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Introducción
El cáncer gástrico (CG) es el quinto cáncer más común y la cuarta causa de muerte por cáncer a nivel mundial, con una incidencia de cinco casos por cada 100.000 habitantes y una tasa de mortalidad a cinco años del 7,7 %1. En Colombia la incidencia es de siete casos cada 100.000 habitantes, con una mortalidad del 12%1. En la región andina del departamento de Nariño (sur de Colombia).
la incidencia de CG es una de las más altas del mundo, 150 casos por cada l00.000 habitantes, concomitante con el aumento en las tasas de mortalidad, 15.7% para el año 20182. El desarrollo del CG sigue un proceso secuencial que comienza en la niñez con gastritis crónica y progresa hacia atrofia gástrica, metaplasia intestinal, displasia y, finalmente CG3. La infección por Helicobacter pylori (H. pylori) es un factor clave en su etiología y ha sido catalogada como carcinógeno tipo I para los seres humanos4.
La erradicación de H. pylori es la única estrategia válida para prevenir la enfermedad, ya que el riesgo de CG en personas infectadas es de 2 a 8 veces mayor que en personas no infectadas5. Sin embargo, la erradicación con los tratamientos convencionales suele ser inferior al 80%6, y las terapias alternativas tienen limitaciones en términos de costo, toxicidad, disponibilidad y efectos adversos.
La resistencia progresiva de H. pylori a los antibióticos es una de las principales causas de fracaso en los tratamientos. Ante esta situación, los productos naturales de origen vegetal, debido a su capacidad para superar en alguna medida los efectos secundarios de los tratamientos de consenso de H. pylori para la región de Nariño, están ganando popularidad como posibles alternativas terapéuticas7,8. Entre ellos, los extractos de Cannabis sativa (C. sativa) han demostrado efectos farmacológicos y antimicrobianos, y el cannabidiol (CBD) ha mostrado actividad contra bacterias Gram positivas, Gram negativas y levaduras9.
El presente trabajo de investigación, evaluó la actividad inhibitoria in vitro de extractos de C. sativa ricos en CBD frente al crecimiento de H. pylori aislado de una zona de alto riesgo de CG en Nariño. Teniendo en cuenta el desarrollo secuencial de la enfermedad se determinó la efectividad del extracto frente a H. pylori aislado de pacientes con dos tipos de lesiones gástricas: gastritis no atrófica y gastritis atrófica con metaplasia intestinal (lesión precursora de cáncer gástrico).
Metodología
Obtención de extractos de Cannabis sativa. L ricos en cannabidiol
La materia prima usada para el desarrollo de este trabajo estuvo constituida por material vegetal seco y molido de flores de C. sativa no psicoactivo que fue adquirido de la empresa Pharma Indigena Misak Manasr SAS ubicada en la ciudad de Popayán - Cauca.
Proceso de extracción con CO 2 supercrítico
El proceso de obtención del extracto de C. sativa se realizó por duplicado en un equipo de extracción con fluidos supercríticos Waters -Thar © (SFE - 500, USA), teniendo en cuenta las condiciones de extracción para obtención de cannabinoides descritas por Perrotin (2011)10 200 bar. 70°C de temperatura, 100 g de materia prima y 30 g/ min de flujo de CO2 por 150 min.
Análisis de concentración de cannabinoides de los extractos de C. sativa mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
El extracto obtenido fue analizado en un equipo de cromatografía líquida de alta resolución con detector de matriz de fotodiodos HPLC - PDA Breeze (Waters 1525, EE UU), para identificar y cuantificar la presencia de cannabidiol (CBD) y Δ9 -tetrahidrocannabinol (THC). Para el análisis se usó una columna analítica C18 (250 mm x 4,6 mm x 5,0 μm); fase móvil acetonitrilo: agua; flujo 1,0 mL/min, PDA a 220 y 240 nm; temperatura del horno 30 °C; volumen de inyección 20 μL.
La cuantificación de los cannabinoides se realizó mediante una relación de áreas cromatograficas teniendo en cuenta el tipo de detector empleado en este estudio (detector fotoarreglo de diodos). Utilizando un promedio de áreas cromatograficas con una desviación relativa estándar menor al 2%. El coeficiente de correlación de la calibración del CBD = 0,999, CBN = 0,998 y THC=0,998.
