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Revista Colombiana de Entomología

Print version ISSN 0120-0488

Rev. Colomb. Entomol. vol.30 no.2 Bogotá Jul./Dec. 2004

 

Evaluacion de la actividad larvicida de extractos polares y no polares de acetogeninas de Annona muricata sobre larvas de Aedes aegypti y Anopheles albimanus (Diptera: Culicidae)

Evaluation of larvicidal activity of polar and nonpolar extracts from acetogenins of Annona muricata on Aedes aegypti and Anopheles albimanus larvae (Diptera: Culicidae)

CARLOS ANDRES MORALES1, RANULFO GONZALEZ2, RAUL ARAGON3

1 Biologo. Universidad del Valle. E-mail: carmorales72@hotmail.com

2 Autor para correspondencia: Universidad del Valle, Facultad de Ciencias. Depto. de Biologia. A. A. 25360 Cali. E. mail: ranulfo@bioloyos.univalle.edu.co

3 Universidad del Valle, Facultad de Ciencias. Departamento de Quimica. Cali.

Recibido: Ago. 28 / 2003 Aceptado: Ene. 24/2004


Resumen. Muchas especies de plantas superiores producen metabolitos secundarios, a los cuales se les atribuye funciones ecologicas y de defensa contra microorganismos y fitofagos. El objetivo de este trabajo fue conocer la susceptibilidad de larvas de Ae. aegypti y An. albimanus a dos tipos de extractos de acetogeninas obtenidos de semillas de Annona muricata. Las dos especies de Culicidae estudiadas fueron altamente susceptibles a ambos tipos de extractos bajo condiciones de laboratorio. Las concentraciones letales medias (CL50) para los extractos polar, no polar y mezcla de acetogeninas para Ae. aegypti fueron de 74,7 ppm, 236,2 ppm y 20,3 ppm, respectivamente, mientras que en An. albimanus fueron de 0,8 ppm, 16,2 ppm y 1,4 ppm. Se presentan las dosis diagnosticas y su respectivo rango de variacion. Las diferencias entre la mortalidad producida por los extractos no fueron estadisticamente significativas. Una eleccion para su utilizaciòn, podra ser determinada posteriormente cuando se evalùe la residualidad de ambos compuestos y la relaciòn costo beneficio.

Palabras clave: Control. Extractos de plantas. Insecticidas. Tòxicologia.


Summary. Many species of higher plants produce secondary metabolites, to which ecological functions and defense against microorganisms and phytophages are attributed. The objective of this work was to understand the susceptibility of Ae. aegypti and An. albimanus larvae to two types of acetogenins extracts obtained from seeds of Annona muricata. The two species of Culicidae studied were highly susceptible to both kinds of extracts under laboratory conditions. The mean lethal concentrations (CL50) for the polar, nonpolar and mix of acetogenins extracts for Ae. aegypti were 74,7 ppm, 236,2 ppm and 20.3 ppm, respectively, while in An. albimanus they were 0,8 ppm, 16,2 ppm and 1,4 ppm. The diagnostic doses are presented with their respective range of variation. The differences in mortality produced by the extracts were not statistically significant. An option for its use could eventually be determined when the residuality of both compounds and the costbenefit ratio are, evaluated.

Key words: Control. Insecticide. Plants extracts. Toxicology.


Introduccion

Dengue y malaria son dos enfermedades transmitidas por vectores, de gran importancia en salud publica. La prevalencia del dengue esta asociada a su principal vector Aedes aegypti (Linnaeus), es endemica en mas de 100 paises y unos 2.500 millones de personas estan ahora en riesgo de contraer la enfermedad. Segun la Organizacion mundial de la salud (O. M. S) pueden presentarse unos 50 millones de infecciones por dengue cada año. En el año 2002 se presento la cifra mas alta de casos de dengue en las Americas, 1`019.196 casos fueron registrados, de los cuales 17.363 fueron de dengue hemorragico, presen-tandose 225 muertes. Colombia mostro un comportamiento similar con 81.831 casos, de los cuales 5.245 fueron de dengue hemorragico (OPS 2002). Se considera que en Colombia aproximadamente 18 millones de personas se encuentran en areas de riesgo para dengue (Camacho 1991).

