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Introducción
Actualmente, aproximadamente el 40% de la producción de alimentos no se consume debido a la acción de patógenos, animales y plagas, lo que afecta gravemente la seguridad alimentaria. Las pérdidas más significativas se dan en productos hortícolas durante la etapa de poscosecha, principalmente debido a hongos y bacterias que, si no se controlan, provocan la descomposición de los productos [1].
La fusariosis es una infección patógena provocada por el género Fusarium sp. que causa pérdidas significativas en plantaciones a nivel mundial [2]. Esto hace necesario el uso de fungicidas en la industria agrícola para reducir las pérdidas en los cultivos e incrementar la producción de la materia prima esencial para la industria alimentaria. Estos fungicidas pueden ser de amplio espectro o específicos para determinados patógenos [3].
Desde el año 2000 a. C., el cobre se ha utilizado como antimicrobiano y ha sido fundamental como componente de fungicidas inorgánicos que frenan el crecimiento de patógenos y previenen enfermedades [4]. Khatami et al. [5] indican que soluciones de nanopartículas de óxido de cobre (CuO) pueden inhibir hasta un 90% el crecimiento de Fusarium solani con una concentración de 50 ppm, y un 20% con 5 ppm. Por su parte, Pham et al. [6] afirman que una concentración de 30 ppm de cobre puede inhibir completamente a Fusarium oxysporum en tres días y una de 7 ppm puede inhibir a Phytophthora capsici en un día.
Durante siglos, los iones metálicos, debido a sus propiedades antimicrobianas, se han utilizado para tratar quemaduras, heridas crónicas, sepsis, enfermedades venéreas y abscesos perianales; también se han utilizado para la conservación de alimentos y la desinfección de dispositivos médicos. Además, gracias a la nanotecnología, se ha incrementado la capacidad antimicrobiana de los iones metálicos al transformarlos en nanopartículas [7].
La capacidad antimicrobiana de los iones metálicos se basa en la deshidratación de la célula que ocurre debido a la unión del ion a la membrana celular del microorganismo, lo cual afecta su potencial dipolar [8]. Entre los usos de las nanopartículas metálicas se encuentra el tratamiento de aguas residuales y la desinfección de agua potable, en la cual se utilizan nanopartículas de cobre [9]. Algunos estudios han demostrado la capacidad de las nanopartículas de óxido de zinc (ZnO-NP) para controlar enfermedades fúngicas como Fusarium oxysporum, debido a su capacidad para distorsionar el micelio en crecimiento e inhibir directamente el crecimiento fúngico, también al eliminar micotoxinas como el ácido fusárico. Asimismo, la eficacia de ZnO-NP como antifúngico y antimicotoxina contra Fusarium sp. puede deberse al aumento de la peroxidación lipídica, los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el cambio en el contenido de ergosterol que altera la integridad de la membrana y la morfología de las macroconidias [10].
Además, muchos autores [11-14] sostienen que los iones de plata liberados por nanopartículas de plata (AgNPs) a través de la oxidación superficial son el mecanismo principal que induce citotoxicidad, genotoxicidad, respuestas inmunológicas en sistemas biológicos e incluso la muerte celular. Sambalé et al. [15] demostraron que el mecanismo de muerte celular es diferente cuando las células se cultivan con partículas o iones de plata. Las células tratadas con partículas experimentaron apoptosis, mientras que aquellas cultivadas con iones murieron de necrosis. También informaron que las AgNPs que se desplazan al citoplasma a través de la difusión o las proteínas de canal son oxidadas por enzimas citoplasmáticas, liberando así iones de plata. Estos iones pueden interactuar con los grupos tiol de las proteínas de la membrana mitocondrial, causando disfunción mitocondrial, produciendo ROS y provocando la descomposición de la función celular y el daño a los microorganismos [16].
Por otro lado, los iones de cobre también han demostrado su capacidad antifúngica. Se ha informado que el óxido de cobre biosinte-tizado con Streptomyces para el desarrollo de tejidos antimicrobianos en hospitales puede ayudar a prevenir o minimizar la infección por bacterias patógenas. Además, el cobre y el óxido de cobre con efectos antimicrobianos y antifúngicos pueden ser usados durante el envasado de alimentos para retrasar el crecimiento de gérmenes y hongos [17].
La aplicación de nanopartículas metálicas en la desinfección de frutas exportadas se ha aplicado durante muchos años. Por ejemplo, para el caso de la piña (Ananas comosus), que es una fruta económicamente significativa en países latinoamericanos, la fusariosis puede ocasionar pérdidas de entre el 30 y el 40% del fruto, o de aproximadamente el 20% de las plantaciones. Esto representa un problema grave para los países productores de piña como Ecuador, que se deben someter a estrictos controles sanitarios durante los procesos de exportación [18].