Activación y aislamiento primario de Helicobacter pylori
Se incluyeron cinco biopsias donadas por el grupo de investigación en Salud Pública de la Universidad de Nariño, que fueron obtenidas de pacientes provenientes del Departamento de Nariño con diagnostico histopatológico de gastritis no atrófica y gastritis atrófica con metaplasia (Tabla 1).
Tabla 1 Biopsias gástricas seleccionadas para aislamiento primario de Helicobacter pylori y su diagnóstico histopatológico.
| Código | Diagnóstico histopatológico |
|---|---|
| CR046 | Gastritis no atrófica activa |
| CR0I2 | Gastritis no atrófica activa |
| CR070 | Gastritis no atrófica activa |
| CR044 | Gastritis atrófica con metaplasia |
| CR069 | Gastritis atrófica con metaplasia |
Teniendo en cuenta los protocolos de descongelación y cadena de frío, las biopsias gástricas congeladas a -70 °C se maceraron en solución salina al 0,89 % en un tubo estéril Eppendorff con un macerador eléctrico y un microbolillo desechable estéril (Peller Pestle-Mott Kontes). El macerado de la biopsia se sembró por triplicado en agar Columbia con 10% de sangre de cordero y suplemento Dent (Oxoid, H. pylori Selective Suplement SR0I47E: vancomicina, trimetoprim, cefsulodin y anfotericina) por agotamiento con un asa calibrada estéril de 10 JL. Los aislamientos se incubaron en atmósfera microaerofílica: a 37 °C, 10 % de CO2 y 90 % de humedad, por 10 días11. El macerado restante se preservó en una solución de tioglicolato (Merck®) con glicerol (Promega®) al 20% y se llevó al freezer a -80 °C.
Las colonias pequeñas, convexas traslúcidas de I mm de diámetro como gotas de rocío se identificaron mediante las pruebas bioquímicas de catalasa, oxidasa, ureasa y mediante la tinción de Gram11.
Con el fin de conservar los aislados de H. pylori obtenidos, se tomaron colonias con asa de argolla de las cajas Petri con agar sangre sin suplemento y se transfirieron a un tubo con caldo de tioglicolato (BBL®) más glicerol (Promega®) al 20%, se homogenizaron y se almacenaron a -80°C en un freezer REVCO (Thermo Scientific).
Identificación molecular de H. pylori
Las colonias de H. pylori preservadas a -80°C se sometieron a un proceso de descongelación según los protocolos de cadena de frío12, se extrajo ácido desoxirribonucleico (ADN) siguiendo el protocolo del Kit de extracción de ADN genómico "Bacterial DNA Preparation Kit (Jena Bioscience)". La calidad y la pureza del ADN se verificaron por espectrofotometría (NanoDrop ND 2000-Thermo cientific™).
El gen esencial ureA se amplificó por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando los iniciadores HPUI (5'-GCCAATGGTAAATTAGTT-3') y HPU2 (5'-CTCCTTAATTGTTTTTAC-3 )13, bajo las siguientes condiciones: Desnaturalización inicial a 95°C por 2 min, seguido por 45 ciclos de desnaturalización a 95°C por I min. Alineamiento a 50 °C por I min y a 72°C por I min junto al ciclo de extensión de la cadena a 72°C por 5 min, para asegurar una completa extensión de los productos de la PCR. Los resultados fueron evidenciados al realizar electroforesis en gel de agarosa al I,5% con una corrida preliminar de 20 min a 30 V y una corrida final de I h y 40 min a 60 V. El gel se observó bajo luz ultravioleta (UV) en un transiluminador UV (LabNet, GENTECH) y se tomaron evidencias fotográficas que fueron almacenadas para su verificación y análisis.
