Equipo para detección de fluorescencia

Los análisis fueron realizados en un lector multimodal Cytation 3 (BioTek®, USA), ubicado en el Laboratorio de Toxicología y Biotecnología de la Universidad de los Llanos, el cual tiene como fuente de excitación una lámpara laser de xenón (100 mW) y un cuádruple monocromador, además de un tubo fotomultiplicador para la detección de la emisión secundaria emitida por las moléculas. La amplitud de hendidura de la rejilla (slit width) del monocromador está fijada de fábrica a 16 nm. Todas las lecturas fueron realizadas en placas Nunc (Thermo Scientific) de 96 pozos de color negro en polipropileno.

Preparación de soluciones madre

Se utilizaron cuatro hidrocarburos de grado analítico 99%: fenantreno (PHE) (Sigma-Aldrich), antraceno (ANT) (Merck), fluoranteno (FLU) (Tokyo Chemical) y pireno (PYR) (Merck). De cada uno se prepararon soluciones stock a concentración de 1 ppt en metanol (para análisis, EMSURE® ACS, ISO, Merck) ²³. Las soluciones se almacenaron bajo refrigeración hasta por 30 días.

Determinación de espectros de emisión

Con el fin de identificar los espectros de excitación y emisión y las señales en pico con mayor fluorescencia, se hicieron lecturas para cada hidrocarburo a una concentración de 250 ppm. Para la medición del espectro de excitación se usó el intervalo desde los 250 hasta los 360 nm; mientras que para el espectro de emisión se usó el intervalo desde los 300 hasta los 500 nm. Adicionalmente, se preparó una solución con los cuatro HAP a una concentración de 250 ppm por cada uno para determinar el comportamiento fluorescente de los hidrocarburos en una mezcla.

Determinación del límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ)

Para cada hidrocarburo, se preparó una curva estándar de dilución seriada con 9 diferentes puntos desde 0 hasta 1 ppm (1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,063; 0,031; 0,016; 0,008 y 0) usando metanol como diluyente. Este procedimiento se realizó por cuadruplicado, con el fin de reducir el error experimental y aumentar la precisión de la determinación. Teniendo como base la mayor señal espectral para cada compuesto, se midió la fluorescencia de onda fija de cada dilución a la excitación específica de cada uno de los hidrocarburos evaluados. Los valores de fluorescencia obtenidos se reportaron como unidades arbitrarias fluorescentes.

Los cálculos para determinar el límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ) se calcularon con las Ec. (1) y (2):

Donde Y_b es la señal del blanco y S_b es la desviación estándar de la pendiente de la regresión lineal ²⁴.

Preparación y extracción de muestras dopadas de agua

Este procedimiento se siguió de acuerdo con el método ASTM-D5412 ²⁵, se utilizaron 500 mL de agua desionizada para cada hidrocarburo y se adicionaron de forma separada a una concentración de 50 ppb. Este proceso se realizó por triplicado para cada hidrocarburo.

Para la extracción se usó solvente diclorometano (para análisis, EMSURE® ACS, ISO, Merck) al 20% del volumen total de la muestra preparada. El volumen de solvente se dividió en tres partes, cada parte se agitó individualmente con la muestra de agua en un embudo de decantación durante al menos 2 min con pausas para permitir la liberación de la presión de los gases. La mezcla de agua y diclorometano se dejó reposar a temperatura ambiente (25 °C) por al menos 10 min para permitir la separación de capas y proceder a retirar el solvente en un erlenmeyer. El procedimiento se repitió con las otras partes del solvente.

Una vez se obtuvieron las tres partes de solvente, se mezclaron y se llevaron al rotoevaporador RV 10 (IKA, USA) a una temperatura de 60 °C para concentrar la muestra hasta 1 mL. Finalmente, con el fin de evitar una pérdida por evaporación de diclorometano (presión de vapor = 0,533 bar, 24 °C) se realizó una dilución con metanol en una relación final 1:10 para su lectura en microplacas de polipropileno de 96 pozos.

A partir de la curva de calibración se calculó la concentración inicial y la concentración final se calculó con la Ec. (3):

Donde C_c es la concentración inicial a partir de la curva de calibración, V_s es el volumen del solvente usado en la dilución de la muestra y V_T es el volumen de agua de la muestra de la cual fue extraído.

