Artículo original breve

Determinación del potencial bactericida In vitro de un aislado nativo de Lactobacillus cassei frente E. coli^*

Determination of the in vitro bactericide potential of a native isolated of Lactobacillus cassei against E. coli

Determinação do potencial bactericida In vitro de um isolado nativo de Lactobacillus cassei frente E. coli

Luz Adriana Gutiérrez Ramírez¹, Elly Vanesa Acosta Otálvaro²

^* Investigación financiada con recursos del Fondo de Fomento a la Investigación de la Corporación Universitaria Lasallista Línea de investigación: Biotecnología de alimentos. Semillero INNOVA, Grupo de Investigación GRIAL.
¹ MSc en Biotecnología, Bióloga, profesora de la Corporación Universitaria Lasallista. Correspondencia: e-mail: lugutierrez@lasallista.edu.co.
² Investigadora del semillero INNOVA y estudiante de Ingeniería de Alimentos de la Corporación Universitaria Lasallista.

Recibido: 22/02/2008; fecha de aprobación: 22/09/2008

Resumen

Introducción Los probióticos son microorganismos vivos con gran capacidad antagónica contra otros microorganismos, es por esto el marcado interés para ser utilizado como bioconservantes naturales, disminuyendo en parte el uso de conservantes químicos en alimentos. Objetivo Determinar el efecto bactericida del extracto crudo del L.cassei nativo sobre el crecimiento in Vitro de bacterias patógenas como E.coli. Materiales y métodos. El extracto crudo se obtuvo cultivando el microorganismo en 20 ml de caldo MRS a 37°C por 72h anaeróbicmente. Los ensayos se realizaron en tres tiempos: 5, 10 y 15 días, el método utilizado para detectar la actividad del extracto fue el ensayo de difusión en pozos, el que presentara un halo de inhibición superior a 2mm se consideraba con actividad. Los resultados encontrados se compararon con los de una cepa de Lactobacillus plantarum de uso comercial con actividad bactericida frente a Escherichia coli. Resultados. Se encontró que L.cassei presentó actividad antagónica contra E.coli, pues la zonas de inhibición leídas como variable de respuesta fueron mayores de 2mm hasta en la dilucion10^-3 en los tres ensayos realizados en el tiempo, sin embargo en el día 15 la actividad bactericida del extracto disminuye considerablemente con respecto a la del día 5. Los análisis de Unidades de Actividad mostraron que el extracto de este aislado es activo aun en diluciones altas, lo cual significa que los extractos tiene actividad aun a muy pequeñas concentraciones. Conclusión. El aislado nativo de L.cassei produce sustancias antimicrobianas contra bacterias Gram negativa como E.coli pudiendo utilizarse probablemente como un bioconservante natural en alimentos.

Palabras clave: Probióticos. Prebióticos. Lactobacillus. Actividad bactericida. Nutracéutica.

Abstract

Introduction. Probiotics are living microorganisms with a great capacity against other microorganisms, this is why there is an interest in using them as natural bio-preservatives, reducing partially the use of chemical preservatives in food. Objective. To determine the bactericide effect of the raw extract of native L. cassei on the in Vitro growth of pathogenic bacteria, such as E.coli. Materials and methods. The raw extract was obtained by cultivating the microorganism in 20 ml of MRS breeding ground at 37°C Turing 72 h, anaerobically. The experiments were done in three periods of time: 5, 10 and 15 days. The method used to detect the activity of the extract was the experiment of diffusion in wells. Those that represented an inhibition halo above 2mm were considered as active. The results found were compared with those from a strain of Lactobacillus plantarum of for commercial use with a bactericide activity against Escherichia coli. Results. L.cassei represented hostile activity against E.coli, because the inhibition zones read as response variable were higher than 2mm until getting the 10^-3 dilution in the three experiments made. However, on day 15 the bactericide activity of the extract was considerably reduced when compared to that from day 5. The analysis of activity units showed that the extract from this isolated is active even in high dilutions, which means that the extracts are active even at very low concentrations. Conclusion. The native isolated of L.cassei produces antimicrobials against Gram negative bacteria, such as E.coli, being available for their possible use as natural bio preservatives in food.

