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Introducción
El estrés oxidativo es el mecanismo subyacente que se presenta cuando hay desequilibrio en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), y este proceso conduce a la disfunción celular y finalmente a la muerte1. Las ROS corresponden principalmente al radical hidroxilo (OH-) y al peróxido de hidrógeno (H2O2)2. Algunas de las principales especies reactivas de oxígeno, como el radical superóxido (O2 -) y el peróxido de hidrógeno, son subproductos del metabolismo y se forman a partir de fuentes endógenas y exógenas2. La sobreproducción de estas moléculas conlleva la alteración de la homeostasis y daño oxidativo al ADN, los lípidos, los hidratos de carbono y las proteínas2; por tanto, la acumulación de ROS desempeña un papel importante en la mediación de muerte celular programada por apoptosis y compromete la viabilidad celular1. En este sentido, el estrés oxidativo generado por ROS se ha estudiado en varios procesos patológicos, como enfermedades autoinmunes, cáncer, envejecimiento y diabetes mellitus3, debido a que se considera que es un modulador clave en el desarrollo inicial de las enfermedades autoinmunes4),(5.
Hoy en día, los modelos basados en células han demostrado ser una herramienta útil para alcanzar resultados sobre mecanismos subyacentes a las enfermedades autoinmunes6, al ser ensayos más económicos y accesibles que modelos in vivo4; por ejemplo, para la evaluación del estrés oxidativo en el cultivo celular se puede emplear peróxido de hidrógeno, que estimula la liberación excesiva de especies reactivas de oxígeno y apoptosis6. Así, este modelo simula el daño oxidativo que ocurre en las patologías autoinmunes4, lo que permite estudiar las moléculas con capacidad antioxidante y antiapoptótica7. Los extractos vegetales son una alternativa para el tratamiento del estrés oxidativo celular en patologías autoinmunes, gracias a la presencia de compuestos que presentan propiedades antioxidantes, citoprotectoras y antiinflamatorias8. El extracto etanólico de propóleo, en particular, ha demostrado actividad antioxidante, por la alta concentración de polifenoles9. A partir de lo anterior, este trabajo busca determinar el efecto protector del extracto etanólico de propóleo frente al daño oxidativo inducido con peróxido de hidrógeno (H2O2) en células mononucleares de sangre periférica cultivadas in vitro, mediante el conteo celular con azul tripán.
Materiales y métodos
Preparación del extracto etanólico de propóleo
Las muestras de propóleo provienen de Restrepo, Valle del Cauca. Se recolectaron en enero de 2022. El propóleo fue extraído con etanol al 95%. El extracto etanólico de propóleo (EPP) estuvo en baño maría por 24h.
Aislamiento de linfocitos T de sangre periférica
Los linfocitos humanos de sangre periférica fueron colectados cumpliendo los siguientes criterios de inclusión: donante voluntaria, mujer sana, no gestantes, de 20-25 años, sin antecedentes de enfermedades autoinmunes ni consumo de sustancias psicoactivas o antibióticos reciente. A partir de la sangre extraída por venopunción, se realizó el aislamiento de linfocitos humanos, utilizando un gradiente de gravedad con Ficoll-Paque (Cytiva 17-1440-02). El pellet se diluyó en medio RPMI 1640 (R-8758 Sigma-Aldrich), que contiene un 10% de suero fetal bovino (16000036 Gibco), un 1% de gentamicina y un 1% de L-glutamina. Se mezclaron 50 [xl de la suspensión celular (pellet con medio completo) con 50 [xl de azul tripán al 0,1%. Se realizó el conteo celular en la cámara de Neubauer. Se sembraron 5 x 106 células por mililitro, en cada de 2 ml (GIBCO LC1010).
Análisis estadístico
Los resultados se evaluaron mediante análisis de varianza (ANOVA unifactorial), a fin de determinar la citotoxicidad en las concentraciones del extracto etanólico de propóleo, y prueba de varianza (multifactorial) para calcular si existe relación entre las concentraciones y el tiempo de tratamiento. Los valores de p < 0,05 se consideran significativamente diferentes. Con posterioridad, se aplicó la prueba de comparación múltiple de Tukey (p < 0,05).
Resultados
Citotoxicidad de las concentraciones del extracto etanólico de propóleo
Para determinar la citotoxicidad de las concentraciones del extracto etanólico de propóleo (EEP) en los linfocitos, las células fueron tratadas con 0,35, 0,175, 0,09, 0,045, 0,0225, 0,010 y 0,005 mg/ml de propóleo, utilizando como control positivo agua y como control negativo H2O2. Una vez determinadas las dosis no citotóxicas, se seleccionaron las dosis 0,045 y 0,0225 mg/ml de tripán para evaluar la capacidad protectora del EEP frente al estrés oxidativo causado por el peróxido de hidrógeno (H2O2) en los linfocitos in vitro.
