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INTRODUCCIÓN
A lo largo de los años, el uso excesivo de combustibles fósiles en diferentes sectores económicos ha creado un impacto negativo en el planeta. Un ejemplo claro es la acumulación de gases como dióxido de carbono y óxidos nitrosos incrementando el efecto invernadero. El sector del transporte es uno de los grandes contribuyentes a este problema y se ha propuesto un cambio de combustible como una solución: de fósiles a verdes. Estos combustibles verdes se pueden obtener a partir de procesos de transformación biológica como se hace con el etanol [1]o el biogás [2 ] y transformación química como el biodiesel ]3].
Tradicionalmente, el etanol se ha producido empleando jugo de caña de azúcar [4] y maíz [5]. Lastimosamente, la demanda de este combustible viene en aumento debido a la gran volatilidad del precio del petróleo, incrementando el consumo de las materias primas antes mencionadas, generando un riesgo sobre la seguridad alimentaria mundial. Por lo anterior, se han propuesto diferentes residuos agroindustriales como reemplazo de las materias primas convencionales. Entre los residuos explorados se pueden encontrar: bagazo de caña [6], rastrojo de maíz [7], paja de colza ]8 ], granos de destilación [9], paja del arroz [10], residuo de Chrysanthemum [11], paja de cebada [12], entre otros. La desventaja de emplear residuos agroindustriales radica en el hecho que estos ya son utilizados como materias primas para nuevas cadenas de producción, en sistemas de cogeneración y compostaje para producción de biogás o fertilización orgánica. Una segunda alternativa para obtener los azúcares reductores necesarios para la producción de etanol se basa en el empleo de cultivos energéticos como los pastos perennes. Diferentes pastos han sido explorados dependiendo de la ubicación geográfica, la condición agronómica, económica y meteorológica de cada país o región. En Estados Unidos, la mayoría de investigaciones se han centrado en estudiar el Panicum virgatum (switchgrass) [13], y en Europa, un híbrido de Miscanthus conocido como Miscanthus x giganteus [14]. En Suramérica, Brasil seleccionó luego de un proyecto de 10 años, a la especie Pannisetum purpureum (pasto elefante) como un pasto perenne potencial para la producción de etanol de segunda generación, sin descartar otras especies de pastos como Andropogon, Brachiaria and Paspalum atratum [15]. Por otro lado, en Colombia, solo se han realizado estudios empleando dos especies de Pennisetum: P. purpureum y pasto maralfalfa [16], siendo necesario evaluar otras especies para seleccionar la más promisoria. En este estudio, Panicum maximum (pasto guinea) fue el pasto perenne seleccionado debido a su resistencia a períodos de sequía y alta radiación solar, un sistema radicular de enorme cobertura, adaptabilidad a diferentes alturas, desde 0 hasta 1800 m.s.n.m., y alta producción de biomasa seca, entre 60-100 ton/ha/año [17].
La producción de etanol de segunda generación se basa en tres operaciones fundamentales: pretratamiento, hidrólisis enzimática y fermentación. A pesar de que muchos trabajos se han dedicado al estudio de este proceso de producción, aún existen dificultades y restricciones económicas para su implementación a gran escala, como los altos costos asociados al procesamiento de la biomasa lignocelulósica en el pretratamiento y la hidrólisis enzimática [18 ]. Por esto, se han concentrado esfuerzos para hacer un uso eficiente de la materia prima y lograr la intensificación de las diferentes etapas del proceso. Esta intensificación consiste en reducir la demanda energética de cada operación aprovechando la biomasa empleada, los efluentes y residuos [19]. Uno de los recursos para reducir los costos operacionales y favorecer la intensificación consiste en emplear una alta concentración de sólidos durante el pretratamiento. El pretratamiento con ácido sulfúrico diluido es uno de los que posee más ventajas al aumentar las velocidades de reacción, bajo costo y consumo de ácido, y no requerir sistemas de recuperación de ácido en grandes escalas de producción [20]. Adicionalmente al emplear este pretratamiento con alta concentración de sólidos es posible remover la xilosa constitutiva de la hemicelulosa presente en una mayor cantidad de biomasa lignocelulósica por lote incrementando la digestibilidad de la misma, facilitando así la degradación de celulosa a glucosa por parte de las enzimas presentes durante la hidrólisis enzimática.