La malaria humana es transmitida por mosquitos del genero Anopheles. En el ambito mundial se calcula que aproximadamente el 40% de la poblacion esta expuesta a esta enfermedad en unos 91 paises o areas y en el continente Africano es responsable por la muerte de 1,4 a 2,6 millones de personas cada año (WHO 1995). Se ha calculado una incidencia anual de 488 millones de casos en el mundo, de los cuales 14,8 millones se presentan en Centro y Suramerica (Sturchler 1989). En las Americas el 36.5% de la poblacion vive en zonas ecologicamente propicias para la transmision de la malaria. En estas, para 1998 y 1999, se presento una morbilidad de 418,3 y 404,4 casos por 100.000 habitantes (OPS 1999).

La malaria representa un grave problema de salud en el 85% del territorio rural colombiano (MINSALUD 2002). En la actualidad una serie de factores sociales, econòmicos, climaticos y administrativos han contribuido al incremento en la tasa de prevalencia de la malaria, la cual fue especialmente alta en 1998 cuando alcanzo una cifra de mas de 250.000 casos (OPS/OMS 2000).

Aedes aegypticomo vector del dengue clasico, dengue hemorragico y fiebre amarilla urbana y Anopheles albimanus Wiedemann, como vector de malaria, son vectores primarios en las Americas, por lo tanto es prioritario adelantar estrategias de manejo y desarrollar nuevas tecnologias que permitan tener alternativas quimica o biologicas, en el caso de que las ya existentes no sigan siendo utiles por problemas de resistencia o tengan poca eficiencia en su control.

En la actualidad mas de 200 especies de artropodos de importancia medica han mostrado resistencia a muchos de los pesticidas contemporaneos; cada vez es mas necesario desarrollar quimicos mas potentes, originando mayores costos economicos y ambientales (Brown 1986). Estos problemas han popularizado el concepto de manejo integrado de plagas, que implica trabajar no solo en la biisqueda de controladores biologicos y manejo ambiental, sino tambien en la investigacion del posible uso de insecticidas botanicos, los cuales tienen la ventaja de proveer modos de accion novedosos que reducen el riesgo de resistencia cruzada, que sean eficaces, mas seguros para el medio, que sean degradables y mas especificos para las especies de mosquitos, produciendo poco o ningun impacto ambiental (Arnanson et al. 1989).

Numerosas especies de plantas superiores producen metabolitos secundarios a los cuales se les atribuye funciones ecologicas y de defensa contra microorganismos y fitofagos (Rosenthal 1986). Actuan principalmente como toxinas a traves de los estados de vida de las especies de insectos, otros interfieren en el desarrollo y la reproducciòn o pueden actuar a nivel de los receptores olfatorios siendo responsables de atracclòn o repelencia (Sukumar et al. 1991).

Varios insecticidas organicos han sido extraidos y/o sintetizados a partir de plantas. Entre los innumerables compuestos insecticidas de origen botanico que han sido sintetizados son de renombre la nicotina, las piretrinas y la rotenona (Matsumura 1975). Cambell et al. (1933) usando alcaloides extraidos de Anabasis aphylla L (Caryophyllales: Amaranthaceae), demostrò efectividad sobre larvas de Culex pipiens Linnaeus, Or. territans Walker y Or. quinquefasciatus Say. De las semillas de Annonaceae se han aislado sustancias conocidas como acetogeninas. En esta familia se incluyen mas de 2.000 especies. De. estas solamente 150 (7%), pertenecientes a 43 generos (33%), han sido investigadas (Leboeuf et al. 1982).

Las acetogeninas de Annonaceas son una serie de productos naturales de origen policetido derivados de acidos grasos con 35 a 37 carbonos, su estructura general esta caracterizada por una gran cadena alifatica con un grupo metil terminal, una gran lactona insaturada con un metil como sustituyente, uno o dos anillos tetrahidrofurano y varios sustituyentes hidroxilo o cetònicos (Roblot et al. 1993). Estas presentan un amplio rango de actividades biologicas inmunosupresivas, antiparasitarias, citotoxicas, antimicrobianas, pesticidas y antitumorales (Correa y Bernal 1989). La primera acetogenina aislada fue el uvaricin (Cave 1993).

