INTRODUCCIÓN

Los eventos isquémicos en el miocardio y los accidentes cerebrovasculares suelen ser fenómenos agudos, que se deben, sobre todo, a obstrucciones que impiden que la sangre fluya hacia el corazón o el cerebro (^{Oberreuter et al. 2014}); una de las causas más frecuentes es la formación de coágulos de sangre (trombos) en las venas, que se pueden desprender y alojar en los vasos del corazón y del cerebro (^{OMS, 2015}).

Actualmente, en el mundo, las enfermedades cardiovasculares representan la principal causa de mortalidad. Para 2008, causaron el 63 % de las muertes y se estima un incremento del 15 % (44 millones), entre 2010 y 2020, alcanzando el 73 % de la mortalidad y el 60 % de la carga de la morbilidad (^{ONS, 2013}). En Colombia, entre 2005 y 2017, la principal causa de muerte en la población general fueron las enfermedades del sistema circulatorio, las cuales, presentaron una tendencia decreciente en el tiempo, pasando de 166,43 a 150,30 muertes por cada 100.000 habitantes (^{Minsalud, 2018}).

A nivel clínico, el tratamiento de los trombos se trata con anticoagulantes sintéticos (^{Jerjes-Sánchez et al. 2017}); sin embargo, presentan efectos adversos, como trombocitopenia, urticaria, asma, anafilaxis, entre otras (^{Warkentin et al. 1995}), lo que resulta en una problemática más relacionada con las enfermedades cardiovasculares (^{Rocha et al. 2004}; ^{Trejo I., 2004}). En la búsqueda de nuevos fármacos anticoagulantes existe un mayor interés por el uso de plantas medicinales que presenten estas actividades biológicas y disminuyan la presencia de efectos secundarios, teniendo en cuenta que, en la actualidad, se presenta una tendencia progresiva por el uso de los sistemas tradicionales de medicina (^{Gallegos-Zurita, 2016}).

Croton malambo y Acalypha hispida son dos especies de la familia Euphorbiaceae que se estudian por su actividad biológica, como es el caso de su uso como anticoagulante (^{Morón Rodríguez et al. 2007}; ^{Barragán Zarate et al. 2016}). El género Croton, se caracteriza porque sus especies poseen una gran cantidad de usos, a nivel etnobotánica; también, se reportan varios usos interesantes en la medicina tradicional y se destaca la presencia de metabolitos secundarios, que se caracterizan porque poseen un amplio rango de actividad biológica (^{Coy Barrera et al. 2016}; ^{Matara et al. 2021}). En el caso de A. hispida, se caracteriza por sus constituyentes con potencial para el tratamiento de muchas patologías, debido a su actividad antiinflamatoria y antioxidante (^{Siraj et al. 2016}). Varias investigaciones reportan las diferentes actividades biológicas que presentan estas dos especies de Euphorbiaceae, dado que la mayoría de sus aceites esenciales presentan propiedades curativas (^{Jaramillo C. et al. 2010}; ^{Wardoyo et al. 2021}).

Con base en lo anterior, se determinó el perfil fitoquímico y la actividad anticoagulante in vitro, a través de las técnicas Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada (TTPA) y Tiempo de Protrombina (TP), de los extractos etanólicos de las hojas de C. malambo y A. hispida, sobre plasma humano.

MATERIALES Y MÉTODOS

Este trabajo, se realizó en las instalaciones del Laboratorio de Investigaciones-Productos Naturales adscrito a la Facultad de Química y Farmacia, de la Universidad del Atlántico.

Recolección del material vegetal. La colecta de las hojas de C. malambo y A. hispida, se realizó en el corregimiento de Paluato, Galapa-Atlántico, con coordenada geográficas 10°48’N, 74°54’O y Salgar, Puerto Colombia-Atlántico, con coordenada geográficas 11°0’N y 74°47’O, a 18 m s.n.m. y ambas zonas presentan condiciones similares de temperatura ~ 30 °C y humedad relativa ~75 %, aprox., a las 7 a.m. Las plantas crecieron en condiciones de campo abierto y las muestras se tomaron de plantas sin evidencia de afectación por fitopatógenos o ataque de insectos. Las especies están situadas en la costa del Mar Caribe, zona con suelo franco arcilloso, sustrato que proporciona condiciones adecuadas para la absorción de los nutrientes. Para la identificación, se tomaron dos muestras de cada especie y se enviaron al Herbario Nacional Colombiano del Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá.

Obtención de los extractos etanólicos. Se realizó un proceso de limpieza y de secado del material vegetal a temperatura ambiente. Posteriormente, se realizó el proceso de molienda, para obtener un tamaño de partícula moderadamente fino y llevado al método de extracción por maceración (^{Terán Portelles et al. 2019}), con etanol al 96 %, durante 8 días, con agitación esporádica. Finalmente, se filtró y se concentró con un rotaevaporador R-10, a 38 °C, hasta obtener un extracto seco (^{Camacho-Romero et al. 2019}).