Ensayos de inhibición in vitro del extracto de C. sativa sobre H. pylori
Teniendo en cuenta el método de dilución en agar14, se preparó una solución stock del extracto de C. sativa rico en CBD a una concentración de I000 μg/mL para lo cual se usó Tween 20 al 2% como agente emulsionante. Con ello, se preparó agar Mueller Hinton suplementado con sangre de cordero al I0% e isovitalex al I% al cual se le adicionaron diluciones crecientes del extracto de C. sativa en un rango entre 27 - 60 μg/mL. Estos cultivos fueron sembrados por triplicado con un inóculo de I0 JL de colonias de H. pylori con menos de 72 horas e inmediatamente luego de su inoculación se ubicaron en condiciones microaerofílicas por 6 días, realizando revisiones constantes para la determinación de la concentración mínima inhibitoria. Para cada aislamiento se tuvieron en cuenta controles negativos (medio de cultivo sin extracto inoculado por cada aislado de interés), control de agente emulsionante (medio de cultivo con tween 20 inoculado por cada aislado de interés) y control positivo (medio de cultivo con diluciones crecientes de CBD comercial en un rango entre 27 - 60 μg/mL inoculado por cada aislado de interés).
Se realizó el conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC) de H. pylori con el software ImageJ y registró la concentración mínima inhibitoria (CMI) como el valor de la menor concentración del extracto que inhibe el desarrollo bacteriano en comparación a los controles.
Análisis estadístico
Los datos obtenidos de UFC se registraron y sometieron a pruebas estadísticas en el software Jamovi (versión 0.8.0.5). Los resultados de los ensayos de inhibición de H. pylori ante las distintas concentraciones del extracto de C. sativa L. fueron analizados mediante las pruebas de normalidad y homogeneidad: Shapiro Wilk y Levene. Al determinar que no se cumplieron los anteriores supuestos, se utilizó la prueba U-Mann Whitney para la comparación entre las UFC obtenidas del crecimiento de H. pylori aislado de pacientes según el tipo de gastritis, la prueba de Kruskal-Wallis para el análisis de las UFC obtenidas entre cada aislado y el test de Dunn como análisis Post Hoc. El nivel de significancia establecido fue α= 0,5%
Resultados
Obtención y caracterización del extracto de Cannabis sativa. L rico en cannabidiol
Al realizar el proceso de obtención de extracto de C. sativa, se obtuvo un rendimiento del 17,85%. Dicho extracto se caracterizó por contener una proporción CBD de 20,I9% y THC de 1,07% (tabla 2).
Aunque en nuestro análisis cromatográfico, nos enfocamos en la identificación y cuantificación de los tres cannabinoides principales: CBD, THC y CBN. No se detectó la presencia de CBN en la muestra.
Tabla 2 Resultados obtenidos del proceso de extracción y cuantificación de cannabinoides mediante HPLC
| Extracción | Rendimiento de extracción % (p/p) | CBD (mg/g) | THC (mg/g) | CBN (mg/g) | Total CBD % (p/p) | Total THC % (p/p) |
| 1 | 16,98 | 204,00 | 10,17 | - | 20,40 | 1,02 |
| 2 | 18,74 | 199,88 | 11,31 | - | 19,98 | 1,13 |
| Promedio | 17,86 | 201,94 | 10,74 | - | 20,19 | 1,07 |
CBD: cannabidiol; THC: tetrahidrocannabinol; CBN: cannabinol.
Activación, identificación y preservación de los aislamientos de H. pylori
A partir de las cinco biopsias seleccionadas se obtuvieron cultivos primarios de crecimiento abundante y puros de H. pylori. De los mismos, se realizaron repiques por triplicado y se generaron preservados por triplicado de H. pylori en caldo tioglicolato + glicerol al 20% que fueron almacenados a -80 °C en frezzer REVCO (Thermo Scientific®).
El crecimiento de los aislados fue compatible con las características macroscópicas de H. pylori, colonias pequeñas, translúcidas, en forma de gotas de rocío con crecimiento abundante sobre el medio de cultivo y bacilos Gram negativos pleomórficos, curvos, abundantes, compatibles con H. pylori. También, se obtuvieron resultados positivos en las pruebas bioquímicas oxidasa, catalasa, ureasa y en la amplificación del gen ureA (figura 1).
