Caracterización de las nanopartículas de plata (AgNPs)

A las soluciones obtenidas se les realizó un barrido en el equipo de UV-Vis MAPADA 3200 PC con longitudes de onda entre 300 y 600 nm. El objetivo del análisis fue observar la longitud de onda en la que se presenta la mayor absorbancia y definir el tamaño de partícula aproximado que se obtiene en cada síntesis.

Para verificar el tamaño de partícula obtenido, se usó microscopía electrónica de transmisión TEM usando un equipo Tecnai F20 Super Twin TMP de FEI. Se escogieron para este análisis 6 protocolos, los cuales mostraban un pico de absorbancia en el espectro UV-Vis correspondiente a la plata; las demás muestras no fueron analizadas. Por otro lado, se verificó el tamaño de partícula usando la técnica de dispersión de luz dinámica DLS en el equipo Zetasizer Pro con longitud de onda 632,8 nm.

Diseño factorial

Para optimizar el tamaño de partícula final de las AgNPs, se realizó un diseño experimental 2^K variando los cuatro parámetros mencionados anteriormente en dos niveles alto y bajo, como se observa en la tabla 1; para la síntesis de AgNPs, se realizaron 16 muestras diferentes, elaboradas por duplicado, obteniendo 32 soluciones finales. El diseño experimental tuvo como variable de salida la longitud de onda, observada en el espectro UVVis, puesto que, según lo registrado en la literatura, para un tamaño de partícula específico se obtiene una longitud de onda característica.

Los valores de longitud de onda se examinaron mediante el software RStudio, a los cuales se les realizaron las pruebas de normalidad, homocedasticidad e independencia de los datos, para así poder realizar un análisis de varianza (ANOVA); posteriormente, se realizó la optimización del diseño usando el software STATGRAPHCS centurión XVII. Las hipótesis aplicadas para cada prueba estadística se especifican en el análisis y discusión de los resultados.

Síntesis de AgNPs

En la figura 2 se observan las diferentes soluciones obtenidas en la síntesis de AgNPs. Con la variación de los diferentes factores se evidencia una tendencia, según la cual, a mayor nivel de molaridad del AgNO₃, existe una coloración marrón más oscura; este cambio de tonalidad lo han registrado diferentes autores y se atribuye a una mayor concentración de AgNO₃, debido a que existe mayor cantidad de agente precursor para la formación de nanopartículas ^22),(23),(24.

Figura 2 Soluciones de la síntesis de nanopartículas de plata, a. 100 °C, 0,1 y 0,2 M AgNO3, 10 % citrato; b. 100 °C, 0,1 y 0,2 M AgNO3, 1 % citrato; c. 80 °C, 0,1 y 0,2 M AgNO3, 10 % citrato; d. 80 °C, 0,1 y 0,2 M AgNO3, 1 % citrato. 

Caracterización de las nanopartículas de plata (AgNPs)

Espectroscopía ultravioleta visible (UV-Vis). En la figura 3 se muestran los espectros UV-Vis para todos los protocolos realizados. se resaltan los espectros obtenidos cuando se adicionó PVA al 10 %, debido a que al realizar el espectro es evidente la presencia del PVA sobre las AgNPs. Este efecto se verificó al realizar el espectro UV-Vis del PVA (Figura 4), donde se observan bandas en 273 y 323 nm, que aparecen también registradas en los espectros de las nanopartículas sintetizadas (ver flecha, figura 3), lo cual genera picos en las longitudes de ondas solapadas que corresponden al espectro de PVA. Teniendo en cuenta esto, se redujo el porcentaje de PVA correspondiente al nivel alto de 10 % a 2 %, esto con el fin de evitar el enmascaramiento por el alto porcentaje. La presencia de bandas de absorción en el espectro UV-Vis en longitudes de onda entre 400 a 450 nm indica la presencia de nanopartículas metálicas de plata. Dichas bandas corresponden a la absorción por resonancia de los plasmones superficiales de la plata ²⁵.

Figura 3 Espectros UV-Vis del ensayo con PVA al 10 %. 

Figura 4 Espectro UV-Vis del PVA. 

En las figuras 5, 6, 7 y 8 se visualizan los diferentes información contenida en la tabla 1. La separación espectros UV-Vis para los protocolos evaluados; de espectros se hizo para una mejor visualización la nomenclatura mostrada corresponde a la del resultado de cada síntesis.