En 2020, el Ministerio de Producción, Comercio Exterior, Inversiones y Pesca informó que Ecuador fue el principal exportador de pi-ñas en América del Sur y el octavo proveedor más grande a nivel mundial. Ecuador pasó de exportar 75.573 t en 2020 a 90.186 t para noviembre de 2021, por lo que la pérdida poscosecha de la piña es un problema sustancial para su mercado.
La descomposición fúngica es la principal causa del fracaso poscosecha de la piña. Esta descomposición depende de las condiciones climáticas y del sistema de manipulación poscosecha. La alta incidencia de enfermedades poscosecha en la piña se debe principalmente al hongo Ceratocystis paradoxa y Fusarium sp. Los hongos penetran principalmente por medio de las heridas causadas por el descabezado en los sistemas de manipulación poscosecha antes de la exportación [19].
El objetivo de este estudio es determinar el efecto de las nanopartículas de iones cobre para el control de Fusarium sp. con el fin de disminuir las pérdidas de piña de exportación por degradación fúngica. Para ello, se aplicó una solución de nanopartículas de iones de cobre como desinfectante en piñas durante la poscosecha y se evaluó la efectividad de las nanopartículas de cobre para inhibir el crecimiento y desarrollo de este hongo.
Materiales y métodos
La materia prima utilizada en el presente estudio consistió en muestras de piña (Ananas comosus) híbrida conocidas como "piña miel", que se caracteriza por su color, dulzura y textura [20]. Los especímenes en buen estado fueron proporcionados por una empresa exportadora de piña en Ecuador y se seleccionaron según la normativa ecuatoriana NTE INEN 1836: FRUTAS FRESCAS. PIÑA [21]. Cuya clasificación es la siguiente:
Preparación de muestras
Las soluciones de nanocobre se prepararon mediante un proceso de ionización electroquímica utilizando un equipo NEC-4000. Para el desarrollo del estudio se seleccionaron piñas en buen estado visual y con características homogéneas en términos de madurez y tamaño. Las cáscaras de piña para el aislamiento del hongo Fusarium sp. se retiraron utilizando cuchillos esterilizados después de lavar las frutas con agua potable para eliminar cualquier residuo superficial. Una vez aislado el hongo se evaluó el anillo de inhibición causado por las soluciones de nanocobre a 3, 6 y 9 ppm de concentración, midiendo el diámetro promedio del mismo.
Adicionalmente, las soluciones de nanocobre en concentraciones de 3, 6 y 9 ppm se utilizaron para desinfectar las piñas mediante un proceso de inmersión de 3, 6 y 9 min (tiempo de residencia). Luego de cada tratamiento y un tiempo determinado de días posterior a la inmersión se tomó una porción de la superficie de cada muestra de piña y se sembró en medios de cultivo para cuantificar el Fusarium sp. El modelo de la investigación siguió un diseño experimental de 32 que incluyó diferentes combinaciones de concentraciones y tiempos de inmersión para evaluar su efectividad en la inhibición del crecimiento del hongo en la superficie del fruto. Como grupo de control se emplearon piñas tratadas con agua destilada para su desinfección, el tratamiento de la muestra fue similar a las que fueron tratadas con las soluciones de nanocobre.
Aislamiento de cepas
Castro y Umaña [22] mencionan la presencia de una gran variedad de hongos en la superficie de las frutas, por lo que, en esta investigación, se aisló el Fusarium sp. presente en las piñas visiblemente sanas proporcionadas por una empresa exportadora. Para ello se siguió la metodología mencionada por Umaña et al. [23], quienes señalan que para aislar el hongo se deben extraer 5 cm2 de cáscara de piña y colocarla en un beaker que contenga 30 mL de agua destilada estéril con una gota de Tween 20 (polisorbato 20 que facilita la dispersión de tejidos y células evitando la aglomeración de partículas), y agitar durante 5 min con el objetivo de liberar los microorganismos presentes en la superficie. Posteriormente se utilizó el método de dilución seriada estándar con dos diluciones (102) y se tomó de cada dilución una muestra de 100 μL para distribuir uniformemente sobre la caja Petri con medio de cultivo de agar de papa y dextrosa (PDA), utilizando un asa de Digralsky.