Tamizaje fitoquímico preliminar. Los extractos fueron sometidos a un screening fitoquímico cualitativo, a través de ensayos de coloración y de precipitación (^{Martínez, 2008}), con el fin de confirmar los principales constituyentes químicos presente en los extractos etanólicos, de las hojas de C. malambo y A. hispida. Para el caso de alcaloides, esteroides y triterpenoides, se emplearon las pruebas descritas por ^{Gil-Frómeta et al. (2019)} y para taninos, saponinas, leucoantocianidinas, flavonoides, fenoles, antraquinonas y sesquiterpenlactonas, las pruebas mencionadas por ^{Beltrán Villanueva et al. (2013)} y ^{Soto Vásquez (2015)}.

Evaluación de la actividad anticoagulante in vitro. A partir de los extractos secos de C. malambo y A. hispida, se tomaron 5 g y se aforaron en un matraz de 25 mL, obteniéndose la concentración de 200 mg/mL; de igual modo, se realizaron diluciones de 10, 50 y 100 mg/mL. Posteriormente, se realizó la prueba de coagulación, utilizando las técnicas de tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) y el tiempo de protrombina (TP) y, como control negativo, se utilizó plasma sanguínea normal, es decir, el valor de referencia, en la cual, coagula la sangre en estado normal.

Análisis estadístico. El análisis estadístico, se realizó mediante el uso de las pruebas ANOVA y Tukey, para tamaños de muestras iguales, con un nivel del 95,0 % de confianza y p <0,05. Para establecer la correlación entre las variables, se consolidó la base de datos en Microsoft Excel y se realizó el plan de análisis con estadística descriptiva, para conocer la capacidad de formación del coágulo, de manera similar en las muestras, donde todas se realizaron por triplicado, a través del programa estadístico Statgraphics Centurion (XV).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Perfil fitoquímico. En la tabla 1, se observan los resultados cualitativos obtenidos en la marcha fitoquímica preliminar de los extractos etanólicos de las hojas de C. malambo y A. hispida, los cuales, mostraron resultados positivos para metabolitos secundarios, como alcaloides, flavonoides, esteroides y triterpenos, taninos, leucoantocianidinas, sesquiterpenlactonas y fenoles y negativo para los grupos químicos de saponinas y de antraquinonas.

Tabla 1 Marcha fitoquímica preliminar de las hojas de Croton malambo y Acalypha hispida. 

No hay presencia (-), se encuentra en poca cantidad (+), se encuentra en mediana cantidad (++), se encuentra en gran cantidad (+++).

Actividad anticoagulante. Los extractos de las especies C. malambo y A. hispida fueron probados a diferentes concentraciones, para evaluar su actividad anticoagulante y los resultados obtenidos, se presentan en la tabla 2; están expresados en segundos transcurridos hasta la formación del coágulo. Las pruebas empleadas para la evaluación de los tiempos de coagulación fueron: tiempo de tromboplastina parcialmente activa, la cual, su prolongación (tiempo que se demora en formar un coágulo sanguíneo) indica inhibición de la vía intrínseca y tiempo de protrombina, donde su prolongación indica inhibición de la vía extrínseca de la cascada de coagulación (^{Zamora-González, 2012}).

Tabla 2 Actividad anticoagulante In vitro mediante TTPa y TP de Croton malambo y Acalypha hispida. 

* Medias con letras dentro de cada variable para mirar grupos en subconjuntos homogéneos, según prueba de Tukey, para p ≤0,05 (n=3) ± DS Desviación estándar.

En la tabla 2, se puede observar que, a concentración de 200 mg/mL, el extracto de C. malambo registró un tiempo de coagulación promedio de 39,1 segundos, mientras que el extracto de A. hispida, a la misma concentración, presentó un tiempo de coagulación promedio de 41,8 segundos. Según lo anterior, a estas concentraciones, los extractos se catalogan como sustancias que demoran la formación del coágulo, puesto que sobrepasan los 10 segundos obtenidos con el control negativo; no obstante, en términos generales, las concentraciones de 50 y 10 mg/mL, para ambas especies, mostraron resultados dentro de los rangos normales de 25 a 35 segundos, en comparación con el control negativo, los cuales, contabilizan hasta 6 segundos por encima o por debajo del valor obtenido en el control negativo (^{Zamora-González, 2012}).