Gel de agarosa al 1,5 %, teñido con SYBR Green y visualizado en transiluminador UV Marcador molecular de referencia de 100 pares de bases (pb) (Hyper LadderTM 100 pb Bioline); CR012, CR046, CR070, CR044 y CR069: código de identificación asignado a cada aislamiento de H. pylori; blanco agua grado molecular MoBioTM (MiliQ); región amplificada Gen ureA de H. pylori (167 pb).
Ensayos de inhibición in vitro del extracto de C. sativa sobre H. pylori
Tras realizar el conteo de las UFC de H. pylori, se observó que el extracto de C. sativa rico en CBD presentó un efecto inhibitorio sobre el microorganismo en comparación con el crecimiento obtenido en los controles. Los ensayos se realizaron por triplicado, incluyendo los controles. La CMI fue calculada en la caja Petri que contenía la dilución del extracto de C. sativa en la cual no se observó crecimiento del microorganismo, esta se ubicó en un rango de 35-55 μg/mL de extracto de C. sativa (tabla 3).
Tabla 3 Concentración Mínima Inhibitoria del extracto de Cannabis sativa rico en CBD frente al crecimiento in vitro de cinco aislados de Helicobacter pylori relacionados según el diagnóstico histopatológico del huésped.
| Aislamiento | Diagnóstico histopatológico de huésped | CMI |
|---|---|---|
| CR046 | Gastritis no atrófica activa | 35 μg/mL |
| CR0I2 | Gastritis no atrófica activa | 37 μg/mL |
| CR070 | Gastritis no atrófica activa | 35 μg/mL |
| CR044 | Gastritis atrófica con metaplasia | 55 μg/mL |
| CR069 | Gastritis atrófica con metaplasia | 37 μg/mL |
CMI: Concentración Mínima Inhibitoria
Análisis estadístico
Las pruebas de Shapiro Wilk y Levene presentaron un p valor <0,05, por lo cual se realizaron las pruebas no paramétricas, U-Mann Whitney y Kruskal-Wallis.
El resultado del estadístico U-Mann Whitney (p<0,00I) demostró que existen diferencias estadísticamente significativas entre los dos tipos de gastritis al comparar las medianas del conteo de UFC de cada aislamiento de H. pylori bajo el efecto del extracto de C. sativa. Entre los cinco aislamientos de H. pylori (Kruskal-Wallis p<0,0I); la prueba post-hoc de Dunn mostró diferencias significativas (p<0,05) en la sensibilidad de H. pylori CR044 al extracto de C. sativa frente a los aislados obtenidos de pacientes con GNA y también se revelaron este tipo de diferencias entre el aislamiento CR069 y los aislamientos CR0I2 y CR046 (figura 2).
UFC: Unidades Formadoras de Colonias; GACM: gastritis atrófica con metaplasia intestinal; GNA: gastritis no atrófica; CR069, CR044, CR070, CR0I2 y CR046: código de identificación asignado a cada aislamiento de H. pylori
Figura 2 Gráfico de cajas y bigotes: número de UFC según código de aislamiento de Helicobacter pylori.
En la figura 2. Se observa que las medias del número de UFC del aislado CR044 de un paciente con gastritis atrófica con metaplasia intestinal (GACM) es significativamente mayor a las medias de UFC de H. pylori aislado de pacientes con gastritis no atrófica (GNA) y del aislado CR069 del paciente con GACM. Por tanto, en este estudio los aislados de H. pylori provenientes de pacientes diagnosticados con GNA fueron más sensibles al efecto inhibitorio del extracto de C. sativa rico en CBD en comparación con los aislados de pacientes con GACM.
Discusión
Para el desarrollo del presente trabajo de investigación se utilizó material vegetal seco y molido de flores de C. sativa no psicoactivo. Para favorecer el enriquecimiento del extracto en cannabinoides y evitar la presencia de otras moléculas sin interés farmacológico como ceras y clorofilas, el proceso de extracción se realizó a 200 bar y 70 °C logrando obtener en promedio un rendimiento del 17,86 % p/p. Estas condiciones de presión y temperatura son similares a las estudiadas por Perrotin (2011)10, quien reporta que al trabajar en un rango de temperaturas de 40 a 60 °C, y a un rango de presión de 130 a 250 bar, se favorece la solubilidad de los cannabinoides en el CO2 - SC, obteniendo mayores concentraciones de los mismos.
