La gran mayoría de las personas afectadas por la enfermedad de Chagas desarrollan anticuerpos específicos contra Trypanosoma cruzi. En la etapa inicial de la infección se producen anticuerpos IgM, que son reemplazados por anticuerpos IgG a medida que progresa la enfermedad 1.
Las manifestaciones clínicas de la enfermedad en su etapa inicial pueden ser muy leves y atípicas, y producir solamente malestar general, motivo por el cual con frecuencia la enfermedad no se detecta en su fase aguda.
La proteína SAPA (Shed Acute Phase Antigen) se expresa principalmente en la forma infectiva de T. cruzi, lo que produce una temprana y fuerte reacción de la inmunoglobulina G después de la infección, la cual disminuye con el avance de la enfermedad 2. Los anticuerpos contra la SAPA están presentes fundamentalmente en el suero de pacientes en la fase aguda y en aquellos que adquieren la enfermedad de forma congénita 3-5. Además, la actividad trans-sialidasa de la molécula implicada en la invasión del parásito no ha sido detectada en T. rangeli, Leishmania spp. ni Plasmodium spp., parásitos que comparten la distribución geográfica de T. cruzi6,7. Por estas razones, es importante el uso de este antígeno en la fase sólida del UMELISA CHAGAS®, ya que permitiría la detección de anticuerpos en la infección temprana y evitaría reacciones inespecíficas con otros parásitos.
El antígeno TSA (Trypomastigote Surface Antigen) es uno de los blancos de los linfocitos T citotóxicos CD8+ en la infección humana y se caracteriza por tener en su secuencia hasta cuatro copias de un motivo de aminoácidos muy conservado en neuraminidasas bacterianas 8,9. En diversos estudios se ha reportado el uso de la proteína TSA para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas, con buenos resultados en términos de sensibilidad y especificidad.
El UMELISA CHAGAS® es una prueba inmunoenzimática indirecta en la cual la fase sólida está constituida por placas de tiras recubiertas con tres péptidos sintéticos monoméricos, el P-17, el P-18 y el C-12, correspondientes a regiones inmunodominantes de la membrana del parásito. Con la incorporación de los monómeros SAPA y TSA, así como la sustitución de los monómeros P-17 y C-12 por el quimérico Q-5 formado por estos, se pretende mejorar de forma cuantitativa los indicadores de sensibilidad, especificidad, precisión y eficacia que determinan el buen desempeño o funcionamiento de la prueba con una mayor representación de epítopos inmunodominantes de T. cruzi.
El propósito del estudio fue evaluar el UMELISA CHAGAS® con la incorporación de nuevos péptidos monoméricos y quiméricos representativos de diferentes regiones de T. cruzi.
Materiales y métodos
Obtención de los péptidos sintéticos
Todos los péptidos se obtuvieron mediante la síntesis química en fase sólida descrita por Merrifield en 1963, siguiendo la estrategia tercbutiloxicarbonilo (BocJ en bolsas de polipropileno 10-12. Se sintetizaron tres péptidos: el péptido quimérico Q5, formado por repeticiones de los péptidos monoméricos P-17 y C-12 representativos de epítopos inmunodominantes de la membrana de T. cruzi, que son los utilizados en el UMELISA CHAGAS® actual; el monómero SA-15, correspondiente a la región más antigénica de la proteína SAPA del parásito, y el péptido monomérico TSA-E3, que codifica para una parte del antígeno de superficie del tripomastigote.