En ambas especies, se evidenció una actividad anticoagulante significativa para el TTPa, en comparación con el control negativo 29,7 segundos, registrando tiempos de coagulación más amplios a este, a excepción de C. malambo, a 10 mg/mL, que presentó el mismo valor. Además, se demostró proporcionalidad, corroborada al observar que, en la medida que las concentraciones aumentaron, los tiempos de coagulación se fueron prolongando; por otra parte, el efecto anticoagulante no se evidenció de acuerdo con los resultados obtenidos por la prueba del TP, donde la prueba ANOVA mostró que no había diferencia significativa entre el valor del TP control y las concentraciones de los extractos de C. malambo y A. hispida.

Estudios realizados con el género Croton, en el que se analizaron 14 especies, se determinaron la presencia de metabolitos secundarios, como alcaloides, taninos, fenoles simples, glucósidos cardiotónicos, triterpenos y flavonoides (^{Payo Hill et al. 2001}). En otro estudio realizado con otras especies, como C. mutisianus, C. polycarpus, C. phyllanthus, C. securinega y C. schiedeanus, se notó la ausencia de saponinas y se confirmó la presencia de alcaloides, flavonoides, taninos y terpenos (^{Payo Hill et al. 2001}). En otro estudio, en el que se incluyó a C. malambo,^{Jaramillo C. et al. (2010)} encontraron los metabolitos alcaloides, terpenos, taninos, fenoles, flavonoides, sesquiterpenlactonas y glucósidos cardiotónicos, metabolitos que concuerdan con los hallados en el presente estudio.

Para A. hispida, se reporta la presencia de alcaloides, flavonoides, taninos, glucósidos cardiotónicos y fenoles, y la ausencia de saponinas y de antraquinonas (^{Onocha et al. 2011}; ^{Osarumwense & Okunrobo, 2013}; ^{Manikanta et al. 2014}); dichos resultados concuerdan con los obtenidos en el estudio. Estos compuestos demuestran el potencial terapéutico que tienen estas plantas como antiinflamatorio (^{Siraj et al. 2016}), hipoglucémico (^{Alfarisi et al. 2020}) y antibacteriano (^{Noumedem et al. 2013}).

El modelo clásico de la coagulación, descrita por ^{Davie & Ratnoff (1964)}, muestra cómo ocurre el proceso enzimático en cascada (^{Gómez Baute et al. 2011}), que se divide por dos vías, la intrínseca y la extrínseca, siendo evaluadas por las pruebas de laboratorio tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) y tiempo de protrombina (TP), respectivamente. En la vía intrínseca participan los factores intrínsecos de la sangre (factores VIII, IX y XI) y la vía extrínseca, se caracteriza por requerir una sustancia activadora extrínseca, el factor tisular (^{Palomo et al. 2009}).

Al analizar los resultados obtenidos frente a la evidencia (Figura 1), se aprecia concordancia con los efectos anticoagulantes de otras plantas, como la Ricinus conmunis y Jatropha curcas, que también pertenecen a las euforbiáceas; cabe resaltar que ^{Gallardo-Vásquez et al. (2019)} utilizaron para su investigación el látex de J. curcas, lo que podría justificar la mayor prolongación del tiempo de coagulación, 56 segundos, a diferencia del promedio de 40 segundos, de las otras plantas. Además, según la literatura, la Warfarina prolonga el tiempo de coagulación por encima de los 60 segundos, a concentraciones muy bajas; esto quiere decir que, este agente químico de efecto comprobado, presenta mayor eficiencia que los extractos de las especies vegetales estudiadas (^{Ku & Bae, 2014}).

Figura 1 Comparación del tiempo de coagulación obtenido por TTPa reportado en la literatura (^{Osoniyi & Onajobi, 2003}; ^{Ku & Bae, 2014}) 

En los valores de INR (prueba de tiempo de protrombina) para cada prueba del tiempo de tromboplastina, se observó que los resultados de las dos especies se encuentran dentro de los referenciados para esta prueba 0,8-1,2. ^{Gallardo-Vásquez et al. (2019)} reportaron en su investigación con el látex de J. curcas resultados similares a los encontrados en este estudio, al obtener tiempos de coagulación más prolongados, mediante el test TTPa, pero el TP no presentó resultados significativos con referencia a los controles negativo. Por tanto, los extractos de C. malambo y A. hispida inhiben la coagulación en la vía intrínseca, por lo que se espera que actúe sobre alguno de los factores responsables de la conversión de la protombina en trombina (factores VII, IX, XI y XII de la cascada de coagulación); pero no actúan sobre la vía extrínseca. Los medicamentos, como la Heparina y Warfarina, también actúan sobre la vía intrínseca, inhibiendo algunos de estos factores (^{Trejo I., 2004}).

Se puede concluir que el extracto etanólico de las dos especies evaluadas en dosis de 200 mg/mL actuó como un anticoagulante, inhibiendo la coagulación en la vía intrínseca, vía por la que actúan los medicamentos anticoagulantes mayormente empleados, como la Heparina y Warfarina, alargando los tiempos de coagulación en las pruebas empleadas en condiciones in vitro.