Entre las especies del genero Annona se destacan por sus propiedades insecticidas: A. cherimolia, A. glabra, A.muricata, A. squamosa, A. melitu, A. palustri, A. reticulata y A. spinescens (Atheortua 1994). Las acetogeninas caracteristicas de A. muricata son las monotetrahidrofurànicas. La primera acetogenina aislada de esta especie fue el Annonacin en 1987 (Myint et al. 1991). Mikolajczak et al. (1988, 1989) patentaron acetogeninas de annonaceas como sustancias para el control de plagas, Moeschler et al. (1986, 1987) patentaron la acetogenina Annonin como un insecticida.

Una posible utilizacion de semillas de A. muricata es su procesamiento para obtencion de acetogeninas naturales para control de algunas plagas. En este trabajo se presentan y analizan los resultados de evaluaciones realizadas bajo condiciones de laboratorio de extractos de semillas de A. muricata (mezcla de acetogeninas) asi como el extracto polar y no polar obtenido de la mezcla, sobre larvas de Ae. aegypti y An. albimanus.

Materiales y Metodos

El trabajo se desarrollo en los laboratories de Entomologia de la Universidad del Valle, con una temperatura promedio de 26"C y una humedad relativa del 70%. La extraccion de los principios biologicamente activos de A. muricata se realizo en los laboratoris de productos naturales del departamento de Quimica de la Universidad del Valle.

El analisis quimico de las semillas mostro la presencia de acetogeninas lactonicas monotretrahidrofuranicas. La extraccion del extracto no polar se hizo con eter de petroleo en un equipo soxleht a partir de 325 g de semilla molida, previamente secada a 60°C. Este extracto se sometio a temperaturas bajas para lograr la precipitacion de las acetogeninas. Al marco obtenido despues de esta extracciòn se le adiciono etanol como solvente y se obtuvo el extracto polar. Luego, la muestra se traslado a un rotoevaporador con el fin de eliminar el solvente a presion reducida y obtener la muestra concentrada libre de solvente organico, el rendimiento promedio de la extraccion fue de 22,5% de extracto no polar, 6,39% de extracto polar y 0,80% de acetogeninas.

Los especimenes de Ae. aegypti se obtuvieron de una colonia de la secciòn de Entomologia de la Universidad del Valle. Los de An. albimanus fueron proporcionados por el insectario del Instituto de Inmunologia de la Universidad del Valle.

Establecimiento de la linea base de susceptibilidad

Con base en ensayos preliminares de laboratorio, se establecieron cuatro a siete concentraciones de cada uno de los extractos a ser evaluados, cada concentracion se probo con 20 a 25 larvas de tercer y cuarto estadio temprano de Ae. aegyptiy An. albimanus en vasos de precipitado de 600 ml, previamente esterilizados en autoclave. Para preparar las concentraciones se utilizo un volumen de 250 ml de agua filtrada, teniendo tres a cuatro repeticiones por tratamiento y las siguientes dosis para Ae. aegypti: extracto no polar 1.800, 600, 300,. 150, 75 y 37,5 partes por millon (ppm). Para el extracto polar, ademas de las dosis anteriores se adicionò otra de 18,7 ppm.

Para An. albimanus se evaiuaron las siguientes dosis del extracto no polar: 600, 150, 75, 37,5, 18,7 y 9,4 ppm. Para el extracto polar se adiciono una dosis de 4,7 y se eliminaron las de 150 y 300 ppm. La mortalidad se evaluo a las 24 h postratamiento. Se consideraron como larvas muertas aquellas que al ser punzadas en la region cervical o en el sifon no presentaron movimiento alguno. Con ambas especies, para cada extracto, se tuvo su respectivo control; para el extracto no polar se utilizo como emulsionante triona (aceite mineral), el cual fue adicionado tambien a su respectivo control. Las larvas que se transformaron en pupas durante la prueba, fueron desechadas del analisis. Para porcentajes de mortalidad menores que el 20%, se hicieron ajustes con respecto a lo observado en el grupo testigo de cada ensayo, mediante la formula de Abbott (1925).

