Colonia de B.

cockerelli. Se recolectaron aproximadamente 150 adultos de B. cockerelli con una red entomológica en el campo de producción de jitomate de la Facultad de Agronomía y Veterinaria de la Universidad Autónoma de San Luis Potosí, México. Éstos se colocaron en un frasco de vidrio y se trasladaron al laboratorio de entomología para su cría y reproducción masiva. Los adultos se introdujeron en jaulas de madera y organza (50 cm x 50 cm x 75 cm) con plantas de chile para que ovipositaran sobre ellas y se mantuvieron con un fotoperiodo de 12:12 luz: oscuridad, temperatura media de 25 ± 1 °C y humedad relativa de 60 ± 10 %. Cada 48 h las plantas de chile se cambiaron individualmente a otras jaulas, con la finalidad de obtener ninfas del tercer estadio para la realización de los bioensayos. La edad de las ninfas se determinó por medio de unidades calor y el tamaño de las mismas (^{Abdullah 2008}; ^{Medina y Covarrubias 2008}). El procedimiento consiste en usar una temperatura umbral base de desarrollo de la especie, junto con las máximas y mínimas del ambiente en el cual se realiza el desarrollo del ciclo del insecto, con ello se estiman las unidades calor y se pronostica cuando se alcanzará cada estado y/o instar de interés de la especie en estudio. En este caso se usaron los datos de unidades calor y tamaños propuestos por ^{Garzón et al. (2007}). La herramienta usada para el cálculo de unidades calor fue de la Universidad de California (UC IPM 2015).

Hongos entomopatógenos.

Se evaluaron cuatro cepas de hongos entomopatógenos proporcionadas por el Laboratorio de Reproducción de Organismos Benéficos, dependiente del Comité Estatal de Sanidad Vegetal del estado de Guanajuato, México. Las comerciales fueron Bassianil^® (Be. bassiana- BB09) y Metabich^® (Metarizhium anisopliae MA28); y las dos nativas fueron Be. bassiana (BB42) aislada a partir de una chinche Lygus spp. (Hemíptera: Lygaeidae) en “El Copal”, Guanajuato, y otra de M. anisopliae (MA25) aislada de una larva de Scarabaeidae (Coleoptera) en la localidad de Puruaga, Guanajuato.

De manera preliminar se aplicaron concentraciones desconocidas de cada cepa a ninfas de B. cockerelli, para su posterior re-aislamiento y obtención de colonias en medio agar dextrosa Sabouraud (ADS), incubadas a 28 °C en el caso de las cepas BB09 y BB42; mientras que MA25 y MA28 fueron crecidas a 25 °C.

Identificación molecular.

La extracción de ADN se efectuó con el protocolo descrito por ^{Reader y Broda (1989}), a partir del crecimiento fúngico en caldo dextrosa y papa (PDA). Las regiones ITS se amplificaron con los oligonucleótidos ITS1 e ITS4 diseñados por ^{White et al. (1990}). La PCR se realizó en un volumen de 25 μl, con una mezcla de reacción constituida por 5,0 µl de tampón de reacción 5x, 1 μl de MgCl₂ 25 mM; 0,5 μl de cada oligonucleótido 10 μM; 0,3 μl de taq polimerasa 5 μl ^-1; 0,5 μl de dNTP’s 10 μM; 1,0 μl de ADN, y agua miliQ estéril c.b.p. Las condiciones de reacción fueron: desnaturalización inicial de 5 min a 94 °C, seguida de 35 ciclos con fase de desnaturalización (30 segundos a 94 °C) cada uno, alineamiento (45 segundos a 60 °C) y extensión (1,5 minutos a 72 °C); y con extensión final de 8 minutos a 72 °C en un termociclador marca Eppendorf ®-

El producto de PCR fue clonado en el vector pGEM-T Easy siguiendo las instrucciones del fabricante (Promega 2003). La manipulación genética se llevó a cabo en células competentes de E. coli JM 109. El ADN plasmídico se extrajo por el método de lisis alcalina (^{Birnboim y Doly 1979}), y las clonas positivas se identificaron por liberación del inserto mediante digestión con la enzima Eco RI (^{Sambrook et al. 1989}). Se eligieron tres clonas positivas para cada uno de los hongos, se purificó el ADN y se secuenció por el método de Sanger en el Laboratorio Nacional de Biotecnología Agrícola, Médica y Ambiental del Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica de México.