Por lo anterior, el presente trabajo tuvo como objetivo estudiar el efecto de la concentración de ácido y concentración de sólidos sobre la biomasa lignocelulósica de Panicum maximum, en términos de recuperación de sólidos y digestibilidad empleando un pretratamiento con ácido sulfúrico diluido.
MÉTODO
Biomasa lignocelulósica
La biomasa lignocelulósica empleada fue pasto Guinea identificado por el nombre científico de Panicum maximum. En el cuadro 1, se encuentra la información referente al ecotipo y cosecha del material. La biomasa lignocelulósica se procesó en una picadora, logrando reducir el tamaño de los tallos a 5 ± 0,76 cm. El material se colocó en una estufa de secado a 60 ± 2oC por 48 horas para disminuir la humedad y evitar su deterioro. Posteriormente, se empleó un molino de cuchillas para alcanzar el tamaño final promedio del material (2 mm). El material seco y molido se almacenó a temperatura ambiente en recipientes tapa rosca herméticos completamente llenos.
Luego de la adecuación del material, se determinó el tamaño de partícula promedio de la biomasa empleando un análisis por tamizado [21]. Se utilizaron tamices estándar Tyler de malla No. 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 140, 170 y 230. La prueba de tamizado se realizó por triplicado. El tamaño de partícula promedio (diámetro medio) se calculó mediante la ecuación 1, donde 
es el diámetro medio de masa,
es la fracción másica y 
es el diámetro de partícula en el incremento determinado con base al diámetro promedio de las dos mallas consecutivas, por ejemplo, 30/40, 40/50, 50/60, etc. El diámetro de cada tamiz se obtuvo al observar la información consignada en cada uno de ellos.
Caracterización fisicoquímica del Panicum maximum
La caracterización fisicoquímica de la biomasa se realizó empleando las técnicas del National Renewable Energy Laboratory - NREL, analizando humedad, contenido de glucosa, xilosa, lignina ácida soluble e insoluble y ceniza [22].
Pretratamiento con ácido diluido
Luego de la adecuación física de la biomasa lignocelulósica, se determinó el desempeño del pretratamiento con ácido sulfúrico diluido evaluando la concentración de ácido y la concentración de sólidos con una posterior prueba de digestibilidad de la biomasa pretratada mediante una hidrólisis enzimática.
El ácido empleado en el pretratamiento fue ácido sulfúrico 95%. Para la evaluación del pretratamiento se emplearon tres concentraciones de ácido sulfúrico diluido (0,5; 1; 1,5% p/v) [23,24,25] y tres concentraciones de sólidos (5; 8,5; 12% p/p) [26]. La biomasa lignocelulósica y el ácido diluido se colocaron por gravimetría en función a una base de cálculo de 100 g (ácido sulfúrico diluido + biomasa seca) en recipientes de 250 mL tipo tapa rosca Boeco®. El pretratamiento se llevó a cabo en una autoclave automática, la temperatura fue de 130oC con un tiempo de residencia de 60 minutos [24]. El tiempo se contabilizó al alcanzarse la temperatura de pretratamiento. El diseño experimental fue central compuesto de cara centrada con puntos estrella, formado por 2 bloques y 2 réplicas para los puntos centrales por bloque soportado en el método de superficie de respuesta. En total se obtuvieron 20 experimentos incluyendo 4 repeticiones del punto central (cuadro 2). Cada bloque representó la repetición en el tiempo de cada experimento. El software Design-Expert ® versión 7, fue utilizado para la generación y análisis de varianza (ANOVA) del diseño experimental. A su vez, se generó un modelo cuadrático para la variable de respuesta (ecuación 2), recuperación de sólidos (%).
Cuadro 2 Diseño experimental para el pretratamiento con ácido diluido de P. maximum.
aCA, concentración de ácido; bCS, concentración de sólidos.
Donde, 
es el valor esperado de la variable de respuesta, 
es el intercepto del modelo, 
es la concentración de ácido, 
es la concentración de sólidos, 
es el coeficiente para la concentración de ácido, 
es el coeficiente para la concentración de sólidos, 
es el coeficiente para la interacción entre la concentración de ácido y sólidos, 
es el coeficiente para los efectos de segundo orden de la concentración de ácido y 
es el coeficiente para los efectos de segundo orden de la concentración de sólidos.