Muestras utilizadas en la evaluación
Se emplearon las siguientes: muestras de suero presuntamente negativas procedentes de donantes de sangre cubanos sanos del Banco Provincial de Sangre de La Habana (n=896); muestras de suero positivas (n=441) confirmadas por inmunofluorescencia indirecta (IFI) provenientes de diferentes países endémicos de la enfermedad de Chagas; muestras de suero negativas para la enfermedad de Chagas provenientes de zonas endémicas (n=591) evaluadas por IFI, y muestras de suero negativas para la enfermedad de Chagas y positivas para otras enfermedades que pudieran interferir en la prueba. Todas las muestras se evaluaron con las pruebas diagnósticas SUMA® (UMELISA HCV, UMELOSA HCV UMELISA HBsAg PLUS, HBsAg confirmatory test, UMELISA HCV UMELISA Dengue IgM PLUS) según correspondiera.
Asimismo, se emplearon muestras de pacientes con hepatitis C (n=8), de individuos vacunados contra la hepatitis B (n=16), de pacientes con dengue (IgM) (n=12), de pacientes con hepatitis B (n=16), de suero positivas para el HTLV (n=16), y de pacientes en hemodiálisis atendidos en el Hospital Miguel Enríquez de La Habana (n=18).
Se utilizaron dos paneles comerciales: el de desempeño de título mixto anti-Trypanosoma cruzi (Chagas) PMT 204 (n=21) (Laboratorios Lincon, S.A., México), y el de serconversión de Chagas (I cruzi) AccuVert™ (0615-0038) (n=10) (Laboratorios Lincon, S.A., México).
Características evaluadas de la prueba
Se evaluaron la sensibilidad y la especificidad clínica y analítica; se hizo la prueba de concordancia utilizando el índice kappa (K), así como un estudio de precisión mediante la determinación de la reproducibilidad y la eficacia de la prueba. Para el cálculo de estos indicadores, se elaboró una tabla de contingencia.
Especificidad y sensibilidad clínicas. La especificidad clínica se expresó como el porcentaje de negatividad en muestras en las que el analito de interés estuviera ausente y se calculó con los valores verdaderos negativos divididos por la suma de los verdaderos negativos más los falsos positivos 13. La sensibilidad clínica se expresó como el porcentaje de positividad en muestras en las que el analito de interés estuviera presente y se calculó como los valores verdaderos positivos divididos por la suma de los verdaderos positivos y los falsos negativos 13.
Especificidad analítica. El grado para distinguir entre el analito de interés y otros componentes en la muestra 13 se calculó evaluando muestras positivas para otras enfermedades que pudieran interferir en la prueba.
Estudios de concordancia
La concordancia entre los diferentes métodos de referencia y el UMELISA CHAGAS® frente a un mismo panel de muestras, se determinó mediante el índice de concordancia kappa (K), cuyo valor mayor de 0,6 denota una elevada concordancia 13 (cuadro 1).
Eficacia del ensayo
La capacidad de la prueba para detectar correctamente todos los positivos y negativos, se calculó como la suma de los valores verdaderos positivos más los verdaderos negativos divididos por la suma de los verdaderos positivos y los falsos positivos más los falsos negativos y los verdaderos negativos 13.
Precisión
Esta se calculó en términos de reproducibilidad al determinar el grado de concordancia entre los resultados de una serie de réplicas (aproximadamente 20) de una misma muestra en diferentes días. Se analizaron dos muestras positivas en el estudio con grados de positividad alto (PA) y bajo (PB), una muestra falsa positiva (FN) y una negativa (N).
Procedimiento
En la evaluación se utilizó una prueba UMELISA indirecta con reactivos certificados del UMELISA CHAGAS® y el equipamiento de la tecnología SUMA® (14-16. Como referencias se emplearon las pruebas comerciales Bioelisa Chagas® (BIOKIT, España) 17, Chagatest ELISA recombinante®, v. 4.0 (Wiener Lab, Argentina), Chagatest HAI® (Wiener Lab, Argentina) 18 y SD BIOLINE CHAGAS Ab Rapid® (Standard Diagnostics Inc., Korea) 19. Las muestras se consideraron positivas cuando resultaron reactivas en alguna de las pruebas de referencia.