La construccion de la linea de regresion dosis mortalidad, asi como las diferentes concentraciones letales, se calcularon por medio del programa de analisis LogProbit elaborado por Raymond (1985). Tambien se hizo un analisis de varianza de dos vias en donde la variable de respuesta fue la mortalidad observada y los factores las dos especies y tipo de extracto. Previamente se realizo una validacion de los supuestos de normalidad y de homogeneidad de varianza (prueba de Bartlett) y con base en los resultados un postanova de Tukey entre las medias de mortalidad de los tratamientos (extractos) seleccionando como variables las dosis.

Residualidad

Con base en la linea base de mortalidad calculada anteriormente, se prepararon 9.000 ml con la dosis diagnostica de cada extracto en frascos bomboneros de vidrio previamente esterilizados. Estos se taparon con papel aluminio y se expusieron a 12 h de luz solar diariamente. Para los extractos no polar y mezcla de acetogeninas se adiciono Kembola como coadyuvante. Durante los primeros ocho dias, cada dos dias se probaron cuatro repeticiones en vasos de precipitado con 250 ml de cada extracto con larvas de Ae. aegyptide tercero y cuarto estadio temprano. Las pruebas se continuaron cada 15 dias en los dias subsiguientes. Este procedimiento se mantuvo hasta los ocho meses o hasta obtener una mortalidad menor que el 50%.

Resultados

A las 24 h postratamiento ambos tipos de extractos produjeron mortalidad. Con el extracto no polar en Ae.aegyptila dosis mayor (1.800 ppm) produjo 100% de mortalidad, mientras que la menor (37,5 ppm) produjo 3% de mortalidad (Tabla 1). En An. albimanus la dosis que produjo el 100% de mortalidad fue de 600 ppm; con la de 37,5 ppm se obtuvo una mortalidad corregida del 64,7% (Tabla 2). Con el extracto polar las concentraciones letales fueron mas bajas. En Ae. aegypti si bien fue necesaria la concentracion de 1.800 ppm para obtener el 100% de mortalidad, la dosis de 37,5 ppm produjo 24% de mortalidad (Tabla 3).

En An. albimanus fue necesario unicamente una concentracion de 75 ppm para obtener un 100% de mortalidad (Tabla 4). Con las mezclas de acetogeninas, en las dos especies se obtuvieron respuestas de mortalidad con la misma tendencia de susceptibilidad observada en los extractos. En Ae. aegypticomo en An. albimanus75 ppm causaron el 100% de mortalidad, pero la dosis de 9,2 ppm causo una mortalidad del 9% en Ae.aegypti (Tabla 6), mientras que en An. albimanus fue del 79.6% (Tabla 7). La mortalidad causada por los extractos fue significativamente diferente entre las dos especies de mosquitos (P=0.0003) y tanto en Ae. aegypti como en An. albimanus los extractos polar y no polar actuaron significativamente diferente al igual que entre el polar y la mezcla de acetogeninas. Entre los extractos no polar y la mezcla de acetogeninas no se observaron diferencias significativas en cuanto a la mortalidad producida por ellos.

El analisis de varianza realizado,. considerando la especie y el tipo de extracto, mostro diferencias significativas entre la mortalidad causada por el tipo de extracto en las dos especies de mosquitos (F = 11,5; P = 0,0003). El analisis postanova de Tukey mostro que en ambas especies los dos extractos y las mezclas de acetogeninas actuaron de manera significativamente diferente (P< 0,005) (Tabla 5). Para ambas especies, entre el extracto no polar y la mezcla de acetogeninas, no se presentaron diferencias estadisticas significativas; sin embargo, presentaron pendientes diferentes (Figs. 1 y 2).

