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INTRODUCCIÓN
El calicivirus felino (CVF) es un virus altamente contagioso de distribución mundial (Radford et al. 2009) y uno de los principales patógenos asociados en la presentación de la enfermedad del tracto respiratorio superior (ETRS) en gatos, tigres, leones y otras especies de felinos, también conocida como el complejo respiratorio felino o gripe felina (Pesavento et al. 2008; Berger et al. 2015). El CVF pertenece a la familia Caliciviridae, del género Vesivirus (Radford et al. 2007; Pesavento et al. 2008; Pereira et al. 2018; Brunet et al. 2019) . Posee una cápsula icosaédrica que varía entre 27-40 nm, es un virus ARN monocatenario, de polaridad positiva, por lo cual puede evolucionar rápidamente y tener una amplia variabilidad antigénica (Radford et al. 2009; Alfonso et al. 2017) Asimismo, es un virus desnudo, con un genoma pequeño (7.7 kb) que codifica tres marcos abiertos de lectura (ORF, por su sigla en inglés ); el ORF1 codifica proteínas no estructurales, el ORF2 codifica para la proteína precursora de cápside o proteína mayor (VP1); y el ORF3 codifica la proteína VP2, una proteína estructural de menor tamaño (Di Martino et al. 2020) . Al ser un virus ARN desnudo, el FCV posee una resistencia a una amplia variedad de desinfectantes comunes y le permite permanecer más tiempo en el medio ambiente (Radford et al. 2009; Cohn 2011; Walter et al. 2020).
La transmisión del CVF ocurre de manera directa con un felino infectado o de manera indirecta con secreciones respiratorias, saliva, orina, aerosoles, alimentos, agua, vómito o materia fecal contaminados con el virus (Hurley et al. 2004). Una vez el gato entra en contacto con las partículas virales, se desarrolla una primera replicación en la orofaringe, con una posterior viremia que genera una enfermedad clínica dependiente de múltiples factores como edad, carga viral, virulencia o estatus inmunitario (Hurley et al. 2004; Cohn 2011; Di Martino et al. 2020). El CVF es más común en gatos jóvenes que se encuentran en condiciones de albergues o en colonias callejeras, respecto a felinos que no tienen contacto con otros animales de su misma especie (Radford et al. 2007; Radford et al. 2009; Cohn 2011; Pereira et al. 2018; Walter et al. 2020). Los síntomas que pueden presentar los animales infectados con CVF incluyen: descarga nasal serosa o mucopurulenta, sialorrea, estornudos, tos, descarga ocular, conjuntivitis, queratitis, fiebre, inapetencia, diarrea; también pueden presentar úlceras a nivel de la lengua, encías, labios, mucosa oral y nariz de diferentes grados (Radford et al. 2007; Radford et al. 2009; Cohn 2011; Caringella et al. 2019). Estos síntomas son inespecíficos, ya que existen varios agentes que desarrollan la ETRS. Por otro lado, el síndrome de cojera se ha descrito en gatos infectados con calicivirus, en asociación con una vasculitis a nivel articular. Sin embargo, no se conoce claramente su patogenia (Addie et al. 2008; Radford et al. 2009; Cohn 2011; Berger et al. 2015; Hou et al. 2016; Pereira et al. 2018).
En cuanto al diagnóstico, hay que tener en cuenta que el calicivirus hace parte de la ETRS en gatos donde también se han definido por lo menos cuatro patógenos implicados: herpesvirus felino tipo 1 (FHV-1), Mycoplasmafelis, Chlamydophila felis y Bordetella bronchiseptica (Radford et al. 2009; Cohn 2011; Berger et al. 2015; Walter et al. 2020). La identificación de estos patógenos rara vez es realizada debido, principalmente, a las limitaciones económicas de los propietarios. No obstante, se pueden llevar a cabo hisopados conjuntivales, orales o nasales para la detección molecular mediante PCR para CVF, HVF-1 y C. felis (Walter et al. 2020).