Key words: Probiotics. Prebiotics. Lactobacillus. Bactericide activity. Nutraceutics.

Resumo

Introdução. Os probióticos são microorganismos vivos com grande capacidade antagônica contra outros microorganismos, é por isto o marcado interesse para ser utilizado como bio-conservantes naturais, diminuindo em parte o uso de conservantes químicos em alimentos. Objetivo. Determinar o efeito bactericida do extrato cru do L.cassei nativo sobre o crescimento in vitro de bactérias patogênicas como E.coli. Materiais e métodos. O extrato cru se obteve cultivando o microorganismo em 20 ml de caldo MRS a 37°C por 72h anaerobicamente. Os ensaios se realizaram em três tempos: 5, 10 e 15 dias, o método utilizado para detectar a atividade do extrato foi o ensaio de difusão em poços, o que apresentasse um halo de inibição superior a 2mm se considerava com atividade. Os resultados encontrados se compararam com os de uma cepa de Lactobacilus plantarum de uso comercial com atividade bactericida frente a Escherichia coli. Resultados. Encontrou-se que L.cassei apresentou atividade antagônica contra E.coli, pois a zonas de inibição lidas como variável de resposta foram maiores de 2mm até na dilucion10^-3 nos três ensaios realizados no tempo, no entanto no dia 15 a atividade bactericida do extrato diminui consideravelmente com respeito à do dia 5. As análises de Unidades de Atividade mostraram que o extrato deste isolado é ativo ainda em diluições altas, o qual significa que os extratos tem atividade ainda a muito pequenas concentrações. Conclusão. O isolado nativo de L.cassei produz substâncias antimicrobianas contra bactérias Gram negativa como E.coli podendo utilizar-se provavelmente como um bio-conservante natural em alimentos.

Palavras chaves: Pro-bióticos. Pré-bióticos. Lactobacilos. Atividade bactericida. Nutracéutica.

Introducción

En la actualidad, se ha generado un marcado interés por el consumo de alimentos con valor nutricional, y que proporcionen beneficios a la salud al prevenir enfermedades, mejorar la digestión y controlar el crecimiento de bacterias patógenas¹.

Las bacterias acido lácticas no solamente se han venido utilizando como cultivos iniciadores para la obtención de productos fermentados sino que sus metabolitos se han estado empleando como bioconservantes naturales en alimentos, algunos de los metabolitos empleados para tal fin se han denominado bacteriocinas; péptidos antimicrobianos de bajo peso molecular y su uso genera una alternativa natural para sustituir, al menos parcialmente el uso de agentes químicos².

La conservación de los alimentos y la prevención de la ocurrencia de Enfermedades de Transmisión Alimentaria (ETA), han motivado que el mundo industrial y el científico se interesen por conocer con mayor detalle el modo de acción de los probióticos y de algunos de sus metabolitos sobre los microorganismos patógenos.

En los países industrializados anualmente se reporta que el 30% de la población sufre de algún tipo de ETAs³, sólo en los Estados Unidos, se calcula aproximadamente 76 millones de casos; de los cuales 325.000 requieren hospitalización y 5.000 mueren debido a la presencia de microorganismos patógenos como Salmonella sp., Campylobacter sp., Escherichia coli Enterohemorrágica (O157H), Listeria monocytogenes y Vibrio cholerae, con un costo estimado de 35 billones de dólares, referidos como gastos médicos y pérdida de la productividad³. La transmisión de estos microorganismos patógenos está relacionada con el consumo de alimentos crudos o mal cocidos, ya sea pollo, carne, mariscos, o por productos lácteos, frutas y vegetales³.

Una solución a este problema sería el uso de las bacterias lácticas no sólo por su aporte probiótico sino por la producción de sustancias antimicrobianas, frente a un gran número de bacterias patógenas Gram positivas como Gram negativas. Actualmente, en los países desarrollados estas bacterias se están utilizando como conservantes naturales de alimentos; porque son considerados GRAS (Generally Recognized As Safe), y confieren al consumidor función nutracéutica.