Figura 5 Espectro UV-Vis de las muestras de AgNPs con baja absorbancia. 

Figura 6 Espectro UV-Vis con absorbancia media en longitud de onda entre 400 y 450 nm. 

Figura 7 Espectro UV-Vis con absorbancia alta en longitud de onda entre 400 y 480 nm. 

Figura 8 Espectro UV-Vis con absorbancia alta en longitud de onda entre 400 y 550 nm. 

En la figura 5 se puede ver claramente que no existe un pico característico en la curva, lo que puede indicar dos cosas: que no hubo formación de AgNPs o que la reacción dio muy pocas AgNPs con un tamaño de partícula muy pequeño. En la figura 6 se evidencia un pico aproximadamente en los 420 nm, que corresponde a alrededor de 40 nm de tamaño de partícula ²⁶; sin embargo, tiene una absorbancia baja, lo cual se debe a una baja concentración de AgNPs formadas en la solución. En las figuras 7 y 8 se puede observar cómo se forma un pico aproximadamente entre los 430 y 470 nm, el cual corresponde a un tamaño de partícula entre 30 y 60 nm con una absorbancia mucho mayor que las muestras anteriores, siendo las muestras Ag10 y Ag12 las que presentan mayor absorbancia. Este fenómeno puede asociarse a la existencia de gran cantidad de AgNPs que corresponden a este tamaño o a la formación de nanopartículas más pequeñas en forma de aglomerados. En estas longitudes de ondas, por el efecto plasmón, teóricamente, los AgNPs deben oscilar en un rango de 60 nm a 80 nm ²⁶. En las otras dos curvas que sobresalen, se espera un tamaño de partícula aproximadamente de 40 nm; cabe resaltar que no se tiene gran diferencia entre la primera síntesis y su réplica, lo que indica que los procesos son reproducibles.

Microscopía electrónica de transmisión (TEM).

Usando las micrografías TEM, se midieron las nanopartículas mediante el software asociado al equipo TEM, se hizo un promedio aproximado de 20 partículas, y de ello se obtuvo el tamaño aproximado de las AgNPs presentes en las diferentes muestras. Según los datos registrados por el ensayo de UV-Vis, se puede esperar ciertos tamaños de partículas relacionados con lo presentado en la literatura ²⁶.

En la figura 9 se presentan las micrografías TEM; se puede observar como las micrografías revelan lo predicho en el UV-Vis, en donde la figura 9a es la muestra Ag 9. Además, al observar la figura 5, en donde se encuentra esta muestra, se puede comprobar que la baja absorbancia da cuenta de que en la síntesis se obtuvieron muy pocas AgNPs en las muestras Ag 8, Ag 9, Ag 10 y Ag 12. También se evidencia que la figura 9c y 9d que corresponden a Ag 10 y Ag 12, presentan gran cantidad de AgNPs, lo cual confirma lo resultados de 9c y 9d UV-Vis, pero difieren con el valor teórico de tamaño de nanopartícula, puesto que se espera un tamaño de 80 nm y se tiene un valor dede 90 nm. Para las muestras Ag 10 y Ag 12, para las cuales se espera el mismo tamaño de nanopartícula, se tiene un tamaño de partícula entre 60 nm y 100 nm, lo cual está dentro del rango de lo predicho. Para la figura 9a, que corresponde a la muestra Ag 9, se tiene que el tamaño de partícula esta en el rango de 13 a 40 nm, el valor teórico esperado para esta longitud de onda es de 40 nm, por lo cual se obtuvieron en el tamaño esperado ²⁶. Estos resultados indican que, si bien se difiere con el valor teórico en algunos casos, las AgNPs se pueden considerar de tamaño nanométrico, puesto que no superan los 100 nm. Además, mediante TEM, se pudo observar que las muestras con longitud de onda de 395 nm no presentan AgNPs. Así mismo, mediante esta técnica se pudo observar la geometría que las AgNPs es pseudoesferica.

Figura 9 Micrografías TEM, a. Ag 9 (6 a 15 nm), b. Ag 8 (13 a 40 nm), c. Ag 10 (90 a 110 nm, d. Ag 12. (62 a 103 nm). 