Luego del pretratamiento, se realizó una filtración al vacío empleando filtros de membrana previamente secados y pesados. Mediante este proceso se obtuvieron: una fracción líquida y una sólida. La fracción sólida fue llamada biomasa pretratada, se lavó en su totalidad con agua destilada y se secó en una estufa a 45oC hasta peso constante, determinando la recuperación de sólidos pretratados mediante la ecuación 3. Donde m1 es la masa inicial de biomasa seca sin pretratar (g) y m2 es la masa final de biomasa seca pretratada (g). La fracción líquida se recolectó y congeló a una temperatura de -8 ± 0,5oC para un posterior análisis de glucosa y xilosa por HPLC con el fin de realizar el balance de materia del pretratamiento.
Adicionalmente, para el análisis del pretratamiento se calcularon parámetros de proceso como: en la fracción sólida, XG, fracción másica de la glucosa en la biomasa pretratada, XX, fracción másica de la xilosa en la biomasa pretratada, y en la fracción líquida, CG, concentración de glucosa en el sobrenadante, PGP, porcentaje de glucosa liberada, CX, concentración de xilosa, PXP, porcentaje de xilosa liberada. Las ecuaciones empleadas son las reportadas por Castillo-Saldarriaga (2015).
Digestibilidad de la biomasa pretratada
Con el objetivo de evaluar la accesibilidad de las enzimas a la celulosa presente en la biomasa pretratada se realizó una prueba de digestibilidad. Para el desarrollo de la prueba, se empleó biomasa pretratada resultante de cada una de las condiciones evaluadas anteriormente. Cada biomasa pretratada fue sometida a una hidrólisis enzimática con una concentración de sólidos de 5% p/p empleando una solución tampón de citrato de sodio 50 mM y pH 4,8. Las enzimas utilizadas en la prueba fueron: un complejo de celulasas (NS22086; Lot # VCPI0006) y β-glucosidasas (NS22118; Lot # DCN00218) donadas por la empresa Novozymes A/S. Las enzimas presentaron una actividad de 1000 unidades de hidrolisis de biomasa (BHU)/g de mezcla y 250 unidades de celobioasa (CBU)/g de mezcla, respectivamente. Estas actividades enzimáticas se verificaron empleando el protocolo descrito por Sharma et al. (2016), presentando una variación menor al 5% respecto a lo reportado en las fichas técnicas.
Para la prueba de digestibilidad, se dosificó una actividad de 25 BHU/g de biomasa pretratada de celulasas y 0,27 CBU/g de biomasa pretratada de β-glucosidasas, limites superiores de dosificación de cada enzima según el fabricante. Como medio de soporte y temperatura para la hidrólisis enzimática se utilizó una solución tampón de citrato de sodio a 50 mM, pH 4,8 y 50oC, condiciones que garantizan la mejor actividad enzimática según la ficha técnica. La hidrólisis se llevó a cabo en recipientes de 50 mL tapa rosca Boeco®, con agitación magnética durante 48 horas. La concentración inicial de sólidos de la hidrólisis enzimática se ajustó dosificando solución tampón y biomasa pretratada por gravimetría respecto a una base total de 40 g (solución tampón + biomasa pretratada) y manteniéndose constante durante todo el proceso. Durante la hidrólisis se tomaron muestras de 250 µL de hidrolizado cada 12 horas para realizar controles de contaminación microbiana. Al finalizar la hidrólisis se evaluó la concentración de azúcares reductores (g/L) empleando un análisis estadístico similar al de la sección anterior.
RESULTADOS
Caracterización de la biomasa de Panicum maximum
La biomasa se secó en una estufa de secado a 105 ± 5oC por 5 horas. La humedad promedio de la biomasa fresca (pasto recién cosechado) fue de 76,73 ± 2,77%, lo que correspondió a una concentración de sólidos promedio de 23,27 ± 2,77%. Posteriormente, se realizó un análisis granulométrico del P. maximum seco y molido que se puede observar en la figura 1, donde se relaciona la fracción másica retenida y acumulada, respecto al diámetro de partícula medio.