Materiales y métodos

La investigación se llevó a cabo en los laboratorios de Biotecnología y Microbiología de la Corporación Universitaria Lasallista

Cepas bacterianas y cultivos. Las cepas de estudio E.coli, se obtuvo del Laboratorio de Microbiología de la Corporación Universitaria Lasallista y el aislado nativo de L.cassei de leches fermentadas cultivados en Agar MRS e incubados anaerobicámente a 30°C /72horas⁴

Producción del extracto. El aislado nativo de L.cassei fue cultivado en 20ml de caldo MRS a 37°C por 72h anaerobicámente, al cabo de este tiempo el caldo fermentado, se dividió en dos porciones en tubos estériles; una porción se precipitó y la otra correspondiente al sobrenadante se utilizó como extracto crudo; de la misma manera se reactivó la cepa comercial de Lactobacillus plantarum que fue utilizada como microorganismo control.

Evaluación de la actividad bactericida. Para determinara la actividad bactericida se empleó el ensayo de difusión en pozos con algunas modificaciones⁵ para lo cual se tomaron cajas de petri marcadas con el extracto y la cepa indicadora y se adicionaron de 10 a 12ml de agar MRS, después se procedía a hacer 4 pozos a una distancias de 4cm cada uno en la superficie del agar.

En cada pozo se adicionaban de 50 a 70µl del extracto, y se hacia el inóculo de la cepa indicadora, E.coli por el método de dilución en agua peptonada 0,1% p/v hasta obtener una dilución de 1^*10^-12, a partir de esta última dilución se retiraban 15ul y se mezclaban con 15ml de agar Tripticasa soya (Merck) semisólido (0.8% de agar agar), se agitaba y se adicionaban sobre la caja de agar MRS que contenía los extractos, formándose una doble capa, incubándose posteriormente a 37°C/48h.

Identificación de la cepa productora de sustancias bactericidas. La actividad bactericida de los extractos se detectaba por una zona clara de inhibición alrededor del pozo (halos de inhibición), se consideró como actividad inhibitoria la formación de un halo mayor de 2mm⁶.

Los ensayos se realizaron en tres tiempos: 5, 10 y 15 días, el extracto obtenido tanto para la cepa experimental como para el control se mantuvo en refrigeración durante los 15 días de evaluación los registros de la inhibición se realizaron durante dos meses. Las pruebas se realizaron por duplicado en cada ensayo.

Determinación de Unidades de Actividad. Las unidades de actividad se consideran como el reciproco de la dilución más alta de los extractos, probándose mediante esta, la optimización de la calidad del extracto de bacterias ácido lácticas frente a bacterias patógenas⁶.

Una porción del extracto centrifugado se diluyó hasta 3x10^-3 para determinar su actividad bactericida y comprobar que es capaz de controlar bacterias patógenas aun en bajas concentraciones.

Las unidades de actividad evaluadas fueron
1x10^-1= 10,56 UA
1/2x10^-2=50,8 UA
1/3x10^-3=333,33 UA

Resultados

Los extractos obtenidos de los aislados de L.cassei y L.plantarum mostraron una zona clara de inhibición en el ensayo de difusión en pozos, tal como lo muestra la foto 1, las medidas obtenidas fueron superiores a 2mm; los niveles de inhibición más altos se encontraron en la cepa comercial L.plantarum⁷ exceptuando en los ensayos realizados en diluciones muy altas.

Los datos observados en la grafica 1 de actividad bactericida muestra que los extractos son activos frente a las bacterias patógenas en casi todas las diluciones, excepto en 3/3E^-3 o 333.33UA de L.plantarum frente a E.coli. El extracto de L.cassei presenta una buena actividad antagónica al compararse con el blanco, y su actividad es buena cuando se utiliza sin diluir más que cuando se utiliza diluido hasta 10E^-3.

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