Si bien el CVF se ha investigado en todo el mundo, en Colombia, de acuerdo con el conocimiento de los autores, no se ha descrito un estudio que brinde claridad frente a la frecuencia de presentación de calicivirus en el país. El objetivo de este estudio fue determinar la frecuencia de presentación del calicivirus felino en una población con sintomatología respiratoria en gatos de la ciudad de Medellín, Colombia, mediante detección viral por PCR, y de esta manera contribuir a un mayor conocimiento de la enfermedad en el país.
MATERIALES Y MÉTODOS
Tipo y localización de estudio
Se realizó un estudio descriptivo de corte transversal donde se incluyeron 64 gatos domésticos con sintomatología compatible con enfermedad del tracto respiratorio superior en el área urbana de la ciudad de Medellín, Antioquia, de enero a diciembre de 2020.
Población
Se seleccionaron, por conveniencia, 64 gatos procedentes de varias clínicas veterinarias de Medellín, de los cuales 36 eran hembras y 28 eran machos, de razas puras y mestizos, con edades que oscilaban entre 8 semanas y 5 años. Todos los gatos tenían la vacuna comercial que contenía la cepa F9, el 100% de los gatos estaba en casa (indoor); no se determinó el número de gatos por casa y solo se tuvo presente que estos evidenciaban sintomatología respiratoria (estornudos, descarga nasal, disnea (figura 1 a y b), lesiones oculares (conjuntivitis, descarga ocular, figura 1 c y d) o lesiones orales (úlceras orales, gingivales, palatinas, figura 1 e y f ). Los gatos fueron muestreados por veterinarios en clínicas privadas y consultorios veterinarios en Medellín, Colombia, en 2020.
Comité de ética
Todas las muestras analizadas fueron tomadas por médicos veterinarios de la ciudad de Medellín, en clínicas particulares, en las cuales los propietarios firmaron consentimiento informado, pues se trata de un método diagnóstico de pacientes felinos con cuadro respiratorio, las muestras fueron hisopados nasales, orales y oculares de pacientes clínicamente enfermos; no se experimentó con ningún paciente. Se siguieron los lineamientos de las leyes 576/2000, capitulo 5, artículo 76-82; capitulo 6, artículo 83 y 84/1989, sobre la experimentación animal, esta investigación fue una descripción de diagnóstico de la presencia de calicivirus felino como agente responsable en Colombia de la enfermedad respiratoria felina.
Toma de muestras
El muestreo se realizó mediante hisopado conjuntival/oral para posterior diagnóstico de laboratorio, las muestras se enviaron al laboratorio de referencia TestMol, Medellín, Colombia, en medios de transporte con albumina, a temperatura 2-8 °C. Solo se evaluaron pacientes que presentaban sintomatología compatible con infección por calicivirus, pacientes con conjuntivitis, ulceras en cavidad oral o signos respiratorios como rinorrea.
Procesamiento de las muestras para extracción de ARN
Los hisopos conjuntivales/orales se colocaron en 500 µL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 min y se centrifugaron a 3.000 x g durante 10 min. El sobrenadante se pasó a través de un filtro estéril de 0,22 µm.
Extracción ARN
Las extracciones de ARN se realizaron de inmediato después de la recolección, usando un kit basado en columnas Pure Link Spin-ADN genómico (Invitrogen®). La transcripción inversa se realizó utilizando cebadores aleatorios (Invitrogen®) y la enzima Superscript III (Invitrogen®) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Se procesaron 2 tipos de qPCR. Inicialmente una de 100pb, y a las muestras positivas se les montó una qPCR de 900 pb. En total se montaron 64 pruebas tamiz y 22 para la qPCR larga.