Otros autores encontraron un rendimiento de 3.9 % p/p al operar a 90 bar, 50 °C y sin cosolvente, utilizando hojas frescas de C. sativa L15. Rovetto & Aieta, (2017)16 reportan un rendimiento de I8,5%, superior al obtenido en el presente estudio (17,86 %), usando de hojas y brotes de la planta a 340 bar y 55 °C. Estas diferencias se pueden explicar al considerar la parte de la planta utilizada en el proceso, diferentes condiciones de extracción y el contacto de la muestra con el disolvente supercrítico17. Lo anterior dado que estudios previos han demostrado que la síntesis y acumulación de cannabinoides ocurre en los tricomas glandulares de la planta de C. sativa y su concentración máxima se observa en las inflorescencias femeninas no fertilizadas18.
El análisis del extracto de cannabis mediante HPLC determinó la presencia de CBD y THC en una concentración promedio de 20I,94 mg/g y I0,74 mg/g respectivamente. Estos resultados son superiores a los obtenidos por Drini et al., (2021)19, quienes reportaron que los extractos de partes aéreas de C. sativa obtenidos con fluidos supercríticos a 100 bar y 40°C, encontrando una concentración de 63,II mg/g de CBD y 6,58 mg/g de THC. Moreno et al., (2020)20 describen que, tras un proceso de descarboxilación a I50 °C durante 60 min, realizado a inflorescencias de C. sativa, se obtuvieron extractos con 95 mg/g de CBD y I,20 mg/g de THC como producto de una extracción a I00 bar y 40 °C. También Grijó et al., (20I8)21 describen porcentajes de 38,66 % de CBD, 38,72% de THC y 0,39 % de CBN, obtenidos a 60°C y I84 bar, a partir de la flor hibrida de cannabis Durga Mata II CBD. Según Burgel et al., (2020)22 el contenido de cannabinoides difiere en términos de cantidad y calidad dependiendo del genotipo de la planta, las condiciones climáticas del cultivo, la etapa de crecimiento y la fracción de la planta cosechada.
El resultado de la CMI encontrada está dentro del rango descrito por Jokic et al., (2022)23, quienes evaluaron I3 extractos de C. sativa ricos en CBD sobre E. coli, P aeruginosa, B. subtilis y S. aureus, cuyos valores de CMI estuvieron entre 10,42 - 66,03 μg/mL. Nariman et al., (2009)24 probaron el efecto del extracto metánolico de C. sativa y otras plantas tradicionales de Irán sobre el crecimiento de I0 aislamientos de H. pylori mediante el método de difusión en disco y como resultado, se encontró que 6 aislamientos fueron sensibles (>15 mm) a una concentración de 2,5 mg.
En comparación a la actividad anti-H. pylori de otros extractos de origen natural, los resultados de CMI obtenidos con C. sativa (35-55 μg /mL) son mejores a los obtenidos con el extracto etanólico de Punica granatum donde se encontró una CMI de 156 μg/mL sobre H. pylori aislado de I2 biopsias gástricas y una cepa de referencia NCTC 1191 625. El extracto metanólico de Allium ascalonicum exhibió una CMI entre I00 y 200 mg/mL sobre 42 aislados clínicos de H. pylori y la cepa ATCC 43504 de la bacteria26. Extractos de Corydalis cheilanthifolia y Chelidonium majus revelaron tener actividad antibacterial sobre H. pylori ATCC 8064 a una CMI de 64 μg/mL y 128 μg/mL respectivamente27. La acción de biomoléculas como los polifenoles extraídos de Persea americana var. Hass revelaron una CMI sobre H. pylori de 1500 μg/mL valor superior a la CMI descrita en nuestro estudio28.