Se observó que la biomasa empleada en los experimentos (72%), tenía un diámetro medio entre 0,1375 (100/120) y 0,5125 mm (30/40), con un diámetro de partícula promedio del pasto tamizado fue de 0,27 mm. Adicionalmente, la apariencia del P. maximum luego del proceso de molienda presentaba una gran heterogeneidad. Ray et al. (2013), evaluaron el efecto de dos tamaños de partícula promedio (6,35 y 2 mm) de biomasa de rastrojo de maíz sobre el rendimiento de celulosa y hemicelulosa de un pretratamiento con ácido sulfúrico diluido empleando dos concentraciones de sólidos, 3,3% p/p y 25% p/p. Adicionalmente, se identificó el posible efecto que podrían tener estos tamaños de partícula en un proceso de sacarificación y fermentación simultánea (SFS) con 20% p/p, encontrando que no existían diferencias significativas en ninguna de las variables de respuesta evaluadas al emplear diferentes tamaños de partícula [29]. Sin embargo, los tamaños de partícula promedio evaluados en el estudio anterior son relativamente grandes en comparación a otros reportes. Rabelo (2010), empleó biomasa de bagazo de caña con un tamaño de partícula promedio de 1,689 mm para estudiar el pretratamiento de hidróxido de calcio, peróxido de hidrógeno e hidrólisis enzimática con alta concentración de sólidos. Rojas (2011), estudió la posibilidad de producir azúcares fermentables empleando fibra prensada de palma con un tamaño de partícula promedio de 1 mm. Quevedo (2011), evaluó la degradación de residuos de crisantemo con un tamaño de partícula promedio de 0,38 mm para la producción de azúcares. De lo anterior se puede concluir que aún no existe un tamaño de partícula específico para evaluar las etapas de pretratamiento e hidrólisis enzimática sobre biomasa lignocelulósica. Adicionalmente, teniendo en cuenta que, al implementar el proceso de adecuación de biomasa a gran escala, no emplear una clasificación por tamaño de la biomasa podría disminuir costos de producción. Por lo anterior, se decidió emplear la biomasa heterogénea proveniente del proceso de molienda sin realizar una exclusión por tamaño.
Para determinar el contenido de celulosa y hemicelulosa a partir de glucosa y xilosa, respectivamente, se emplearon las ecuaciones determinadas por Mateus (2011). La composición de la biomasa de P. maximum fue (% p/p en base seca): 31,6 ± 3,2 para glucosa; 21,9 ± 0,1 para xilosa; 24,9 ± 1,3 para lignina ácida insoluble; 0,5 ± 0,1 para lignina ácida soluble; 8 ± 0,4 para ceniza; 13,1 ± 0,6 para otros componentes. La relación de glucosa respecto a xilosa fue de 31,6/21,9 (1,44). El contenido de celulosa fue de 28,4 ± 2,9% p/p para la biomasa de P. maximum. Para las condiciones del método analítico empleado, se presentó un sobreposicionamiento de picos cromatográficos y poca resolución de arabinosa, galactosa y manosa por lo cual solo se cuantificó el contenido de xilosa, siendo la única variable empleada para determinar la concentración de hemicelulosa cuyo valor fue de 19,3 ± 0,09% p/p. La relación de celulosa respecto a hemicelulosa fue de 28,4/19,3 (1,47). La composición de P. maximum se comparó con dos variedades de gramíneas: switchgrass (Panicum virgatum) tipo Alamo, tipo Shawnee y tipo Dacotah, y Miscanthus x giganteus (figura 2).