Tinción de placas
Se prepararon laminillas (portaobjeto con cubreobjeto) siguiendo la metodología de López-Jácome et al. [24] para identificar microscópicamente las cepas fúngicas. Se colocó una gota de azul de lactofenol en un portaobjetos, se seleccionó la cepa a analizar y, con la ayuda de un asa esterilizada, se tomó una muestra de micelio de la placa de Petri y se depositó en la gota mencionada anteriormente. Finalmente, se observó la estructura del hongo en el microscopio, los macroconidios y los microconidios, para determinar a qué género pertenecía [25].
Caracterización de los síntomas de fusariosis en las piñas
Mediante la inspección visual, se realizó una caracterización detallada de la sintomatología asociada a la fusariosis en los frutos de piña. Esto permitió confirmar la infección por Fusarium sp. en las pi-ñas utilizadas en esta investigación, asegurando que los frutos analizados presentaban la enfermedad y eran adecuados para su uso en el estudio.
Preparación de las muestras de estudio
Para reducir los microorganismos competidores en la superficie de las muestras de piña, se desinfectaron y eliminaron los restos de la corona y el pedúnculo, también se lavó y se retiró toda la materia extraña con una solución jabonosa. Finalmente, se sumergieron en un recipiente que contenía alcohol etílico a 99° GL durante 3 min, utilizando movimientos rotativos para que el alcohol estuviera en contacto permanente con toda la superficie. Las piñas se dejaron reposar en una cámara de flujo laminar con luz natural y ventilación durante 15 min para evaporar el exceso de alcohol [26].
Inoculación del hongo
Las piñas que se sometieron a inhibición por inmersión en las soluciones de nanocobre se colocaron en una cámara de flujo laminar para proceder con la inoculación del hongo previamente aislado.
Con la ayuda de una aguja se realizaron unas heridas, se tomó una muestra del hongo (Fusarium sp.) aislado de las placas de Petri y se colocó en la superficie de la piña. El procedimiento se repitió en otro lugar de la fruta paralelo al primero ya inoculado, uno cerca de la corona y otro cerca del pedúnculo. Se dejó una piña no inoculada como muestra de control. Las piñas inoculadas se almacenaron en una cámara húmeda, donde el hongo pudo crecer bajo condiciones de humedad y temperatura ambiente durante un período mínimo de 4 días, después de este tiempo se procedió a las pruebas de inhibición durante diferentes tiempos de inmersión y evaluando el crecimiento de hongo a los 0 y 5 días de inmersión.
Preparación de soluciones de nanopartículas de cobre
Las soluciones de nanopartículas de iones de cobre se generaron utilizando el sistema de ionización electroquímica NEC-4000, diseñado para la producción de agua ionizada con cobre. El proceso empleó agua destilada, que fue ionizada mediante la transferencia controlada de iones de cobre en el equipo, siguiendo la metodología especificada por el fabricante. El sistema electroquímico cuenta con un microprocesador electrónico y electrodos de intercambio, que libera iones de cobre bajo la aplicación de una corriente continua. Con el objetivo de asegurar un flujo constante y uniforme de agua a través del equipo se utilizó una bomba peristáltica, lo que permitió la ionización precisa del agua a las concentraciones deseadas de 3, 6 y 9 ppm de nanocobre, utilizando un espectrofotómetro ultravioleta visible para cuantificar su concentración.
Evaluación del nanocobre en la inhibición del hongo
De acuerdo con las indicaciones descritas por Gutiérrez et al . [25], con algunas variaciones, se llevó a cabo esta parte de la evaluación. Una vez obtenidas las soluciones en las tres concentraciones de nanocobre, se calculó la cantidad de PDA para la inoculación. Se utilizó una marca comercial de agar TM MEDIA con certificación ISO 9001:2015, que establece que deben usarse 39 g para preparar 1 L de cultivo líquido, y se realizó la práctica por triplicado para cada una de las tres concentraciones de nanocobre, por lo tanto, para calcular la cantidad de agar líquido requerido se siguió la información de la tabla 1.
Tabla 1 Datos para la preparación del medio de cultivo.
| Concentración de cobre (ppm) | Replicas | Cantidad de agar líquido por placa (mL) | Cantidad total de agar líquido (mL) |
|---|---|---|---|
| 3 | 3 | 20 | 60 |
| 6 | 3 | 20 | 60 |
| 9 | 3 | 20 | 60 |
Las muestras de control no fueron sometidas a inmersión en soluciones de nanocobre, fueron tratadas únicamente con agua destilada para establecer un marco referencial con el objetivo de evaluar la eficiencia de las soluciones de 3, 6 y 9 ppm en el anillo de inhibición del crecimiento de Fusarium sp. Cada placa Petri requirió 20 mL de agar líquido, por lo que se utilizaron 60 mL para cada concentración de nanocobre.