Preparación y extracción de muestras dopadas de sedimentos

Se colectaron sedimentos en el lecho de un riachuelo (4°04'42" N, 73°34'58" W), ubicado en una zona rural, sin intervención de actividades humanas circundantes y aparentemente libre de contaminación por hidrocarburos. Con ayuda de un tubo en PVC de 2,54 cm de diámetro y 25 cm de longitud se colectaron las muestras de sedimentos hasta alcanzar aproximadamente 1000 g. Esta actividad se realizó en un trayecto no mayor a 10 m río arriba, con el fin de no tomar muestras en el lecho del riachuelo intervenido.

Los sedimentos se transportaron hasta el Laboratorio de Toxicología y Biotecnología en bolsas plásticas resellables, se pesaron y después se pusieron a secar en horno durante 24 h, a una temperatura mayor a 60 °C para facilitar la volatilización de cualquier compuesto que pudiera intervenir con la medición. Una vez seco el material, y buscando tener un tamaño homogéneo de partícula que permitiera una mejor adherencia y extracción de los hidrocarburos ²⁶, ²⁷, las muestras se filtraron por un tamiz de acero inoxidable con ojo de malla menor a 300 μm de diámetro, esta fracción fue la que se usó para su contaminación.

Para realizar la contaminación individual de cada hidrocarburo, se usaron 7 g de sedimento en una caja de Petri y se les aplicó una solución de 50 ppb de cada hidrocarburo en 5 mL de metanol para cada uno, se hizo la exposición por triplicado. La solución se aplicó con una micropipeta, se distribuyó sobre toda la superficie para humedecer toda la muestra de sedimento, se dejó en reposo a temperatura ambiente y cubierta con la tapa de la caja Petri durante 10 min para aumentar el tiempo de contacto del sedimento. Posteriormente se abrió el recipiente y se cubrió con papel de aluminio perforado para permitir la evaporación del metanol y evitar algún efecto de degradación lumínica de los HAP ²⁸.

Una vez se obtuvo la muestra contaminada, se introdujo en un papel filtro en la cámara de extracción del equipo Soxhlet y se agregó diclorometano en el balón de fondo redondo a una relación de 1:10 (sedimento:solvente). El equipo Soxhlet se configuró con el fin de realizar seis reflujos por hora durante 4 h con el fin de permitir la liberación de los analitos de la muestra.

Finalizadas las 4 h, el solvente se transfirió a un balón con acople para rotaevaporador y se concentró el extracto orgánico a una temperatura de 60 °C hasta 1 mL aproximadamente. Posteriormente, se diluyó con metanol en una relación 1:10, con el fin de realizar la lectura con las placas de poliestireno, el anterior procedimiento fue hecho con base al método EPA 3540B ²⁹.

La concentración final de cada muestra de sedimento se calculó teniendo en cuenta el valor obtenido por medio del análisis de regresión lineal. El valor obtenido se multiplicó por el factor de dilución de la muestra. Finalmente, para obtener el porcentaje de recuperación se aplicó la Ec. (4) ³⁰:

Dónde C_i es la concentración inicial aplicada a la muestra de suelo o agua y C_f es la concentración obtenida a partir de los cálculos para agua o suelo.

Tanto para los sedimentos como para el agua, se realizó una mezcla de los cuatro hidrocarburos (PHE, PYR, FLU y ANT) a una concentración de 50 ppb cada uno. Se realizó por triplicado para cada matriz con el fin de evaluar el método de recuperación y el comportamiento fluorescente en cada matriz con varios hidrocarburos. Los procedimientos se siguieron tal y como se describieron para cada matriz.

Análisis estadístico

Los datos obtenidos fueron analizados en Excel 2016 (Microsoft, USA), en el programa se realizó el análisis regresión lineal sobre las curvas de calibración de cada hidrocarburo. Los datos de extracción, detección y cuantificación se presentan como la media ± desviación estándar. El análisis espectral y la elaboración de las gráficas se realizaron en Matlab (ver R2023b).

Espectros de emisión

Fue posible identificar las señales de excitación en pico y las longitudes de emisión en pico utilizando escaneo espectral para los cuatro diferentes HAP. Para ANT, PHE, FLU y PYR, las longitudes de excitación en pico fueron 330, 293, 329 y 330 nm, respectivamente, y las longitudes de emisión en pico fueron 401, 363, 459 y 384 nm, respectivamente (figura 1). A pesar de que el equipo Cytation 3 no tiene una buena definición espectral debido a su configuración de fábrica (slit width: 16 nm), es posible diferenciar cada espectro con base en la estructura de fluorescencia identificada particular para cada caso.