Amplificación del genoma
El ADNc se amplificó con los cebadores de PCR que se muestran en la tabla 1. La PCR se realizó en una mezcla de 50 µL que consta de 4 µL de ADNc molde, 2 µL de cebadores directos e inversos (10 mM), 25 µL de 2 x mezcla maestra Phanta Max y ddH2O. Los ciclos de temperatura de la PCR fueron los siguientes: un ciclo de 95 °C durante 3 min, 35 ciclos de 94 °C durante 30 s, hibridación a 55 °C durante 30 s, y alargamiento a 72 °C durante 3 min, y un ciclo de 72 °C durante 10 minutos. Los productos de la PCR se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% y tinción con M5 HiPure Gelred Plus (Me5 Technology Co., Ltd., Beijing, China). Las bandas se fotografiaron utilizando un sistema de documentación en gel SH-510 (Shenhua, Hangzhou, China).
Análisis estadístico
Se realizó una evaluación de frecuencia de calicivirus felino, tanto para las variables raza, sexo y edad, usando la siguiente formula (Walter et al. 2020):
Frecuencia = Número de gatos positivos a calicivirus/ Número total de gatos enfermos x 100
RESULTADOS
La frecuencia de presentación de calicivirus felino para gatos con sintomatología respiratoria analizados en la ciudad de Medellín fue de 34,37% (22/64) (tabla 2). La edad promedio de felinos evaluados es de 1,80 años (1-2 años); de los cuales fueron positivos 22 individuos, con una edad promedio de 1,35 años (1-2 años).
TABLA 2 Frecuencia de positividad según raza de felinos evaluados y total de individuos de la muestra
Fuente: elaboración propia.
Entre los gatos muestreados, 46 (71,8%) fueron mestizos, 9 (14%) eran de raza persa, 2 (3,21%) ruso azul, 2 (3,21%) siamés y 5 (7,8%) de diferentes razas con un individuo por cada una de ellas. De los gatos mestizos, el 46,87% fue positivo a CVF, con un porcentaje de positividad de 23,43% (15 felinos positivos de 64 muestreados), el mayor número de gatos positivos al virus (tabla 2).
La segunda raza que mostró mayor frecuencia fue la persa, con 3 felinos positivos a CVF (4,68%) de los 64 gatos evaluados; también la segunda raza más evaluada con 9/64. Luego continúan las razas ruso azul y siamés con un total de 2 individuos muestreados para CVF; los siamés tuvieron 1,56% de frecuencia de positividad al CVF (tabla 2).
En cuanto a la proporción por sexo, de los 64 gatos muestreados para diagnóstico por PCR 28 fueron machos y 36 hembras, 56,3% y 43,8%, respectivamente. Los gatos positivos a CVF se distribuyeron así; 13 machos (59,1%) y 9 hembras (40,9%), con una proporción 1,4:1 (tabla 3).
TABLA 3 Distribución respecto al sexo en gatos evaluados mediante RT-PCR para FCV
Fuente: elaboración propia.
Con respecto a la edad de los 64 gatos muestreados, el rango fue de 2 meses hasta los 8 años, con promedio de edad 1 año y 8 meses. La mayor proporción de gatos positivos tenía entre 1 y 2 años 9/22 (40, 91%), seguido por gatos entre 2 y 6 meses de edad 7/22 (31, 82%) (tabla 4).
DISCUSIÓN
El calicivirus felino es uno de los principales patógenos no zoonóticos asociados en la presentación de gingivoestomatitis crónica en gatos, y uno de los agentes causales de la ETRS. Conocer el estatus epidemiológico del CVF es importante para efectuar planes preventivos como la vacunación y evitar la exposición a gatos callejeros en zonas de alta prevalencia.