Todos los medios preparados, junto con los testigos, se esterilizaron en autoclave para eliminar cualquier presencia de microorganismos y obtener un cultivo estéril. Inmediatamente después de la esterilización, se realizó el plaqueo para evitar que los medios se solidificaran antes de tiempo.
Siembra del hongo
Se aplicó la metodología descrita por Nieto y Bailón [28], tomando como referencia 20 mL de medio de cultivo PDA por placa de Petri. Una vez que se plaquearon todas las concentraciones de nanocobre en las placas Petri, se permitió que el medio de cultivo se solidificara, evitando movimientos bruscos y con contacto mínimo para evitar cualquier contaminación.
Con la ayuda de un asa se extrajo un disco de micelio del hongo y se sembró en el centro de la placa, evitando el contacto con la superficie restante del agar, con el fin de obtener buenos resultados y evitar la propagación del hongo. Durante cada siembra se esterilizó el asa mediante la llama del mechero para evitar la contaminación por contacto.
Cálculo del porcentaje de inhibición
Para calcular el porcentaje de inhibición se tomó como referencia el diámetro de crecimiento de la cepa inoculada y se contrastó con el diámetro de la muestra de control o sin tratar, para ello se utilizó la Ec. (1) [29]:
Donde DC es el diámetro de la muestra de control y DT el diámetro de la muestra inoculada. Las mediciones a los diámetros de las colonias se hicieron cada dos días utilizando un calibrador. La medición finalizó cuando la muestra de control cubrió toda la superficie de la placa de Petri.
Desinfección de piñas por inmersión
Se utilizaron tres tiempos de inmersión (3, 6 y 9 min) y tres concentraciones (3, 6 y 9 ppm) para el proceso de desinfección por inmersión de las piñas. Se emplearon nueve recipientes para lavar y desinfectar diferentes frutas con tres diferentes concentraciones y en tres tiempos de inmersión. Cada uno contenía una concentración determinada en orden ascendente. De esta manera, una piña se sumergía en el recipiente correspondiente con una concentración y durante el tiempo establecido hasta que se utilizaron nueve piñas, además de la muestra de control, que fue sumergida únicamente en agua destilada, en duplicado, como se describe en la tabla 2.
Tabla 2 Número de piñas por tratamiento aplicado.
| Concentración (ppm) | |||
|---|---|---|---|
| Tiempo (min) | 3 | 6 | 9 |
| 3 | 1** | 2** | 3** |
| 6 | 4** | 5** | 6** |
| 9 | 7** | 8** | 9** |
Cada número indica el número del tratamiento o unidad de piña utilizada. Se deben contar dos piñas adicionales utilizadas en el tratamiento de control (0). Los asteriscos (*) señalan diferencias significativas entre los tratamientos.
Una vez finalizada la desinfección por inmersión durante los tiempos antes mencionados (3, 6 y 9 min), se realizó un enjuague breve con agua destilada esterilizada, 100 mL para cada tratamiento, sobre toda la superficie de la piña, considerando que el agua estaba en contacto con el tallo, la corona y la cáscara. Después de este procedimiento se realizó inmediatamente (0 días) un hisopado de la superficie de las piñas para contar el hongo, luego cada piña se almacenó herméticamente para volver a cuantificar el hongo en la superficie de las nueve piñas después de 5 días.
Control del hongo en la superficie de las piñas mediante placas Petrifilm ®
Se utilizaron placas 3M Petrifilm® para colocar el hisopado de las superficies de las piñas y poder contar las unidades formadoras de colonias (UFC) del hongo durante el día 0, en los diferentes tiempos de inmersión y concentraciones de nanocobre, siguiendo la Guía de Información de 3M Petrifilm® [30]. El conteo del hongo se volvió a realizar 5 días después de la inmersión de las piñas en las soluciones tratadas con nanocobre.
Resultados y discusión
Se identificó macro y microscópicamente la presencia del hongo Fusarium sp., de acuerdo a las características reportadas por Salazar et al. [31] y Hernández et al. [32], quienes mencionan que sus colonias aisladas en medio PDA al comienzo son lisas y algodonosas, posteriormente se tornan un poco lanosas, de coloración blanca en la parte superior y en la parte inferior de coloración grisácea, tal como se observa en la figura 1 (identificación macroscópica). Por su parte, a nivel microscópico las colonias presentaron conidios abundantes.