Las secuencias de nucleótidos se compararon contra las secuencias en el GenBank-NCBI (National Center for Biotechnology Information 2011), con el programa BlastN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blastn.cgi/). Se realizó un análisis filogenético contrastando las secuencias obtenidas con las que dieron mayor porcentaje de similitud en el GenBank, a través de un dendrograma obtenido con el método agrupamiento de vecinos “neighbor-joining” (Sai- tou y Nei 1987), basándose en datos de 500 repeticiones (“bootstrap”) (^{Felsenstein 1985}) y las distancias evolutivas se calcularon utilizando el método de máxima verosimilitud en unidades de la cantidad de base de sustituciones por sitio, con el programa MEGA 5.05® (^{Tamura et al. 2011}). Finalmente, las secuencias obtenidas fueron dadas de alta en el GenBank.

Concentración de conidias y prueba de viabilidad.

Se recolectaron conidias a partir de colonias crecidas en medio ADS y se suspendieron en agua destilada con surfactante INEX-A COSMOCEL® 0,2 %, por agitación en una placa magnética Cimarec^®. Se contaron las conidias con un hematocitómetro Neubauer Brigh SUPERIOR^® y un microscopio marca Zeiss Axiolab a 40x. Las suspensiones se ajustaron por dilución a las concentraciones de 1 x 10³ a 1 x 10 ^s conidias ml^-1 para cada especie de entomopatógeno y fueron corregidas después de realizar las pruebas de viabilidad.

Para determinar la viabilidad de las esporas se diluyó una concentración desconocida de las conidias en 2 ml de agua destilada con surfactante INEX-A COSMOCEL® al 0,2 %, se tomaron 50 μl de esta dilución y se sembraron sobre pequeños rectángulos de agar, colocándole un cubreobjetos para observar al microscopio la cantidad de conidias germinadas a las 17 h (^{Lacey et al. 2009}).

Susceptibilidad de B. cockerelli a las cepas de entomopa-

tógenos.

Los bioensayos de susceptibilidad se realizaron por aspersión con una Torre de Potter (Burkard®). Cada unidad experimental consistió de una caja Petri de 9 cm de diámetro con una hoja de chile ancho infestada con 10 ninfas del tercer estadio de B. cockerelli, con el envés hacia arriba para exponer a las ninfas directamente a la aspersión. El peciolo de la hoja se envolvió en torundas de algodón humedecidas con agua destilada estéril durante todo el ensayo. En la parte inferior de la caja se ubicaron círculos de papel secante sin humedecer. Las unidades experimentales fueron asperjadas con 2 ml de suspensiones de 10³ a 10⁸ conidias ml^-1 de las distintas cepas, mientras que los testigos fueron asperjados con 2 ml de la solución agua destilada con surfactante. Se realizaron cuatro repeticiones. Las aspersiones se efectuaron a una presión de 13,3 psi (^{Lacey et al. 2009}). Después de la aplicación, las cajas se sellaron y se situaron en una cámara húmeda con temperatura de 25 ± 1 °C, humedad de 60 ± 10 % y fotoperiodo de 12:12 h. Para estimar las líneas de respuesta log-dosis probit se registraron los datos de mortalidad en el séptimo día después de la aplicación.

Análisis estadístico.

La mortalidad en el testigo se utilizó para corregir el resto de las mortalidades registradas mediante la fórmula de ^{Abbott (Abbott 1925}). Los datos de mortalidad se analizaron con el modelo Probit y el programa POLO PC (LeOra Software 2002). Se estimaron las concentraciones letales CL₅₀ y CL₉₅ y sus límites de confianza al 95 % para cada especie y cepa de hongo. La respuesta de B. cockerelli a cada especie de hongo se consideró significativamente diferente si los valores de los límites de confianza de las CL50 y CL95 no se traslapaban. Se usó una prueba de x² para demostrar la bondad de ajuste al modelo (^{Robertson y Preisler 1992}). Además se estimó el factor de virulencia (FV), a dos niveles, dividiendo la CL₅₀ o CL₉₅ de la cepa menos patogénica entre la CL₅₀ o CL₉₅ de la más patogénica según el caso (^{Rueda y Shelton 2003}).