Este estudio es el primer reporte que evalúa la frecuencia de presentación de calicivirus felino en gatos con sintomatología respiratoria en Medellín, Colombia, usando PCR. Existen reportes de prevalencia en otros países, sin embargo, en Latinoamérica solo en Brasil se ha descrito la presentación de este virus a pesar de su alta frecuencia de diagnóstico en otros países. La prevalencia en los diferentes países varía dependiendo de varios factores como el tipo de población de gatos, la técnica usada, el número de animales muestreados, el estatus vacunal, entre otros. La frecuencia de calicivirus evaluada en Medellín fue del 34,3%, lo que concuerda con lo reportado en otros estudios (2,6%-52,7%) (Harbour et al. 1991; Sykes et al. 2001; Henzel et al. 2012; Hou et al. 2016; Afonso et al. 2017; Pereira et al. 2018).
A pesar de que los propietarios de los gatos reportaron haberlos vacunado con la cepa comercial F9, el 100% de los felinos desarrolló un cuadro respiratorio y ocular de moderado a severo; el 34,3% se atribuyó a calicivirus felino, lo cual indica una inadecuada respuesta inmunitaria frente al agente de campo. Al ser un virus ARN monocatenario de polaridad positiva, es altamente propenso a mutaciones que le pueden conferir una alta virulencia y por tanto la vacunación, al menos con la cepa F9, no resulta ser protectora ante el desarrollo de la ETRS (Hurley et al. 2004). El estatus vacunal de los gatos no impide que adquieran la enfermedad, desarrollen un cuadro clínico y tampoco que diseminen el virus (Radford et al. 2006). Dado lo anterior, es importante realizar una evaluación del estado inmunológico de los gatos que incluya la detección de más agentes infecciosos en gatos con sintomatología respiratoria en Colombia como Herpesvirus felino-1, Mycoplasma spp Chlamydophila spp, Bordetella spp, virus de la Influenza A y el reciente SARS-CoV-2, debido a que gatos que presentan ERTS usualmente cursan con más de un agente infeccioso o pueden tener una inadecuada respuesta inmunológica, algo que no se realizó en este estudio y otros países han desarrollado, lo que puede dar luz frente a las coinfecciones que generan las ETRS (Hernández Pinales 2020). Se hace importante instar en la secuenciación del genoma de los aislamientos de CVF para conocer cuáles son las variantes que circulan en el país y así implementar medidas preventivas con vacunaciones acordes con estas (Hernández Pinales 2020).
Los gatos menores a dos años representaron el 77,27% del total de felinos positivos a CVF (tabla 4), lo cual concuerda con descripciones previas de presentación de la enfermedad respecto a la edad (Binns et al. 2000; Beugnet et al. 2015; Becskei et al. 2016; Forster et al. 2021).
La principal raza evaluada fue la mestiza, no se puede asociar una presentación por raza, ya que el número de otras razas que presentaron sintomatología respiratoria fue limitado.
En este estudio se encontró una mayor presentación en gatos machos positivos a CVF (59,1%), frente a las hembras (40,9%), pese a que se evaluaron más hembras respecto a los machos, lo cual concuerda con otros estudios en los que gatos machos presentaron mayor frecuencia de CVF (Binns et al. 2000; Dinnage et al. 2009; Fernández et al. 2017).
Ninguno de los 64 gatos evaluados manifestó la forma sistémica virulenta de calicivirus (ESV- CVF) mediante cojeras, edema cutáneo o abortos, esto debido al número limitado de gatos muestreados, ya que no se contempló en los criterios de inclusión gatos con esa sintomatología, lo cual puede ser de interés para evaluar cómo lo han descrito otros investigadores (Radford et al. 2007; Caringella et al. 2019).
CONCLUSIONES
La calicivirosis felina es una enfermedad que viene incrementándose en Colombia, representa posiblemente más del 30% de las causas de cuadros respiratorios felinos y aunque existe vacunación para dicha enfermedad, la posible presencia de variantes europeas puede ser responsable de la presencia de la enfermedad incluso en gatos vacunados con cepas americanas (F9), por ende es importante determinar la genotipificación de las variantes en Colombia, para entender un poco más el comportamiento epidemiológico de CVF en el país.