Capacidad protectora del EEP contra el estrés oxidativo causado por peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ) en los linfocitos in vitro
Para cada cultivo de 5 x 106 células por mililitro (2 de ml volumen final) se evaluaron dos tratamientos: en el primero, las células fueron tratadas con 0,045 mg/ml del extracto y 0,0225 mg/ml etanólico de propóleo, tras lo cual fueron incubadas durante 30 min. Transcurrido este tiempo se adicionaron 15 [xl de peróxido de hidrógeno a 1 [xM, usando como control positivo agua y como control negativo H2O2. En el segundo tratamiento, las células se trataron con 0,045 mg/ml del extracto y 0,0225 mg/ml etanólico de propóleo, y se incubaron durante 60 min; igualmente, transcurrido este tiempo se adicionaron 15 [xl de peróxido de hidrógeno a 1 [xM.
Citotoxicidad de las concentraciones del extracto etanólico de propóleo
Se evalúa la citotoxicidad de siete concentraciones de EEP (0,35, 0,175, 0,09, 0,045, 0,0225, 0,010 y 0,005 mg/ml) mediante conteo celular con el azul de tripán. Los resultados para las siete concentraciones con el análisis de varianza indicaron que no se presentó ningún efecto citotóxico entre las concentraciones evaluadas, como se muestra en la Figura 1. Se seleccionaron las concentraciones de 0,045 y 0,0225 mg/ml, las cuales presentaban un mayor número de células.
Las concentraciones de 0,045 y 0,0225 mg/ml en los linfocitos in vitro se evaluaron en dos tiempos: a 60 min y a 90 min. Los resultados de la concentración de 0,045 mg/ml del EEP indicaron que a los 60 min no hubo diferencia en el número de células vivas entre el tratamiento y los controles negativo (H2O) y positivo (H2O2). Los resultados del análisis estadístico, así como los datos descriptivos, evidencian que el número de células es significativamente mayor en los cultivos tratados con el extracto etanólico de propóleo a los 90 min que en los cultivos no tratados (Figura 2).
Con respecto al tratamiento con 0,0225 mg/ml en los linfocitos in vitro, los resultados muestran que para los dos tiempos hubo diferencia significativa entre el tratamiento y el control positivo (H2O2). En la Figura 3 se observan los resultados del análisis post hoc; se determinó que el número de células es significativamente mayor en los cultivos tratados con el extracto de propóleo a 0,025 mg/ml a los 90 min y a los 60 min.
Discusión
En este estudio se determinó el efecto protector del extracto etanólico de propóleo (EEP) en los linfocitos de sangre periférica inducidos a estrés oxidativo con peróxido de hidrógeno (H2O2). Es un estudio novedoso, debido a que la actividad del propóleo es específica para cada muestra; depende directamente de la ubicación geográfica, de las condiciones climáticas y de la especie vegetal10. Este es el primer estudio sobre la capacidad protectora del propóleo del municipio de Restrepo, Valle del Cauca. Los resultados de análisis de varianza indicaron que ninguna de las siete concentraciones evaluadas del EEP es citotóxica para los linfocitos y que las concentraciones de 0,045 y 0,0225 mg/ml presentan un efecto protector contra el daño oxidativo inducido por H2O2. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Wozniak11, en los cuales los extractos de propóleo a concentración de 0,05 mg/ml protegían significativamente a las células del daño oxidativo.
A su vez, El-Guendouz et al.12 evaluaron los componentes (fenoles y flavonoides) y las actividades antioxidantes de 24 muestras de propóleo de diferentes regiones de Marruecos, y como resultado demostraron una fuerte correlación entre los componentes y la actividad antioxidante del extracto etanólico de propóleo para eliminar radicales libres.
Un estudio realizado por Nascimento et al.13 evaluó la actividad antioxidante del propóleo Rojo Alagoas, y evidenció que la actividad antioxidante fue del 80% con respecto al secuestro de peróxido de hidrógeno. Mohammedi14, por su parte, determinó que la capacidad del propóleo para inhibir la producción de peróxido de hidrógeno es el resultado de los altos niveles de fenoles presentes en los propóleos. En nuestro estudio encontramos que los linfocitos humanos tratados durante 60 minutos con las concentraciones de 0,0225 mg/ml y 0,045 mg/ml del extracto etanólico de propóleo original de Restrepo, Valle del Cauca, muestran una capacidad para proteger a los linfocitos in vitro del estrés oxidativo inducido por peróxido de hidrógeno (H2O2), evidenciando un mayor número de células frente a las células que no fueron tratadas (Figura 4). A partir de lo anterior, podemos sugerir que el extracto etanólico de propóleo es una alternativa potencial en la búsqueda de tratamientos terapéuticos contra enfermedades autoinmunes, por su capacidad de aumentar la supervivencia en células sometidas a estrés oxidativo.