Los fluorómetros de alto rendimiento con apertura de hendidura variable permiten ajustar con precisión la selectividad y la sensibilidad en la discriminación y medición de fluoróforos. El aumento del ancho de banda de excitación conduce a una mayor energía de excitación, mientras que el aumento de la energía de excitación conduce a una mayor intensidad de fluorescencia ³¹. Es importante destacar que la fluorescencia del blanco es insignificante respecto a la fluorescencia de los hidrocarburos evaluados.

Para el caso del PYR, se destaca un pico de emisión predominante a 459 nm, el cual puede ser provocado por el excímero generado entre el PYR y el metanol, el tiempo de vida de la fluorescencia y su estado entre los niveles vibracionales ³², ³³.

Figura 1. Espectro de emisión de antraceno (ANT), fenantreno (PHE), pireno (PYR) y fluoranteno (FLU) a concentración de 250 ppm en metanol. 

En la figura 1 es posible identificar los espectros de emisión de cada hidrocarburo de manera individual; sin embargo, los espectros de FLU y PYR se superponen, lo que conlleva a un reto mayor para identificarlos individualmente en mezcla como se evidencia en la figura 2, allí también se observa el espectro de la mezcla de los cuatro hidrocarburos en las dos excitaciones reportadas previamente. En ninguno de los dos espectros se pueden diferenciar claramente los espectros de FLU ni el segundo pico de PYR; en cambio, se observa una sola señal de fluorescencia en pico producto de una posible aditividad de señales, en el momento en que FLU y PYR tienen el pico de emisión en la misma longitud de onda (459 nm). Este comportamiento ha sido observado con otros fluoróforos con los que se realiza la determinación simultánea y se logra diferenciar cada uno de los espectros por medio de algoritmos de regresión lineal ³⁴.

Por otro lado, como se observa en la figura 2, tanto ANT como PYR, que tienen una señal de fluorescencia en pico de emisión a 384 nm, son completamente diferenciables en la mezcla. Adicionalmente, el PHE aparentemente se mimetiza por la intensidad del ANT, el cual tiene una mayor intensidad (fluorescencia) y solo se observa un hombro a la longitud de onda de emisión de este hidrocarburo (363 nm). A partir de este análisis se puede establecer que el comportamiento fluorescente de los HAP evaluados es dependiente de los fluoróforos que se encuentran en la mezcla, y no de su estado individual.

De acuerdo con lo reportado por Patra y Mishra ²³, la cantidad de hidrocarburos presentes en una mezcla puede modificar la calidad de identificación de los compuestos a nivel individual, e incluso modificar la efectividad de la medición si se desconocen los compuestos. Por otra parte, Sunuwar y Manzanare ³⁵ reportan que la medición convencional de fluorescencia puede ser compleja y no necesariamente revelar la totalidad de los compuestos en la mezcla, por lo tanto, aseguran que la combinación de técnicas adicionales como la fluorescencia asincrónica y algunas herramientas computacionales pueden permitir realizar una medición mucho más completa y precisa. Esta premisa indica que el trabajo en perspectiva puede continuar con la integración de herramientas estadísticas o técnicas complementarias que aumenten la precisión en la detección de los compuestos tipo hidrocarburos.

Figura 2. Espectros de emisión de una mezcla de pireno (PYR), antraceno (ANT), fenantreno (PHE) y fluoranteno (FLU) a concentración de 250 ppm cada uno. 

Determinación del límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ)

Con base en las curvas estándar y la regresión lineal se determinaron el LOD y el LOQ para el equipo Cytation 3, los cuales se reportan en la tabla 1. Los LOD estuvieron entre 0,0183 y 0,0891 ppm, siendo el más bajo para el ANT, mientras que los LOQ se ubicaron entre 0,0608 y 0,2816 ppm, siendo el menor valor también para el ANT. Estos datos nos indican que gracias a sus propiedades fluorescentes los compuestos pueden ser detectados a muy bajas concentraciones.

Tabla 1. Límite de detección (LOD) y límite de cuantificación (LOQ) para antraceno (ANT), pireno (PYR), fluoranteno (FLU) y fenantreno (PHE). 

Los valores son la media ± desviación estándar.