Los síntomas de la enfermedad que presentaron los frutos consistieron en pequeñas manchas irregulares de color café claro en el pericarpio y un color miel claro en la pulpa. A medida que la enfermedad progresaba, las manchas se volvieron color café oscuro, el área necrosada aumentó y el tejido afectado adquirió una apariencia flácida y húmeda. Se observó que las lesiones fueron superficiales, aunque algunas se extendieron hasta el centro de la fruta, provocando la pérdida de rigidez y la decoloración de la pulpa. Con el avance de la enfermedad, las manchas se extendieron y la pulpa mostró una clara maceración de los tejidos. En los tejidos lesionados apareció un micelio de color blanco.
El análisis de los datos obtenidos se realizó con ayuda al software Statgraphics Centurion versión 19.3.03, en donde se llevaron a cabo pruebas de varianza ANOVA, de las que se esperaba un valor p < 0,05. Se obtuvieron las desviaciones estándar y se realizaron pruebas de múltiples rangos por el método de 95% de LSD. La elaboración de gráficas de las dos superficies de respuesta se realizó en el Minitab 20, versión 20.3.0; también se usó el procesador de gráficas de Excel Profesional Plus 2016 para el análisis de las curvas de comportamiento del crecimiento del hongo.
En este sentido, la figura 2 muestra la comparación del crecimiento de los micelios de Fusarium sp. in vitro durante la evaluación del anillo de inhibición cuando se pusieron en contacto con las soluciones de nanocobre, con cada una de las tres concentraciones.
Figura 2 Diámetro del anillo de inhibición del Fusarium sp. durante ocho días de exposición a las soluciones de nanocobre a diferentes concentraciones.
En la figura 2 se puede observar que a partir del segundo día existe un aumento en el diámetro del micelio fúngico en todos los tratamientos. El diámetro mayor correspondió a la muestra control (sin tratamiento con nanocobre, línea azul), con un diámetro máximo promedio de 9,25 cm. Mientras que, para las muestras sometidas a los tres tratamientos de nanocobre, se obtuvieron valores de diámetro promedio menores de 6,85; 5,94 y 5,34 cm de diámetro para las concentraciones de 3, 6 y 9 ppm, respectivamente, con un valor de p = 0,0002 para este conjunto de datos. La mayor inhibición sobre el diámetro del micelio fúngico se obtuvo a partir de la solución de 9 ppm (línea verde). Los valores de diámetro del anillo de inhibición permiten concluir que existen diferencias significativas entre cada tratamiento y un mayor crecimiento del hongo en la muestra de control. Los resultados también mostraron variaciones en los diámetros del anillo fúngico de 3,8; 3,1 y 2,8 cm en comparación al control para las concentraciones de 3, 6 y 9 ppm, respectivamente.
Observamos que a medida que aumentaba la concentración de la solución de nanopartículas de cobre, se redujo el crecimiento mi-celial de Fusarium sp. El tratamiento de 9 ppm redujo el crecimiento micelial de Fusarium sp. en un 50,7% en comparación con la muestra de control, el diámetro micelial disminuyó de 10,55 a 4,93 cm. Además, la tabla 3 muestra diferencias significativas entre los parámetros de concentración y los días, ya que el valor p para cada variable es < 0,005. Sin embargo, la figura 2 también evidencia que las concentraciones utilizadas no inhiben completamente el crecimiento del micelio de Fusarium sp.
Tabla 3 Análisis de varianza (ANOVA) para el crecimiento micelial realizada en Statgraphics V. 19.3.03.
| Fuente | Suma de cuadrados | GL | Media cuadrada | Ratio F | Valor p |
|---|---|---|---|---|---|
| A: concentración | 29,624 | 3 | 9,875 | 9,646 | 0,002 |
| B: días | 125,567 | 4 | 31,392 | 30,657 | 0,000 |
| Residuos | 12,289 | 12 | 1,024 | ||
| Total (corregido) | 167,482 | 19 |
Por su parte, la tabla 4 presenta el análisis estadístico de las diferencias entre las tres concentraciones de nanopartículas de cobre aplicadas. Según esta tabla, se pudo determinar que no hay diferencias significativas en el crecimiento micelial entre los tratamientos con 6 y 9 ppm de nanocobre.
Tabla 4 Pruebas de rango múltiple para la concentración de nanocobre.
| Contraste | Significancia estadística | Diferencias | Límites |
|---|---|---|---|
| 0-3 | * | 1,70 | |
| 0-6 | * | 3,93 | |
| 0-9 | * | 5,07 | |
| 3-6 | * | 2,23 | |
| 3-9 | * | 3,37 | |
| 6-9 | 1,13 |
Contraste 0: muestra de control.