La CMI obtenida en la presente investigación para el extracto de C. sativa L. rico en CBD (35-55 μg/mL) es relativamente baja al contrastarse con otros extractos naturales, aunque no se compara a los antibióticos comerciales utilizados para el tratamiento de la infección por H. pylori, como claritromicina, amoxicilina y metronidazol. Por ejemplo, se ha informado que la CMI de la claritromicina es de 0,06 - 0,5 μg/mL, mientras que la amoxicilina y el metronidazol tienen una CMI de 0,25 - 4 μg/mL y 0,125 - 1 μg/mL, respectivamente29. No obstante, el estudio de Wassmann et al., (2020)30 informa que al utilizar el CBD como adyuvante junto a la bacitracina contra Staphylococcus sp, L. monocytogenes y E. faecalis se potencia el efecto del antibiótico reduciendo su CMI al menos 64 veces.
También se ha documentado que el THC posee actividad antimicrobiana contra bacterias Gram-positivas como Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes, y su combinación con otros cannabinoides podría potenciar la actividad del extracto en su conjunto31. Este fenómeno, conocido como el 'efecto séquito', sugiere que la interacción entre los cannabinoides puede influir en múltiples dianas celulares, optimizando su actividad antimicrobiana. Además, la estructura química del THC, en particular la presencia de grupos hidroxilos fenólicos, ha sido relacionada con la modulación de la hidrofobicidad y estabilidad de los compuestos, lo que podría influir en su efectividad contra microorganismos31. Futuras investigaciones permitirán esclarecer con mayor precisión el papel específico del THC en la actividad antibacteriana del extracto de C. sativa.
Basados en pruebas estadísticas es posible inferir que aislamientos de H. pylori obtenidos de pacientes con GNA son más sensibles a la bioactividad de los extractos de C. sativa ricos en CBD que aquellos aislados de pacientes con GACM (U-Mann Whitney p< 0,05). Aunque se ha documentado que la susceptibilidad de H. pylori puede variar en pacientes con lesiones gástricas avanzadas, como úlceras pépticas y lesiones precursoras de cáncer gástrico9, durante el análisis realizado se observó que los aislados obtenidos de pacientes con gastritis no atrófica (GNA) fueron más sensibles a los extractos de C. sativa que aquellos de pacientes con gastritis atrófica y metaplasia (GACM), característica que puede atribuirse a su diagnóstico histopatológico de GACM y al consumo reciente (hace menos de un mes) de tratamiento farmacológico para eliminar a H. pylori de su estómago (información extraída de encuestas realizadas a participantes del estudio), a diferencia de los otros tres participantes quienes aseguraron no haber consumido ningún tratamiento para eliminar la bacteria de su estómago al menos un mes antes de la toma de la muestra. Estas diferencias destacan la importancia de considerar el contexto clínico al evaluar la efectividad de los tratamientos, lo cual resalta la relevancia de este estudio como punto de partida para investigaciones futuras sobre el tratamiento de la infección por H. pylori, a pesar del número limitado de ensayos realizados.
También se describieron diferencias entre el aislado con código CR069 que fue extraído de un paciente con GACM en contraste a los aislados CR0I2 y CR046 de pacientes con GNA. Dicha situación puede asociarse a lo descrito por Le et al., (2022)32, quienes encontraron un aumento significativo en la frecuencia de resistencia a los antibióticos claritromicina (CLA) y amoxicilina (AMX) expresada por aislados de H. pylori obtenidos de pacientes pediátricos diagnosticados con lesiones precursoras de cáncer gástrico (úlceras pépticas) (CLA= 87,7 %, AMX=86,3 %) en comparación a aquellos con lesiones inflamatorias (CLA= 77,4 %, AMX=65,2 %), lo cual sugiere que la infección por H. pylori puede ser más difícil de tratar en pacientes con lesiones avanzadas debido al mayor el riesgo de resistencia a los antibióticos por el uso de tratamientos previos para erradicar la bacteria.
Los autores del presente manuscrito manifiestan que las limitaciones de la investigación fueron en primera instancia incluir un grupo de pacientes con cáncer gástrico y su siguiente evaluación en las líneas celulares aisladas según tipo de lesión gástrica en pacientes de Nariño con los extractos de C. sativa, incluyendo un estudio de sus efectos terapéuticos más allá de los alcances como productos preventivos de cáncer gástrico en Nariño.