Establecimiento de la linea base de susceptibilidad

Al graficar la linea base de susceptibilidad del logaritmo de la dosis versus porcentaje de mortalidad observada sobre Ae.aegypti, se obtuvo una linea recta de pendiente elevada (Fig. 1) producto de puntos bien ajustados a una linea de regresiòn (nivel de confianza del 95%) lo cual influye en los rangos estrechos de las concentraciones letales (Tabla 8) y aporta a la CL 50 una varianza baja (0,0004) mostrando ademas que los resultados obtenidos son homogeneos. Las pendientes obtenidas con el extracto polar y no polar fueron menores que las de la mezcla de acetogeninas; sin embargo, los datos tambien son homogeneos y la amplitud de los intervalos de confianza fue mayor que la de la mezcla. En el proceso de calculo de las concentraciones letales del extracto no polar sobre Ae. aegypti (Tabla 8). el analisis mostrò que los datos no representaban una linea recta bien ajustada, esto se manifesto en el valor total de Chi cuadrado resultante de la interaccion entre la mortalidad esperada versus la mortalidad observada, el cual fue muy elevado en la dosis de 150 ppm (X2 = 6.13); lo anterior condujo a un valor total de Chi2 calculado mas alto (X2 = 11.58 ) que el Chi2 tabulado (X2 = 7.8) (Tabla 1).

Todos los valores de las pendientes de las lineas, obtenidas con los tres tipos de extractos evaluados en An. albimanus, fueron bajos, con datos bien ajustados a una linea de regresiòn, (Fig. 2) pero a diferencia de Ae. aegypti las concentraciones letales fueron mas bajas (Tabla 8) y con intervalos de dosis muy amplios en el caso del extracto polar de la mezcla de acetogeninas, especialmente la CL99. Con base en estos resultados las dosis diagnosticas para Ae. aegypti fueron de 3.046 ppm, 4.072 ppm y 148,1 ppm para el extracto polar, no polar y mezcla de acetogeninas, respectivamente.

Residualidad

Las pruebas realizadas en Ae. aegypti hasta ocho meses despues de exponer los dos tipos de extractos a luz solar, fueron compatibles con una residualidad alta (100%), con variaciones en el tiempo letal medio. Con el extracto no polar se observo adicionalmente una posible acciòn mecanica sobre larvas y pupas ya que aparentemente la condiciòn aceitosa del extracto bloquea la entrada de aire a traves del sifon de las larvas y las trompetas respiratorias de las pupas. Sin embargo, la residualidad se redujo considerablemente cuando se utilizo el producto de las acetogeninas sin separacion de los extractos polar y no polar, ya que a partir de los 20 dias no se observò mortalidad de larvas.

Discusion

Los resultados con estos extractos se pueden considerar promisorios, ya que se encuentran por debajo de la concentracion maxima (5.000 ppm) recomendada por la Agencia de Cooperacion Tecnica Alemana ( GTZ) para condiciones de laboratorio (Hellpap 1993).

No es sorprendente la actividad insecticida de los dos extractos de A. muricata sobre larvas de Ae. aegypti. Ohsawa et al. (1990), con extractos de Annona glabra, A. montaña, A. muricata, A. squamosa, A chirimolia y A. reticulata. observaron un porcentaje variable de mortalidad sobre Callosobruchus chinensis (Coleoptera: Bruchidae) al actuar por contacto. A. squamosa presenta acetogeninas bistetrahidofuranicas las cuales poseen una accion biologica mayor que las monotetrahidrofuranicas de A. muricata (Rupprecht et alt. 1990). Feras et al. (1999) en una revisiòn sobre este tema, señalaron un exitoso manejo de cucarachas {Blatellla germanica) resistentes a los grupos insecticidas tradicionales, utilizando acetogeninas de anonaceas.

Sobre Culicidae, extractos de hojas y semillas de A. squamosa han mostrado actividad insecticida sobre larvas de Anopheles. Saxena et al. (1993a), utilizando extractos de hojas de esta planta, obtuvieron una CL50 que vario entre 126 y 178 ppm sobre larvas de An. stephensi. Saxena et al. (1993 b) utilizando extractos de semilias obtuvieron una CL50 de 213,79 ppm sobre larvas de An. culicifacies. Por otro lado, Cepleanu (1993) con extractos de A purpurea observo una CL100 de 10 ppm en larvas de segundo instar de Ae. aegypti.