* indica diferencias significativas entre tratamientos.
Adicionalmente, las tablas 5y 6 presentan las UFC/mL de Fusarium sp. en la superficie de las piñas desinfectadas, a los 0 y 5 días después de la inmersión en las soluciones de diferentes concentraciones de nanopartículas de cobre y con distintos tiempos de inmersión.
Tabla 5 UFC/mL de Fusarium sp. en las soluciones de inmersión de piñas durante el día 0 de desinfección.
| Concentración (ppm) | |||
|---|---|---|---|
| Tiempo (min) | 3 | 6 | 9 |
| 3 | 18,3 ± 1,4 a | 15,5 ± 0,7 a | 9,5 ± 0,7 a |
| 6 | 14,1 ± 1,4 b | 11,0 ± 1,4 b | 6,0 ± 1,4 b |
| 9 | 9,5 ± 0,7 c | 6,5 ± 0,7 c | 3,5 ± 0,7b |
Diferentes letras por columna indican una diferencia significativa (p < 0,05).
Tabla 6 UFC/mL de Fusarium sp. en las soluciones de inmersión de piñas después de 5 días de la desinfección.
| Concentración (ppm) | |||
|---|---|---|---|
| Tiempo (min) | 3 | 6 | 9 |
| 3 | 9,5 ± 0,7 a | 7,0 ± 0,0 a | 4,5 ± 0,7 a |
| 6 | 7,0 ± 0,0 b | 4,5 ± 0,7 b | 2,5 ± 0,7 b |
| 9 | 4,5 ± 0,7 c | 2,0 ± 0,0 c | 0,5 ± 0,7 b |
Diferentes letras por columna indican una diferencia significativa (p < 0,05).
Por otro lado, la figura 3 muestra las variaciones en las UFC/mL de Fusarium sp. en la superficie de las piñas durante el día 0 de desinfección a diferentes concentraciones de nanopartículas de cobre y tiempos de inmersión, mientras que la figura 4 muestra las UFC/mL durante el día 5 después de la desinfección. Se pueden evidenciar las diferentes respuestas en el número de UFC obtenidas, hay un comportamiento inversamente proporcional entre las UFC/mL y la concentración de nanopartículas de cobre en conjunto con el tiempo de inmersión. El mejor tratamiento resultó ser la inmersión de las piñas en la solución de nanopartículas de cobre a una concentración de 9 ppm. En este tratamiento se obtuvieron 3,5 X 103 y 0,5 X 103 UFC/mL a día 0 y al día 5, respectivamente, ambos con a ± 0,7 UFC/mL. Estos valores son inferiores a los obtenidos en las piñas no sumergidas en las soluciones de iones de cobre, las UFC/mL para la piña no tratada tenían un valor de 27 X 103 ± 1,4 en el día 0 y de 49,5 X 103 ± 0,7 en el día 5. Es decir, se logró una reducción del 98,14% de las UFC/mL de Fusarium sp. sobre la superficie de la piña después de 5 días de inmersión. Estos resultados fueron consistentes con las pruebas obtenidas para el anillo de inhibición de crecimiento de Fusarium sp. a 9 ppm en placas Petri.
Figura 3 Efecto de nanocobre a diferentes concentraciones y tiempos de inmersión en la reducción de UFC/mL de Fusarium sp. en la superficie de piñas durante el día 0 de desinfección
Figura 4 Efecto de nanocobre a diferentes concentraciones y tiempos de inmersión en la reducción de UFC/mL de Fusarium sp. en la superficie de piñas después del día 5 de desinfección
Por otro lado, las tablas 7 y 8 muestran que los factores estudiados, concentración de nanocobre y tiempo de inmersión, tienen un efecto estadísticamente significativo en el crecimiento del Fusarium sp., además de ser iguales entre sí, ya que tienen el mismo valor de p = 0,00, utilizando un nivel de confianza del 95%.
