PCR +3+3, y un cebador PCR +2+3. Las combinaciones ensayadas amplificaron el 100%.
Con las combinaciones de cebadores PCR +3+3, se obtuvo 44 bandas, y para la combinación +2+3 (EAA/MCAA) se encontraron 45 bandas, las que presentaron un menor número fueron EACA/MCAA con 10 bandas; y EACT/MCAA con 16 bandas, respectivamente.
Se probaron varias combinaciones de las reportadas por Phillips-Mora (2003), y se seleccionaron tres nuevas combinaciones que no habían sido probadas antes: E-ACC/ M-CAA, E-ACG/ M-CAA, y E-AAC/ M-CAA, se obtuvo 284 bandas polimórficas aplicadas a todas las muestras. La combinación que presentó mayor número de polimorfismos fue E-ACC/M-CAA. Con 100 bandas y un número menor de alelos (6), con la combinación E-ACG/M-CAA se consiguieron menos bandas 90 y el número de alelos fue mayor (23), la combinación E-AAC/ M-CAA presentó 94 bandas y alelos (12). Con estas combinaciones se observó mayor polimorfismo, que las logradas por Phillips-Mora.
Se elaboró un dendrograma (Fig. 1), donde se apreciaron cinco grupos, y los valores obtenidos de la distancia genética. Se observaron diferencias entre las muestras por los patrones de bandas generados, es decir, polimorfismos en la secuencia de ADN (Osorio et al., 2012), que sugieren la existencia de variabilidad genética entre las muestras (Fig. 1 y 2).
Figura 1 Dendrograma generado por la técnica AFLP con 56 aislamientos de Moniliophthora roreri y construido con el método de agrupamiento UPGMA (teniendo en cuenta el municipio e identificación de las muestras).
Se observó el mínimo y máximo coeficiente de similitud (0,075 y 0,58), lo que demuestra la alta variabilidad entre las muestras, del 7,5 al 58%. La información arrojada por este marcador, indicó el gran polimorfismo que tiene M. roreri.
Grupo I (Ia y Ib), M9, El Zulia; M10, Bucasasica y M11, Sardinata indican su similitud, que no se esperaba por estar en tres municipios diferentes, pero que geográficamente están cerca y conservan su aservo genético (coeficiente de similitud de 0,065). Grupo II, M54 de Tibú (coeficiente de similitud de 0,075), no muestra semejanza con las demás muestras, está al nororiente del departamento y más alejado de los otros. Grupo III, M15, Agua Clara (coeficiente de similitud de 0,11), ubicado al nororiente de Cúcuta. Grupo IV, M55, El Tarra y M56, Bucarasica (coeficiente de similitud de 0,12), similares pero pertenecen a municipios retirados, El Tarra al norte de Bucarasica, indica que estas cepas se diseminaron de un municipio a otro.
Grupo V se subdivide en Va (coeficiente de similaridad de 0.16), comprende M1, M4, M14 de El Zulia; M2, M5, y M26, Cúcuta; M6, Sardinata; M8 y M13, Bucarasica, municipios cercanos; M3 y M7 pertenecen a Tibú, indicando que estas cepas se intercambiaron entre municipios, ubicado al nororiente del departamento. M12, Teorama, al noroccidente del departamento; y M25, Agua Clara.
Vb comprende el grupo Vb1 (coeficiente de similaridad de 0.14) están M17, M34, M44 y M49 de Teorama, cercanas de las aisladas en El Tarra: M22, M27, M32, M37, M42, M47, M52; y Tibú: M36, M51, municipios que están retirados de El Zulia, Cúcuta, Bucarasica y Sardinata, se encuentran al noroccidente y nororiente del departamento. Las siete cepas de El Tarra se asilaron de dos fincas diferentes: Lucero y La constancia (Suárez, 2016), indica similitud por su cercanía. También se encontraron en municipios cercanos: M18, M30, M35, M50 (Sardinata); M19, M24, M29, M39 (El Zulia); M21, M31, M41, M46 (Cúcuta); M33, M43, M48 y M53 (Bucarasica). M16, M20, M40 y M45 (Agua Clara), más distantes al nororiente de Cúcuta.
El grupo Vb2 (coeficiente de similaridad de 0,15), las muestras M23, M28 y M38, de diferentes fincas miraflores (2) y el porvenir (1) (Suárez, 2016), de Bucarasica, mostraron su cercanía y similitud genética.
En el dendograma (Fig. 1), la cepa M9 de El Zulia (grupo I), está más distante de la M5, Cúcuta y de M6, Sardinata (grupo V) (el coeficiente de similaridad de 0,085 a 0,54), determinó que son similares.