Identificación molecular de los entomopatógenos.

Los productos de PCR de los ITS fueron bandas de 600 y 700 pares de bases para ambas cepas y se obtuvo la secuencia respectiva. La comparación de las secuencias obtenidas con las depositadas en el GenBank mostraron que las clonas de M. anisopliae presentan valores de 79 a 88 % de similitud y de 99 % de identidad con M. anisopliae, M. pingshaense y Cordyceps japonica Lloyd. Las secuencias de Be. bassiana presentaron un valor de 99 % de identidad y valor de 84 a 87 % de similitud con el mismo género y especie. Las secuencias obtenidas quedaron inscritas en la base de datos del GenBank, con los registros JX624255 para Be. bassiana y JX624254 para M. anisopliae.

En la figura 1 se muestra el dendrograma NJ con el que se estableció el análisis filogenético de las secuencias de las cepas en estudio y las seleccionadas del GenBank, las cuales incluyen algunas especies de contraste tanto de la división Ascomycota como Basidiomycota. En este dendrograma se distingue el clado de Be. bassiana en el que se ubicaron las clonas de la cepa nativa, y de igual forma el ciado de M. ani- sopliae con las clonas de la cepas nativas. Además, se observó que Be. bassiana tiene relación con otro hongo entomopa- tógeno Lecanicillium lecanii R. Zare & W. Gams, pero ambos no se relacionan con M. anisopliae, lo que coincide con los resultados de ^{Hegedus y Khachatourians (1993}), quienes señalan que hubo hibridación de sondas de ADN mitocon- drial de Be. bassiana con aislamientos de Beauveria, Lecanicillium y Paecilomyces, pero no conMetarhizium. Resultados similares fueron obtenidos por ^{Uribe y Khachatourians (2007}) al determinar con la secuencia parcial del rADN 18S una relación entre Metarhizium con hongos micoparásitos y no con los entomopatógenos Beauveria y Lecanicillium, e infieren que la estrategia de parasitismo de insectos proviene de por lo menos dos raíces ancestrales en hongos filamentosos.

En el manejo integrado de plagas es importante identificar las especies de entomopatógenos con exactitud, lo que actualmente se realiza con técnicas moleculares (^{Sugimoto et al. 2002}; ^{Luan et al. 2011}). ^{Driver et al. (2000}) realizaron una reclasificación taxonómica del género Metarhizium con la técnica amplificación por PCR de fragmentos polimórficos de ADN al azar (RAPD-PCR), llegando hasta el nivel de variedad. Los mismos autores y ^{Glare et al. (1996}) enfatizan en que las características morfológicas no siempre son suficientes para una correcta clasificación de cepas de Metarhizium y de otros entomopatógenos. Las técnicas moleculares tienen gran aplicabilidad y permiten conocer el desplazamiento geográfico de las cepas, diferenciar entre y dentro de aislados nativos, así como en la biodiversidad de poblaciones de entomopatógenos y de cepas (^{Meyer et al. 2007}).

Viabilidad de las conidias de los hongos entomopatógenos.

La germinación de las conidias de M. anisopliae y Be. bassiana fue de 88 a 100 %. Las dos cepas de M. anisopliae tuvieron en promedio 90 % de viabilidad. Para la cepa nativa de Be. bassiana (BB42) la viabilidad fue de 88 % y para la comercial (BB09) de 100 %. Los resultados concuerdan con lo citado por ^{Lacey et al. (2009}), quienes obtuvieron porcentajes que varían de 95 a 99 % con cepas de M. anisopliae. Sin embargo, respecto a las cepas de Be. bassiana, el porcentaje del presente trabajo es superior a lo reportado por los mismos autores, lo que es un buen indicador de la calidad de las cepas en estudio, como lo señalan ^{Alves y Pereira (1998}).

Micosis en Bactericera cockerelli.