Tabla 7 Efecto significativo de la concentración de nanocobre en el crecimiento de Fusarium sp. (p = 0,00 95% de confianza).
| Fuente | Suma de cuadrados | GL | Media cuadrada | Ratio F | Valor p |
|---|---|---|---|---|---|
| A: concentración | 184,111 | 2 | 92,056 | 74,545 | 0,000 |
| B: días | 172,111 | 2 | 86,056 | 69,683 | 0,000 |
| Residuos | 16,056 | 13 | 1,235 | ||
| Total (corregido) | 372,278 | 17 |
Tabla 8 Efecto significativo del tiempo de inmersión en el crecimiento de Fusarium sp. (p = 0,00; 95% de confianza).
| Fuente | Suma de cuadrados | GL | Media cuadrada | Ratio F | Valor p |
|---|---|---|---|---|---|
| A: concentración | 61,00 | 2 | 30,50 | 108,14 | 0,00 |
| B: días | 65,33 | 2 | 32,77 | 115,82 | 0,00 |
| Residuos | 3,67 | 13 | 0,28 | ||
| Total (corregido) | 130,00 | 17 |
Esto se evidencia en los promedios generales mostrados en las figuras 5 y 6, donde, al realizar el análisis para cada tiempo de inmersión, hay valores mayores a p = 0,05. El valor de p en el día 0 es de 0,0142; 0,0067 y 0,0211, y en el día 5 de 0,0075; 0,0101 y 0,0139, en los tiempos de inmersión de las frutas a 3, 6 y 9 min, respectivamente. Esto indica que la concentración de nanocobre tiene un efecto significativo entre cada tiempo de inmersión utilizado. Se obtuvo un promedio de 6,33 ± 2,80 X 103 UFC/mL para 3 ppm y de 2,33 ± 1,86 X 103 UFC/mL para el tratamiento 9 (9 ppm durante 9 min), en cada una de las mediciones de tiempo de desinfección realizadas (0 y 5 días).
Figura 5 Medias de las colonias (UFC/mL) de Fusarium sp. en la superficie de las piñas durante el día 0.
Figura 6 Medias de las colonias (UFC/mL) de Fusarium sp. en la superficie de las piñas durante el día 5.
Además, los resultados presentados en este trabajo tienen una validez significativa, como se demostró anteriormente. Sin embargo, al analizar las medias de cada grupo por factor de datos obtenidos, notamos que algunas de ellas tenían un comportamiento estadísticamente similar al analizar mediante el método LSD 95%, como se muestra en la tabla 9.
Tabla 9 Heterogeneidad entre las medias de tratamiento.
| Tiempo (min) | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Concentración (ppm) | 3 (+) | 6 (+) | 9 (+) | 3 (-) | 6 (-) | 9 (-) |
| 3 | a 1 | a 1 | a 2 | a 1 | a 2 | a 3 |
| 6 | b 1 | b 1 | b 2 | b 1 | b 2 | b 3* |
| 9 | c 1 | c 2 | b 3 | c 1 | c 2* | b 2 |
+: indica mediciones de UFC obtenidas en la superficie de piñas durante el día 0.
—: indica mediciones tomadas el día 5 después de la desinfección.
* mejores tratamientos.
Diferentes letras en la misma columna y diferentes números en las filas indican diferencias significativas p < 0.05.
Por lo tanto, los mejores tratamientos en el día 0 fueron la desinfección por inmersión de las piñas durante 9 min en la solución de cobre de 6 y 9 ppm. Por su parte, en el día 5, se encontraron cuatro opciones estadísticamente viables: desinfectar las piñas durante 9 min con 6 o 9 ppm, o sumergir las piñas en 9 ppm durante 6 o 9 min.
Comparamos los resultados obtenidos en la investigación con los obtenidos por Hernández et al. [33], Betancour et al. [34] y Leyva et al. [35], quienes describen que las colonias aisladas de Fusarium sp. en medio PDA tienen un aspecto algodonoso blanco. Las coloraciones en los contornos del asentamiento pueden ser amarillas, grises, rojas, moradas o violetas (en nuestro caso eran gris blanquecino), dependiendo de la especie analizada. Además, dependiendo del nivel de purificación y del material fuente, las cepas pueden mutar de un tratamiento a otro. Microscópicamente, los mismos autores describen que los hongos del género en cuestión se caracterizan por formar macroconidias, microconidias y polifialides, que pueden o no estar agrupadas.
Morais da Silva et al. [36] mencionan que 14 días después de comenzar la incubación, usando F. guttiforme, obtienen valores entre 4 a 10 cm de diámetro para una cepa de control, mientras que Krzysko-Łupicka et al. [37] describen valores promedio de control de 8,5 cm para cepas de F. graminearum. Por su parte, Al-Rajhi et al. [38] mencionan que su control tenía un diámetro de 8,2 cm para F. incarnatum. Por lo tanto, los valores obtenidos en la investigación concuerdan con los encontrados por estos autores. Las ligeras diferencias pueden deberse al comportamiento independiente de cada especie en el género Fusarium.