Análisis e interpretación de los resultados
En el análisis e interpretación de los resultados con un nivel de confianza de 95%, se utilizó el sistema Stripe Reader Software™, versión 9.0, para la automatización del trabajo con los lectores de tiras y estuches UMELISA de la tecnología SUMA® (Cuba) 14-16) y el programa para el análisis epidemiológico de datos tabulados Epidat, versión 3.1 (España). Las muestras se clasificaron en verdaderos positivos y falsos negativos tomando como referencia el resultado de las pruebas comerciales.
Consideraciones éticas
El estudio cumplió con los principios establecidos en la Declaración de Helsinki "Recomendaciones que guían a los médicos en la investigación biomédica con seres humanos" adoptada por la XVIII Asamblea Médica Mundial (Helsinki, Finlandia, junio de 1964) y sus sucesivas enmiendas, y fue aprobado por el comité de ética de la institución en la que se llevó a cabo.
Resultados
Sensibilidad y especificidad
Se evaluaron 1.928 muestras de suero, de las cuales 10 resultaron falsas positivas y 10 falsas negativas con respecto a la prueba de referencia Chagatest HAI®, para 97,73 % (IC95% 96,23-99,24) y 99,33 % (IC95% 98,8899,78) de sensibilidad y especificidad clínicas, respectivamente. La especificidad analítica fue de 100 %.
Estudio de concordancia
La prueba de concordancia con el índice kappa (K) resultó ser de 0,97 (IC95% 95-98), es decir, una muy buena concordancia (cuadro 2).
Discusión
El desarrollo y la producción de antígenos naturales, recombinantes y sintéticos para el inmunodiagnóstico de la enfermedad de Chagas, constituyen el objetivo fundamental de varios trabajos de investigación. Sin embargo, en la actualidad los péptidos sintéticos se utilizan ampliamente por las ventajas que significan en las pruebas diagnósticas en que se utilizan 12.
El uso de péptidos sintéticos como antígenos en el inmunodiagnóstico, los cuales se diseñan para obtener una prueba que garantice resultados con gran sensibilidad y especificidad, constituye una solución al problema del diagnóstico serológico de la enfermedad de Chagas 12,20. Entre los péptidos sintéticos, los quiméricos permiten "simular" estructuras de la proteína nativa en algunas ocasiones. Por ello, en el presente estudio se sintetizaron péptidos quiméricos con estas características no descritos por otros investigadores, con lo cual nuestro grupo de trabajo obtuvo el certificado de autor de invención 21.
En la selección de las secuencias aminoacídicas para el diseño del péptido quimérico, se tuvieron en cuenta los resultados de los estudios de los péptidos monoméricos descritos en la literatura y los obtenidos por nosotros en el laboratorio 22.
El antígeno SAPA se ha propuesto para el diagnóstico temprano de la enfermedad de Chagas debido a que los anticuerpos contra este antígeno están presentes fundamentalmente en el suero de pacientes en la fase aguda y en aquellos que adquirieron la enfermedad de forma congénita 3-5.
En varios estudios se ha reportado el uso de la proteína TSA para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas, con buenos resultados en términos de sensibilidad y especificidad. La TSA es uno de los blancos de los linfocitos T citotóxicos CD8+ en la infección humana y se caracteriza por tener en su secuencia hasta cuatro copias de un motivo de aminoácidos muy conservado en neuraminidasas bacterianas 8,9.
Sensibilidad y especificidad clínicas
El porcentaje de sensibilidad (97,73 %) del UMELISA CHAGAS® con la incorporación de estos antígenos en la fase sólida, fue similar al reportado por investigadores colombianos con los estuches comerciales Bioelisa CHAGAS®, Chagatest ELISA recombinante®, versión 3.0, Chagatest HAI® y SD BIOLINE CHAGAS Ab Rapid® en su estudio de comparación de la capacidad diagnóstica de siete métodos de determinación de la infección por T. cruzi en pacientes con enfermedad de Chagas crónica, en el cual obtuvieron valores de sensibilidad entre 95 y 98 % 23. En evaluaciones del kit ELISA Chagas IICS®, versión 1 24,25, se reportaron resultados similares al obtenido por nuestro grupo de trabajo con la nueva modificación de la fase sólida.