Es difícil definir grupos y asociarlos a las diferentes localidades muestreadas (Fig. 2), las cepas más alejadas son M9 (El Zulia); M10 (Bucarasica) y M11 (Sardinata) (Fig. 1 y 2), el primer eje es importante permitiendo visualizarlas en el cluster I, que se divide a su vez en grupo Ia y Ib, y que se distanciaron genéticamente de las demás.
En el segundo eje se apreciaron parte de las cepas de los clusters III, IV y V. Se dificultó la visualización de la cepa del cluster II. Continuó en importancia el tercer eje, donde se observó M50 (Sardinata) como la más distante de todas y con menos similaridad, se pudo apreciar parte de las cepas del cluster V (Fig. 1).
Según el análisis tridimensional de coordenadas, las cepas quedaron asociadas en cuatro grupos; las más alejadas fueron M9 (El Zulia) y M50 (Sardinata), a pesar de estar localizadas en municipios cercanos, son diversas genéticamente (Fig. 2).
Moniliophthora roreri, presentó una gran variabilidad genética, que puede estar relacionada con la variabilidad morfológica. Esto permite suponer que dicha diversidad fenotípica está asociada con la variabilidad genética reportada en esta investigación, y también corresponde con lo hallado previamente en Henequen, donde se encontró que la variabilidad genética está acompañada de la diversidad en los caracteres morfológicos (González, 2003).
Entre las ventajas de los AFLP están las relacionadas por Mueller y Wolfenborger (1999): taxonómicamente, tienen amplia aplicabilidad y se han utilizado eficientemente en la variedad de taxa, incluyendo bacterias, hongos, animales y plantas; los niveles de error generados son de por lo menos el 2%; son representativos bajo condiciones de alta selectividad; las repetidas amplificaciones muestran perfecta replicabilidad; la muestra de ADN que requieren es mínima y pueden ser utilizadas muestras extremadamente pequeñas, parcialmente degradadas y pueden ser generados con gran rapidez.
La definición de los grupos genéticos se basó en los AFLP (Tredway et al., 1999) que revelaron diferentes formas de variación genética comparada con ITS. La gran variación de grupos, cinco en AFLP comparados con tres grupos revelados por ITS (Suárez, 2016) son muestra de que las barreras geográficas que separan las áreas y los aislamientos generan más grupos.
Morfológicamente se diferenciaron tres fenotipos de Moniliophthora roreri (Suárez, 2016) mientras que la técnica AFLP permitió encontrar más información acerca de la gran diversidad molecular.
Los grupos generados en el dendograma mostraron un nivel de diferenciación y podrían representar ecotipos que resultan del proceso de adaptación a condiciones desarrolladas específicamente, considerando que el Nororiente de Colombia representa el centro de diversidad más probable de monilia (Phillips-Mora, 2003).
Según el estudio realizado en M. roreri con haplotipos SSR de 40 aislados de países del sur y centroamerica, se determinaron dos tipos de genes. En centroamérica se encontraron aislados A1_B1, mientras que en sur américa se encontró este y el A2_B2, confirmando hipotéticamente que el centro de origen es Colombia y así pasó a Venezuela, Perú, Ecuador y Centroamérica. También se ha propuesto que la introducción de M. roreri en Centroamérica tuvo lugar en Panamá en 1956 cuando las vainas de cacao infectadas fueron traídas de Colombia. (Díaz-Valderrama y Aime, 2016).
El Valle Magdalena de Colombia mostró los niveles más bajos de diversidad genética con 20 genotipos distintos, de los cuales 13 se limitaron a esta región, e indica que esta región es el posible centro de origen de M.roreri (Shahin et al., 2015).
En futuros proyectos es importante buscar una solución a esta enfermedad, hallar los factores que de alguna forma benefician a este fitopatógeno. Además, las investigaciones deben ir enfocadas hacia el estudio del hongo como a las diferentes variedades de plantas de cacao donde se hospeda (Correa et al., 2014). Por tal razón es importante dar continuidad a estos estudios en el departamento.
CONCLUSIONES
La técnica AFLP permitió caracterizar a M. roreri, demostrando que es útil para determinar la diversidad genética de fitopatógenos en el Nororiente Colombiano.
Los altos niveles de variación genética de este fitopatógeno abren la posibilidad para continuar el estudio de los diferentes fenotipos de M. roreri., posiblemente la moniliasis se dispersó a otros lugares donde por adaptación a nuevas condiciones ambientales y adquirió características moleculares particulares que finalmente originaron grupos genéticos diferentes; también podría aumentar la posibilidad genética de supervivencia de esta especie frente a cambios ambientales.