Según Ahnert dos Santos et al. [39], al usar soluciones de CuSO4 en concentraciones de 10 a 20 mmol/L en F. solani, estas podrían inhibir completamente el crecimiento de la colonia, teniendo un efecto fungistático en el sexto día de análisis al usar una concentración de 5 mmol/L. Por su parte, Galal et al. [40] estudiaron el impacto de nanopartículas de cobre en cepas de F. oxysporum, obteniendo un resultado fungicida al usar concentraciones de 250 μg/mL. Esto muestra que a concentraciones más altas que las utilizadas en la investigación, se obtienen resultados letales en especies específicas de Fusarium.
Otros autores como Leon y Mattos [41] investigaron el efecto de la aplicación de proteína de cobre en el crecimiento de Fusarium verticillioides, donde lograron un porcentaje mínimo de inhibición del 87,67%, con mejores resultados cuando la solución de cobre se combinó con otros componentes biológicos. Asimismo, Pariona et al. [42] informaron que, utilizando concentraciones mínimas de 0,1 mg/mL, se logró una inhibición del 58%, mientras que con concentraciones de 1 mg/mL, la inhibición fue del 78%. Se obtuvieron resultados similares con un porcentaje de inhibición del 72,25% utilizando sulfato cúprico [43].
Además, Shivanad et al. [44] informaron propiedades antifúngicas de nanopartículas de cobre sintetizadas químicamente contra Fusarium sp. en condiciones ex vivo. Todas las nanopartículas inhibieron el crecimiento micelial de C. capsicin a 1000 ppm en comparación con el control. CuNP-M fue muy influyente en la inhibición del crecimiento micelial a 1000 ppm (99,78%), seguido de CuNP-E a 1000 ppm (93,75%). Los fungicidas estándar, oxocloruro de cobre al 50% WP @ 2500 ppm, reportaron 85,19%, seguido de carbendazim al 50% WP a 500 ppm con una inhibición del crecimiento del 72,69%.
La actividad antifúngica in vitro de las nanopartículas de óxido de cobre (CuO) también se ha evaluado. Su mayor porcentaje de inhibición en el crecimiento radial del micelio de F. oxysporum se midió en 91,92 ± 0,16% a 350 μg/mL, en contraste con el control no tratado (p < 0,05) [45].
Es importante mencionar que se debe establecer la cantidad de residuos de cobre (Cu) que queda en los alimentos, esto se debe a que, aunque el cobre es un mineral esencial, en concentraciones elevadas puede ser tóxico y perjudicial para la salud. En este sentido, Taylor et al. [46] reportaron que la concentración de Cu que puede ser ingerida por humanos es de 1,3-2,2 mg de Cu a través de suplementos. Por otro lado, Bost et al. [47] afirman que las dosis por debajo de 0,8 mg tienden a tener pérdidas de absorción, mientras que lo opuesto ocurre con cantidades de 2,4 mg.
Conclusiones
El crecimiento del anillo de inhibición de Fusarium sp. en agar PDA, preparado con soluciones de nanopartículas de cobre a una concentración de 9 ppm, se redujo hasta un 53% en comparación con el tratamiento de control.
Al comparar los valores de UFC/mL del hongo presentes en la superficie de la piña durante el día 0 de desinfección con los UFC/mL del día 5 después de la desinfección de las piñas en las soluciones de nanocobre a 3, 6 y 9 ppm , se logró un efecto antifúngico, debido a la reducción del número de colonias del hongo en la superficie de las piñas sometidas a todos los tratamientos.
En este sentido, los mejores tratamientos para la piña en lo referente al día 0 de desinfección fueron la inmersión de las piñas durante 9 min en la solución de nanocobre a 6 y 9 ppm de concentración. Por su parte, para el día 5 después de la desinfección por inmersión, se establecieron cuatro opciones estadísticamente viables: desinfectar las piñas durante 9 min en soluciones con concentraciones de 6 o 9 ppm, o sumergir las piñas en soluciones de 9 ppm de nanocobre durante 6 o 9 min.
Además, existieron diferencias significativas entre las UFC/mL del hongo en cada tratamiento de soluciones de nanocobre aplicado y más aún cuando se comparó con el crecimiento del hongo en la muestra de control. Por lo tanto, se demostró que la aplicación de nanocobre es efectiva como inhibidor del crecimiento de Fusarium sp. en la superficie de piñas durante la poscosecha, pues disminuye significativamente su crecimiento y, por ende, las pérdidas de producción por degradación fúngica de esta fruta de exportación.