El contenido de celulosa de P. maximum fue similar al switchgrass variedad Alamo con 32% p/p y menor al switchgrass variedad Dacotah y Miscanthus con 35% p/p y 42% p/p, respectivamente. No se encontraron grandes diferencias entre el contenido de hemicelulosa y lignina de los diferentes pastos. Las desviaciones promedio de contenido de hemicelulosa y lignina correspondieron a 1,26% p/p y 2,05% p/p. El contenido de ceniza más alto correspondió al P. maximum con un valor de 8% p/p. Para las tres variedades de switchgrass, el contenido de ceniza fue menor al 5% p/p [35], mientras que para el Miscanthus fue menor al 3% p/p [34]. En la ceniza quedan atrapados la mayor cantidad de cationes básicos presentes en la biomasa lignocelulósica [17]. Por ejemplo, en otros tipos de biomasa lignocelulósica como la madera blanda (softwood) las concentraciones de cationes básicos son: 22,4 - 28,5% p/p, Ca2+; 12,4 - 9,8% p/p, K+; 4,3 - 2,8% p/p, Mg2+, mientras que para la madera dura (hardwood): 19 - 27,1% p/p, Ca2+; 12,2 - 20,4% p/p, K+; 2,2 - 3,6% p/p, Mg2+ [36]. Los cationes tienden a neutralizar una proporción del ácido sulfúrico empleado en algunos pretratamientos de biomasa para producción de etanol [17]. La propiedad de neutralizar una fracción del ácido se conoce como capacidad neutralizante (CN). Para este estudio, el contenido de ceniza del P. maximum no se consideró crítico.
Evaluación del pretratamiento
En el cuadro 3, se encuentran los resultados del análisis realizado a las fracciones sólidas y liquidas de cada uno de los experimentos llevados a cabo para el análisis del pretratamiento.
Cuadro 3 Resultados de los ensayos de pretratamiento de Panicum maximum.
Fracción sólida: RS, recuperación de sólidos; AR, azúcares reductores;
, fracción másica de glucosa; 
, fracción másica de xilosa. Fracción líquida: CG, concentración de glucosa; PGP, porcentaje de glucosa liberada; CX, concentración de xilosa, PXP, porcentaje de xilosa liberada.
Fracción sólida del pretratamiento
Durante el pretratamiento con ácido diluido se determinaron las variables de respuesta: recuperación de sólidos (%), fracción másica de glucosa, fracción másica de xilosa , en términos de celulosa y hemicelulosa equivalente, y digestibilidad de la biomasa pretratada luego de una hidrólisis enzimática de 48 horas por medio de la concentración de azúcares reductores (g/L). En términos de fracción másica de la biomasa pretratada obtenida en las diferentes condiciones evaluadas, la fracción másica de glucosa presentó valores de 0,43 y 0,53 g glucosa/g biomasa pretratada, más altos respecto a la biomasa sin tratar, 0,316 g glucosa/g biomasa. Estos resultados, estuvieron acorde a lo esperado debido a la pequeña cantidad de celulosa solubilizada en forma de glucosa durante el pretratamiento con ácido diluido. Se observó un efecto menos intenso cuando la concentración de sólidos se incrementó al mantener la concentración de ácido constante. Es decir, la fracción másica de glucosa equivalente a celulosa se redujo mientras que la fracción másica de xilosa equivalente a hemicelulosa aumentó. Este efecto pudo presentarse gracias a la capacidad neutralizante (CN) de la biomasa y su humectación. La incidencia de esta capacidad neutralizante se incrementó al aumentar la concentración de sólidos y disminuyó la degradación de hemicelulosa. Para determinar la capacidad neutralizante del Panicum maximum, se colocó una muestra de pasto en una solución de 0,5 %p/v de ácido sulfúrico. El pH de la solución de ácido se midió antes y después de agregar el pasto. La diferencia de pH se empleó para calcular la capacidad neutralizante según Esteghlalian et al. (1997). Para el Panicum maximum, la capacidad neutralizante fue de 24,28 ± 2,4 mg H2SO4/g de biomasa seca. De acuerdo con lo reportado por Castro et al. (2011), la CN del P. maximum fue similar a la de Panicum virgatum (16,7 mg H2SO4/g de biomasa seca), álamo (25,8 mg H2SO4/ g de biomasa seca) y a la paja de canola (19,7 mg H2SO4/ g de biomasa seca), y menor al rastrojo de maíz (43,7 mg H2SO4/g de biomasa seca) [37]. La diferencia de capacidad neutralizante de las dos plantas perennes, P. maximum y P. virgatum, se podría explicar con el contenido de ceniza como se mencionó anteriormente.