En la tabla 2 se presenta el análisis de regresión lineal realizado para los hidrocarburos evaluados. Es posible identificar que para los cuatro HAP la regresión lineal se ajustó apropiadamente de acuerdo con el parámetro de determinación R² > 0,99; además, se evidencia una linealidad entre la concentración de los compuestos y la intensidad de fluorescencia.

Tabla 2. Análisis de regresión lineal a partir de la curva de calibración de HAP diluidos en metanol. 

Concentración final y porcentaje de recuperación de las muestras por extracción Soxhlet

Los resultados de la determinación en muestras de agua de forma individual permiten evidenciar que hay una variación en el porcentaje de recuperación entre el 86 y el 101% para los cuatro hidrocarburos, siendo la mayor para FLU y la menor para PHE (tabla 3). Considerando que el porcentaje de recuperación se debe acercar al 100%, los valores obtenidos son aceptables para el método desarrollado de manera individual para cada hidrocarburo.

Un comportamiento similar fue reportado por Kafilzadeh et al. ³⁶, ³⁷ con porcentajes de recuperación para 16 hidrocarburos entre el 91 y el 96%. Caso contrario ocurrió con la medición de la mezcla de los cuatro hidrocarburos en agua porque los porcentajes de recuperación variaron considerablemente entre el 52 y el 146%, siendo el más alto para el ANT y el más bajo para el PHE (tabla 3). Esta variación en los valores de recuperación se puede explicar debido al comportamiento fluorescente observado para la mezcla de los cuatro hidrocarburos (figura 2), allí se genera posiblemente una interferencia de uno o más hidrocarburos al momento de realizar la detección de la emisión de cada hidrocarburo, esto ocasiona que haya valores de recuperación por encima del 100%, como se observa para el caso del PYR y el ANT.

Santa et al.³⁸ reportaron valores similares de extracción para hidrocarburos totales y volátiles usando extracción líquido-líquido, e indican que esto puede ocurrir por una volatilización de los analitos durante la etapa de evaporación previa a la determinación cromatográfica. Así mismo, destacan que el solvente diclorometano generó un solapamiento de señales y compuestos volátiles. En este sentido, se podría generar una coelución para la determinación fluorométrica de los compuestos.

Tabla 3. Concentración y porcentaje de recuperación de hidrocarburos en muestras dopadas de aguas y sedimentos con hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP). 

Los valores son la media ± desviación estándar.

Mezcla de los cuatro hidrocarburos a 50 ppb cada uno.

Con respecto a la determinación en muestras de sedimentos, la variación de los porcentajes de recuperación fue menor que en el agua. La medición individual de los cuatro hidrocarburos varió entre el 10 y 25%, siendo mayor para PYR y menor para FLU; mientras que la medición de la mezcla de los cuatro hidrocarburos varió entre el 8 y 36%, siendo mayor para PYR y menor para ANT. A partir de estos datos es posible inferir alguna de estas dos hipótesis:

1. La técnica de extracción Soxhlet con base en el tiempo y solvente usados no fueron adecuados para extraer y recuperar la muestra dopada (spike) de hidrocarburos, aunque existen reportes de la idoneidad de este método para la extracción de hidrocarburos en muestras sólidas en comparación con otras técnicas como baños de ultrasonido ³⁹. Así mismo, Castro-Guijarro et al.⁴⁰ reportan la importancia de utilizar un método de extracción mini Soxhlet acelerado que reduce el consumo de volumen de solvente y el tiempo de ejecución en un 90%. Esto indica una efectividad del método y una optimización de este. Por otro lado, si bien el método de ultrasonido es efectivo para la extracción de HAP en sedimentos, y es amigable con el medio ambiente debido a que el uso de solventes es menor o a que se puede sustituir un disolvente orgánico por otro tipo de sustancia como las micelas, los baños o las sondas de ultrasonido no son frecuentemente encontrados en los laboratorios ⁴¹.

2. La muestra dopada (spike) no se adhirió en su totalidad al sedimento, a pesar de contar con referencias que avalaban la prevalencia de adherencia a partículas de menor tamaño ²⁶, ²⁷. La evaporación de los compuestos con el solvente (metanol) puede ser la causa; sin embargo, se debe considerar que la presión de vapor de los compuestos evaluados varía entre 1,75 × 10⁻⁶ y 2,5 × 10⁻⁶ mm Hg ⁴², mientras que la del metanol es de 127 mm Hg ⁴³, considerablemente mucho más alta que la de los hidrocarburos.