Los resultados discordantes del presente estudio pudieran deberse a dos posibles causas: los distintos tipos de antígenos y principios utilizados en las pruebas de referencia 26 y la composición del conjugado que contiene anti-IgM además de anti-IgG humana, que puede generar falsos positivos por su baja especificidad 27.
Uno de los usos más importantes de las pruebas diagnósticas serológicas es en las zonas endémicas, donde estas deben discriminar a los individuos infectados de aquellos que, sin estarlo, pueden tener otras condiciones que generen falsos positivos. Para determinar la especificidad clínica, se evaluaron muestras negativas provenientes de regiones endémicas de la enfermedad y muestras de donantes cubanos de sangre supuestamente sanos, dado que la enfermedad no existe hoy en Cuba. La especificidad del UMELISA CHAGAS® fue de 99,33 % (IC95% 98,88-99,78) y en otras pruebas se han reportado resultados similares 24-27.
La especificidad analítica, parámetro que depende del principio de la prueba y del material que se investiga, resultó ser del 100 %, lo que indica que la incorporación de los nuevos péptidos sintéticos en el UMELISA CHAGAS® permite detectar correctamente el analito de interés sin interferencia de ningún otro compuesto semejante.
El estudio de concordancia utilizando el índice kappa presenta diversas ventajas, destacándose su simpleza logística, la sencillez del análisis estadístico y una amplia aplicabilidad en la evaluación de métodos diferentes 28. En la práctica, cualquier valor de kappa mayor de 0,6 denota una buena concordancia. Un problema del uso de este índice es que sus valores dependen de la prevalencia de las muestras de cada categoría, lo que posibilita la comparación entre los diferentes índices utilizados en los estudios 13. En este caso, se obtuvo un valor de kappa de 0,97, lo que refleja muy buena concordancia entre el UMELISA CHAGAS® con los nuevos péptidos sintéticos incorporados y las diferentes pruebas de referencia empleadas. En estudios sobre el desempeño del kit ELISA Chagas IICS®, versión 1, también se obtuvo una muy buena concordancia 24.
La eficacia o probabilidad de que un individuo sea clasificado correctamente por la prueba alcanzará su valor óptimo con aquella técnica que no arroje falsos resultados positivos y negativos 13. En el presente estudio, el UMELISA CHAGAS® con la nueva modificación en su fase sólida obtuvo una eficacia de 98,96 %, con 10 muestras falsas positivas y 10 muestras falsas negativas. Las posibles explicaciones para los resultados falsamente negativos y positivos incluyen la presencia de diferentes antígenos (lisado natural, proteínas recombinantes y péptidos sintéticos) en las fases sólidas y la diversidad de metodologías empleadas en las pruebas de referencia 23.
Las principales limitaciones del estudio fueron la dificultad para adquirir muestras caracterizadas en las tres etapas de la enfermedad y las requeridas para determinar la reactividad cruzada con parásitos en estrecha relación filogenética con T. cruzi, así como las pruebas de referencia para una segunda evaluación de las muestras discordantes.
Los resultados de la evaluación del UMELISA CHAGAS® con la incorporación de nuevos péptidos monoméricos y quiméricos representativos de diferentes regiones del parásito, demostraron su adecuado desempeño en la detección de anticuerpos contra T. cruzi en países endémicos y no endémicos para la enfermedad de Chagas. Estos resultados permiten recomendar su uso para el inmunodiagnóstico, la certiicación de sangre y la vigilancia epidemiológica en países endémicos y no endémicos con población de alto riesgo, así como para incorporar péptidos representativos de otras regiones inmunodominantes del parásito.