Dispersión dinámica de luz (DLS) Como las AgNPs no tienen un tamaño exacto, sino que oscilan en un intervalo de tamaños, se realizó un análisis DLS, como se muestra en las figuras 10, 11, 12, 13 y 14.

Figura 10 Análisis DLS de la muestra Ag 12. 

Figura 11 Análisis DLS de la muestra Ag 10. 

Figura 12 Análisis DLS de la muestra Ag 8. 

Figura 13 Análisis DLS de la muestra Ag 6. 

Figura 14 Análisis DLS de la muestra Ag 4. 

En los resultados mostrados en las figuras 10 a 14 se puede ver como es la distribución de las partículas en las diferentes soluciones preparadas. Si bien existen tamaños mayores a los 100 nm, se pueden asociar a la aglomeración de partículas; esta hipótesis se sustenta en que las micrografías TEM no evidencian la presencia de partículas mayores a los 200 nm. Se nota que existen AgNPs en el rango esperado y menores a 100 nm; además, para las muestras Ag 4, Ag 6 y Ag 10, existe un pequeño pico entre los 10 y 20 nm, que es el tamaño esperado para la optimización del ensayo. Si bien los resultados obtenidos mediante esta técnica tienen un rango mayor a los mostrado en las anteriores técnicas, se evidencia que los valores predichos por UV-Vis están dentro del rango de los resultados obtenidos mediante DLS.

Diseño factorial

Para la optimización del diseño factorial, se partió de los datos de la tabla 2, que muestran las longitudes de onda obtenidas para las dos síntesis realizadas; se puede observar como los valores son muy cercanos entre las mismas muestras de las dos síntesis, lo que indica que el método es reproducible. Este valor de longitud de onda fue el usado para el análisis estadístico de los datos, pues presenta una relación con la presencia de plata y además con el tamaño esperado de las partículas, debido a que se varió la temperatura, la cual ayuda a la formación de AgNPs, puesto que aumenta la cinética en la reacción. El nitrato de plata es el agente precursor que, mediante la reducción, pasa de una sal metálica al átomo cerovalente; estos átomos se comportan como centros de nucleación, que inician la formación de AgNPs por la agregación de varios de estos átomos. Para detener el crecimiento, se usa un agente reductor como es el citrato trisódico; en este caso, su función consiste en unirse a la superficie de las AgNPs para estabilizarlas ²⁷.

Tabla 2 Datos experimentales obtenidos durante la síntesis de nanopartículas de plata. 

Análisis exploratorio

En el análisis exploratorio (figuras 15 a 17) se presenta, inicialmente, el diagrama de caja y bigotes, indicando que los únicos datos que coinciden en sus medianas, o que, en otras palabras, difieren en su valor central, son los niveles de porcentaje de citrato trisódico. Además, se observa la presencia de valores atípicos; esto indica que existen dos valores que difieren numéricamente del resto de ese factor, y debido a la separación de las medianas se muestra que existe una diferencia numérica entre los niveles ²⁰. En la figura 16 se puede observar la tendencia de la respuesta de los datos, en donde la mayoría de datos se encuentran en el intervalo de 380 a 400 nm, lo cual se corrobora de la tabla 2, donde gran cantidad de mediciones corresponden con 395 nm. Respecto al diagrama de densidad, del cual, estadísticamente, se espera que tenga forma de campana de Gauss, y que indique indicando una distribución normal, cabe señalar que este no presenta dicha forma, sino una distribución asimétrica positiva que evidencia así que la mayoría que la mayoría de datos se encuentran en una longitud de onda baja; es por esto que se hace necesario realizar la prueba de normalidad. En el gráfico de interacciones que se muestra en la figura 17, se puede notar cómo los factores de temperatura y porcentaje de citrato trisódico no presentan interacción, hecho que puede afectar la respuesta; en las otras interacciones se evidencia cómo los factores afectan la respuesta, en este caso, la longitud de onda.

Figura 16 Diagrama de densidad e histograma de frecuencia de la longitud de onda obtenida en la síntesis de AgNPs. 

Figura 17 Interacción de los factores obtenido en la síntesis de AgNPs. 

Análisis de varianza (ANOVA)

Para el análisis de varianza (ANOVA), primero se hicieron las pruebas de normalidad, homocedasticidad e independencia de los datos, usando el software Rstudio, con un intervalo de confianza del 95 %.