Todas las cepas utilizadas esporularon sobre los cadáveres de las ninfas o adultos de B. cockerelli. La micosis se presentó primero en los insectos a los que se les aplicó las concentraciones más altas. En el caso de Be. bassiana, antes de la esporulación, el cuerpo de los insectos se tornó rosa, sin importar la cepa, lo que ha sido reportado también en otros insectos, como el psílido del eucalipto Glycaspis brimblecombei Moore y la mosca blanca Bemisia tabaci (Gennadius) (^{Wraight et al. 2000}; ^{Dal et al. 2011}). Este síntoma de infección es de utilidad en trabajo de campo, ya que las condiciones no siempre son las adecuadas para observar la esporulación del hongo, y el cambio en la coloración puede evidenciar que el entomopatógeno está actuando sobre las ninfas de B. cockerelli.

Mortalidad.

La mortalidad de B. cockerelli por la aplicación de las cepas de Be. bassiana y M. anisopliae presentó diferencia estadística significativa con relación al testigo; el cual presentó un porcentaje de mortalidad menor a 10 %, probablemente debido a manejo y no por efecto del bioensayo. Además, hubo un aumento en el porcentaje de mortalidad conforme al incremento en la concentración de conidias de las diferentes especies y cepas. La mortalidad varió de 90 a 100 % con las concentraciones más altas. Sobresalen las cepas de Be. bassiana BB09 y BB42, que a menores concentraciones provocaron 100 % de mortalidad (Tabla 1).

Tabla 1 Estimación de la CL50 y la CL95 (conidias mL-1) de cuatro cepas de hongos entomopatógenos sobre ninfas de B. cockerelli. 

En el caso de M. anisopliae, MA25 y MA28 provocaron 100 % de mortalidad con la concentración de 1 x 10¹ conidias mi^-1, sin embargo, en la respuesta de mortalidad que inducen estas dos cepas sobre ninfas de tercer estadio de B. cockerelli, existió diferencia significativa (P < 0,05) solo a nivel de la CL50. MA25 presentó una CL50 de 6,34 x 10⁵ conidias mi^-1, y en MA28, la CL50 fue 1,32 x 10⁵ conidias mi^-1. No obstante que a nivel de CL95 no existió diferencia significativa en la patotoxicidad de las dos cepas sobre B. cockerelli, pues los límites fiduciales de ambas respuestas se traslapan, la cepa comercial es aproximadamente cinco veces más virulenta que la nativa a nivel de CL50 (Tabla 1).

Respecto a la respuesta por la aplicación de cepas de Be. bassiana, no se encontró diferencia en la CL₅₀ ni en la CL₉₅. Con BB42 se obtuvo 100 % de mortalidad con una concentración de 1 x 10⁶, su CL₅₀ estimada fue 3,01 x 10⁴ conidias mi^-1 y una CL₉₅ de 1,6 x 10⁶. Al probar BB09 se obtuvo 100 % de mortalidad con la concentración de 1 x 10⁷, una CL50 de 2,99 x 10⁴ y una CL95 de 4,2x10 ⁶ . Esto significa que a nivel de la CL50 la cepa nativa es prácticamente igual de virulenta que la comercial, pero a nivel de CL95, la cepa nativa evaluada en este trabajo resulta aproximadamente 2,5 veces más virulenta que la comercial (Tabla 1).

Al realizar una comparación entre las cuatro cepas de los hongos evaluados, la única que resultó ser diferente en su CL50 fue la nativa MA25, la cual es significativamente (P < 0,05) menos virulenta contra ninfas de tercer estadio de B. cockerelli. La cepa comercial BB09 es la más virulenta, aproximadamente 21 veces más que la cepa nativa MA25, y cuatro veces más que la comercial MA28; contrastando con la cepa nativa BB42, ésta resultó no ser diferente (Tabla 1). A diferencia del trabajo de ^{Lacey et al. (2009}), las cepas de Be. bassiana en este trabajo resultaron ser más virulentas que las de M. anisopliae, además de obtener mortalidad mayores a 95 % con una concentración de 1x10⁸ conidias por mi^-1.