Recuperación de sólidos
Para la recuperación de sólidos (RS) se desarrolló el siguiente modelo cuadrático a partir de los datos obtenidos:
Donde,
es la concentración de ácido sulfúrico (% p/v) y 
es la concentración de sólidos (% p/p). El valor F del modelo fue de 10,47, lo que implica que es significativo y solo existe 2,05% de probabilidad de alteración por ruido. La falta de ajuste del modelo fue no significativa, con valor F de 31,48 y valor P de 0,1301, por lo tanto, el modelo puede usarse para predecir el comportamiento de la recuperación de sólidos en los ensayos de pretratamiento bajo las condiciones evaluadas. El coeficiente de determinación (R2) fue de 0,9249 a 95% de confianza, garantizando el ajuste del modelo.
De acuerdo con el cuadro 3, la recuperación de sólidos presentó valores entre 55 y 74%, dependiendo de la condición del pretratamiento. Li et al. (2010), realizaron un pretratamiento sobre switchgrass (Panicum virgatum) con una concentración de sólidos de 1,2% p/p empleando ácido sulfúrico diluido, 3% p/p a una temperatura de 160oC por 20 minutos, logrando recuperar 59,3% de sólidos. Por otro lado, Cheng et al. (2010), estudiaron dos pretratamientos alcalinos sobre paja de arroz: (1) pretratamiento con hidróxido de calcio a una temperatura de 95oC con una concentración de paja de arroz de 10% p/p y una dosis de base de 0, 5 y 10% p/p respecto a la biomasa, y (2) pretratamiento con hidróxido de sodio a una temperatura de 55oC con una concentración de 20% p/p y una dosis de base de 0, 2 y 4% p/p respecto a la biomasa. En ambos casos la recuperación de sólidos fue superior al 80%. Mateus (2011), evaluó un pretratamiento ácido de una gramínea conocida como Pennisetum sp., a una concentración de ácido de 0,8; 1,2 y 2% p/p, y unas temperaturas de 110oC hasta 190oC, manteniendo una concentración de sólidos de 15% p/p, logrando una recuperación de sólidos de un 47,3 a un 65,5%. Los valores de recuperación de sólidos reportados por este trabajo coinciden con lo especificado por otros autores que han trabajado con otras gramíneas como se observó anteriormente (figura 3).
Figura 3 Contorno de superficie de respuesta para la recuperación de sólidos de acuerdo con el modelo.
La diferencia de recuperación de sólidos en los diferentes pretratamientos y especialmente entre los ácidos y los básicos es su selectividad hacia un componente de la biomasa. Los pretratamientos ácidos son selectivos a la hemicelulosa, mientras que los pretratamientos básicos lo son a la lignina, al encontrarse esta última en menor proporción en la mayoría de las diferentes especies de biomasa lignocelulósica, la recuperación de sólidos cuando se realiza este tipo de pretratamientos puede ser mayor. Ambos factores experimentales, concentración de ácido y concentración de sólidos, tuvieron influencia sobre la recuperación de sólidos, donde la concentración de ácido tuvo un efecto negativo sobre la recuperación de sólidos (valor P: 0,0050), mientras que la concentración de sólidos presentó un efecto positivo (valor P: 0,0256). Por ejemplo, cuando la concentración de ácido se incrementó de 0,5% p/v hasta 1,5% p/v a una concentración de sólidos constante de 8,5% p/p, la recuperación de sólidos disminuyó 70 y 56 %, respectivamente. Esta pérdida de masa se atribuye a la degradación de diferentes componentes de la biomasa como hemicelulosa (en especial xilosa), lignina y otros extractos, dependiendo del pretratamiento seleccionado y las condiciones. Esta tendencia también fue evidenciada en los ensayos de Mateus (2011), al incrementar la concentración de ácido de 0,8% p/p a 2% p/p manteniendo una temperatura y concentración de sólidos constante de 130oC y 15% p/p, la recuperación se redujo de 61,6% a 56,2%.
De acuerdo con los resultados experimentales, la máxima recuperación de sólidos fue de 73%, alcanzada a una concentración de ácido de 0,5% p/v y 12% p/p de concentración de sólidos. A pesar de ser la mejor condición para la recuperación de sólidos, la fracción másica de glucosa de la biomasa pretratada fue la más baja, 0,43 ± 0,01, y la fracción de xilosa más alta, con 0,29 ± 0,01, posiblemente por el poco efecto del nivel inferior de concentración de ácido evaluado sobre la hemicelulosa presente en la biomasa.