Para el test de normalidad de los datos, se realizó la prueba de Kolmogorov-Smirnov, y como resultado se obtuvo un valor-P de 0,161867; esta prueba tiene como hipótesis nula que los datos provienen de una distribución normal. Se evidencia que el resultado está dentro del intervalo de confianza; dado que el resultado es mayor 0,05, se puede afirmar que la hipótesis nula se cumple y que los datos provienen de una distribución normal ²⁰. El test de homocedasticidad de los datos se hizo mediante la prueba de Levene, la cual arrojó los resultados mostrados en la tabla 3.

La prueba de homocedasticidad de Levene tiene como hipótesis nula que la varianza de los datos es igual. Como se evidencia en la tabla 3, existe un valor que es menor al 0,05, lo cual indica que existe una varianza entre sus datos, específicamente para el factor de porcentaje de citrato trisódico ²⁰.

El test de independencia se realizó mediante la prueba de Durbin Watson; para el modelo ajustado, se tienen los datos de la tabla 4. Se tiene como hipótesis nula que la autocorrelación de los datos es cero. Como se observa en la tabla 4, los valores P son mayores al 0,05, es decir no existe autocorrelación y los datos son independientes ²⁰, condición necesaria para validar elanálisis ANOVA.

En vista que todas las pruebas estuvieron dentro del nivel de confianza, salvo por un factor para la prueba de homocedasticidad, se realizó la prueba de falta de ajuste Lack of fit, la cual dió un valor P de 0,4176. Esta prueba se hizo con el fin de evaluar si una relación curvilineal podría expresar mejor los datos que un modelo lineal; esta prueba se basa en el análisis de la varianza de los residuales, y tiene como hipótesis nula que no existe falta de ajuste del modelo. Como se indica, el valor P es mayor a 0,05, por lo cual se acepta la hipótesis nula y se puede seguir con el análisis de varianza ²⁰.

Como los datos pasaron la prueba Lack of fit, se realizó el análisis ANOVA; los resultados se encuentran en las tablas 5 y 6. En la tabla 5, se presenta el análisis factorial del modelo, en donde se evidencia que solo 7 factores entre individuales e interacciones presentan una significancia estadística. Con el fin de reducir el modelo, se eliminaron cada uno de los factores que no representan una significancia estadística, obteniendo como resultado la tabla 6, en donde se observa que el PVA no influencia la obtención de AgNPs; conclusión coherente con el hecho de que el PVA es un constituyente que unicamente facilita la dispersión de las AgNPs en la solución. Por otro lado, la temperatura, la concentración de AgNO₃, el porcentaje de citrato trisódico y la interacción entre temperatura:AgNO₃, temperatura:citrato trisódico, y AgNO₃:citrato trisódico muestran que influyen en la obtención de las AgNPs, en donde es más relevante el factor del porcentaje de citrato trisódico.

Estimación de las mejores condiciones de síntesis

Para la optimización del diseño a un tamaño de partícula aproximado de 20 nm, el cual corresponde a una longitud de onda de 400 nm aproximadamente ²⁶, se hizo un proceso de estimación a partir del modelo de regresión, cuyos resultados se registran en la tabla 7. Para la aplicación específica en apósitos, que puede ser una de las posibles aplicaciones de las nanopartículas de plata, se estiman tamaños entre 10 y 20 nm, puesto que las AgNPs interaccionan de mejor manera con la membrana de los microorganismos, de modo que ocasionan una mayor inhibición de estos ²⁸. Buscando entonces dichos valores, se debe tener una temperatura de 91 °C, una concentración de nitrato de plata de 0,13 molar y, finalmente, una concentración de citrato trisódico de aproximadamente el 10 %. Se deduce que, al haber mayor cantidad de agente reductor, las AgNPs disminuyen de tamaño; según lo reportado para este tipo de síntesis, se puede variar la forma en que se agrega la solución precursora al agente reductor, e implementando una menor temperatura se obtienen tamaños entre los 20 y 30 nm ²⁴.

Comparando los datos de la tabla 7 y la tabla 1, los valores tienen una gran semejanza con la muestra Ag 5. Se observa que para esta muestra, en la tabla 2, se tiene una longitud de onda entre los 395 y 410 nm, lo cual corrobora que la optimización para obtener partículas de un tamaño de 20 nm o menos es acertada.