Posiblemente los dos tipos de extractos actuan por ingestion, pero habria que diseñar una metodologia diferente para precisar su modo de accion.

Considerando el tiempo letal de los extractos sobre larvas de Ae. aegypti y An. albimanus, la mayor rapidez con que se inicia la accion de los extractos polares se debe posiblemente a que las larvas ingieren mas facil y rapidamente el extracto polar a diferencia del extracto no polar, el cual queda en mayor cantidad en la superficie y las larvas solo al respirar por el sifon se impregnan de aceite y lo ingieren cuando limpian su sifon con los peines bucales. Por lo menos en las concentraciones mas elevadas del extracto no polar, se presenta aparentemente cierto efecto mecanico. Es de suponer que el extracto polar forma una solucion mas hornogenea que el no polar. Para poder emulsionar el extracto no polar y la mezcla de acetogeninas, se ensayaron varios productos comerciales tales como Triona®, Dimetil Sulfaxido (DMSO) y Kemkol®, los cuales no necesariamente tienen los mejores resultados al mezclarse con el agua y aparentemente retrasan la accion del ingrediente activo. Esta dificultad hizo que posiblemente los resultados observados con el extracto no polar, produjeran en el analisis probit valores relativamente altos de X2, lo cual es indicativo de que el grado de distribucion de los datos alrededor de la linea de regresion dosis-mortalidad sea alto. La interpolacion de dos de los datos fue suficiente para obtener un mejor ajuste de la linea de regresion e hizo que los datos no fueran significativamente heterogeneos, la cual en este caso, puede ser atribuido a factores claramente ambientales. La buena residualidad observada de los extractos polar y no polar indican que posiblemente presenter otcos componentes adicionales a las acetogeninas que les confieren buena estabilidad a la luz especialmente a luz ultravioleta.

Estos resultados son prornisorios para el control de larvas de Ae. aegypti y An albimanus, y posiblemente para otras larvas de Culicidae. Sin embargo, parece ser que la respuesta de cada especie es variable con respecto a la dosis diagnostica y al rango de toxicidad de las dosis, para An. albimanus se debio haber establecido un mayor rango de dosis hacia las de menor concentracion, por que segun lo observado fueron mas susceptibles que las de Ae. aegypti.

La alta toxicidad y residualidad de los dos extractos conteniendo acetogeninas, observadas bajo condiciones de laboratorio, ameritan la realizacion de evaluaciones a pequeña escala en condiciones de campo. en donde se evalue igualmente si la estabilidad del producto, determinante de su residualidad, observada en laboratorio, es igualmente valida en condiciones naturales y determinar cual es el impacto ambiental sobre la fauna asociada de los criaderos de Ae aegypti y An. albimanus u otras especies de mosquitos que se reproduzcan en aguas lenticas o en donde sea viable de realizar este tipo de aplicaciòn. De igual modo, se debe evaluar en condiciones naturales, el por que de la poca estabilidad observada en la mezcla de acetogeninas, posiblemente esto sea mas bien un problema de la dosis diagnostica empleada (148,1 ppm), la cual fue comparativamente mucho mas baja que la de los extractos por separado y no de la formulacion propiamente dicha. En este sentido es recomendable evaluar una dosis diagnostica mas alta. similar a la de los extractos polar y no polar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Sandra Garzòn por el trabajo de laboratorio, a los profesores de la seccion de Entomologia, del departamento de Biologia, por la revision del manuscrito. Asi mismo, a la Universidad del Valle por el apoyo y la colaboracion brindada para la realizacion de esta investigacion. A los laboratorios de productos naturales del departamento de Quimica y Entomologia del departamento de Biologia por proveer facilidades logislicas. Al Instituto de Inmunologia de la Universidad del valle por proporcionar larvas de An. albimanus.

Literatura citada

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Recibido: Abr. 22 / 2003 Aceptado: Oct. 27 / 2003