Al comparar las CL50 obtenidos por ^{Hoy et al. (2010}) sobre el psílido asiático de los cítrico Diaphorina citri Kuwa- yama con las estimadas en el presente trabajo, se apreció que las cepas de Be. bassiana y una de M. anisopliae (MA28),

resultan hasta 23 veces más virulentas contra el psílido de la papa. Sin embargo la cepa MA25 tiene un efecto similar a nivel de CL50. Derivado de los resultados, se puede hipote- tizar que las cepas nativas del estado de Guanajuato pueden lograr en campo un buen control de B. cokerelli, y lo más importante, que las dosis obtenidas en esta investigación son económicamente viables de aplicar en campo, ya que la mayoría de los productos comerciales poseen formulaciones más concentradas.

El aislamiento y uso de cepas nativas de hongos ento- mopatógenos ha cobrado gran importancia a nivel mundial, porque ellas se encuentran mejor adaptadas a las condiciones naturales locales y a sus huéspedes (Meyer et al. 2OO7, 2OO8; Hoy et al. 2O1O). Este es el caso de una cepa nativa de I. fumosorosea que se utilizó contra el psílido asiático de los cítricos, y resultó altamente virulenta (Meyer 2OO8).

En este trabajo también se estudió la respuesta al uso de cepas comerciales, cuya ventaja es que ya se encuentran formuladas, y los resultados obtenidos son similares a los de Dal et al. (2O11), quienes evaluaron seis cepas comerciales de Be. bassiana, M. anisopliae y Lecanicillium longisporum (Petch) Zare & W. Gams contra el psílido del eucalipto. Al comparar la virulencia de las cepas comerciales de M. anisopliae (Me- tarril WP® y Toyobo®) utilizadas por los autores citados con la observada en el presente trabajo, MA28 resultó entre 2,2 y 2,8 veces más virulenta que las cepas comerciales. Dichos resultados se pueden deber a las diferencias en el grado de susceptibilidad de los insectos, a propiedades y características genéticas del mismo hongo entomopatógeno, como se expone en el trabajo de Padulla y Alves (2OO9), quienes con la misma cepa de Be. bassiana (Boveril WP®) utilizada en el trabajo de Dal et al. (2O11), requirieron una concentración de 2,37 x 1O⁷ conidias mi^-1 para matar a 50 % de la población del psílido asiático de los cítricos; resultando más susceptible que el psílido del eucalipto; esta concentración es menor a la determinada en este trabajo con el uso de la cepa BBO9 sobre el psílido de la papa.

La concentración de las cepas BB42 y BB09 no difirieron en patogenicidad a la cepa menos virulenta de Be. bassiana que aplicaron Alizadeh et al. (2OO7), sobre el psílido del pistacho Agonoscena pistaciae Burck. and Laut.

Es importante señalar que además de las altas mortalidades obtenidas con las cepas de entomopatógenos en este trabajo, ya fueran nativas o comerciales, existe la posibilidad de transmisión horizontal durante el uso de hongos entomopatógenos para el manejo de B. cockerelli, como lo mencionan Avery et al. (2OO9) con el hongo I. fumosorosea, el cual se transmite de manera eficaz por D. citri. Esta es otra ventaja sobre los productos químicos, y representa una cualidad mas para la utilización de hongos entomopatógenos dentro de los programas de manejo integrado del psílido de la papa.

Con nuestra investigación corroboramos el potencial de Be. bassiana y M. anisopliae para el manejo de este psílido y representan nuevas opciones de manejo debido a su modo de infección, el cual no requiere ser ingerido para poder causar una enfermedad (Téllez et al. 2OO9). Trabajos previos han demostrado la capacidad de estos entomopatógenos para ser utilizados dentro de programas de manejo integrado de B. coc- kerelli (Díaz et al. 2OO5), que entre otras ventajas son la seguridad para los humanos y otros organismos que no son blanco, la preservación de otras especies naturales y el incremento de la biodiversidad en los agroecosistemas (Lacey et al. 2OO1).

Finalmente, son necesarias las pruebas en campo e invernadero para determinar qué cepa tiene mayor aplicabilidad bajo diferentes condiciones agroecológicas, así como explorar sobre la producción masiva y la elaboración de formulaciones.