Prueba de digestibilidad
La prueba de digestibilidad de la biomasa pretratada consistió en realizar una hidrólisis enzimática con una concentración de sólidos de 5% p/p, manteniendo constante el tiempo de hidrólisis, pH de la solución tampón y la dosis de enzimas, determinando la concentración de azúcares reductores totales (g/L). Esta prueba se puede evaluar de forma directa la efectividad del pretratamiento sobre la biomasa. El modelo cuadrático desarrollado a partir de los datos obtenidos fue:
El modelo presentó un valor F de 9,81. Por otro lado, la falta de ajuste del modelo fue no significativa, con valor F de 26,83 y un valor P de 0,1408. El coeficiente de determinación (R2) fue de 0,8864 a 95% de confianza, garantizando el ajuste del modelo. Al emplear una concentración de ácido de 0,5% p/v, se observó una gran variación en la respuesta de azúcares reductores, efecto contrario al que se evidenció con la mayor concentración de ácido 1,5% p/v, donde no existieron diferencias significativas en la respuesta. Schell et al. (2003), evaluaron la conversión de celulosa a glucosa durante una hidrólisis enzimática de biomasa de paja de maíz pretratada con ácido sulfúrico diluido a diferentes concentraciones de ácido, observando un incremento en la conversión de 60 a 87% cuando se incrementaba la concentración de ácido en el pretratamiento de 0,5 a 1,4% p/p. Concentraciones más severas en el pretratamiento aumentan la accesibilidad de las enzimas a la celulosa presente incrementando la porosidad de la biomasa y disminuyendo la cristalinidad [23].
La mayor concentración de azúcares reductores fue de 19 g/L a una concentración de ácido de 1,5% p/v y concentración de sólidos de 12% p/p. Para la hidrólisis enzimática, los factores experimentales presentaron un efecto opuesto respecto a lo que se evidenció con la recuperación de sólidos. La concentración de ácido (valor P: 0,0077) tuvo un efecto positivo sobre la concentración de azúcares reductores, y la concentración de sólidos (valor P: 0,0183) una influencia negativa. Por ejemplo, cuando la concentración de sólidos se incrementó de 5% p/p a 12% p/p a una concentración de ácido constante, 0,5% p/v, la concentración de azúcares reductores de la hidrólisis enzimática disminuyó de 16 g/L a 11 g/L. No se presentaron diferencias significativas en la concentración de azúcares reductores cuando se evaluaron las concentraciones de sólidos de 8,5 %p/p y 12% p/p a una concentración de ácido de 1% p/v (figura 4).
Figura 4 Contorno de superficie de respuesta para la concentración de azúcares reductores de acuerdo con el modelo.
El mismo comportamiento se observó al emplear una concentración de ácido de 1,5% p/v bajo las concentraciones de sólidos antes mencionadas. Esta respuesta pudo haberse presentado a causa de un fenómeno de inhibición por sustrato (celobiosa) de las β-glucosidasas presentes durante la hidrólisis enzimática.
CONCLUSIONES
La biomasa lignocelulósica de pasto guinea (Panicum maximum) ecotipo CIAT 36000 con un tiempo de corte de 6 meses sembrado en Villavicencio (Colombia) presentó una composición (% p/p) de 28,4% de celulosa, 19,3% de hemicelulosa, 25,4% de lignina y 8% de ceniza. Con una composición de 47,7% de carbohidratos estructurales, el pasto P. maximum presenta un gran potencial para la producción de etanol, sin embargo, se debe tener en cuenta el alto contenido de ceniza para la correcta selección del pretratamiento y sus condiciones de operación.
Cada una de las variables experimentales del pretratamiento con ácido sulfúrico diluido, presentaron un efecto sobre las variables de respuesta. La concentración de sólidos tuvo un efecto positivo para la recuperación de sólidos pretratados, mientras que la concentración de ácido tuvo un efecto positivo sobre la conversión de celulosa a glucosa, evaluada en términos de digestibilidad de la biomasa pretratada.
Con un pretratamiento de ácido sulfúrico diluido a 1,5% p/v y 12% p/p de concentración de sólidos a 130oC durante 60 minutos, se logró recuperar el 58% de sólidos y obtener una concentración de azúcares reductores de 16 g/L luego de una hidrólisis enzimática con una concentración de sólidos pretratados de 5% p/p.
