INTRODUCCIÓN

La técnica del coprocultivo se utiliza para promover la maduración y eclosión de los huevos de nematodos, y la evolución de las larvas hasta el tercer estadio, la fase infestante (L3) ¹. Para que esta técnica sea posible necesita de una humedad, oxigenación y temperatura adecuada ². Además, es importante utilizar un sustrato que emule las condiciones del suelo, como lo es la madera, y que esta no sea tóxica para las larvas, tal es el caso del aserrín de laurel (Laurus nobilis) ³.

Los coprocultivos nos permiten identificar de mejor manera la identidad de los nematodos gastrointestinales que causan serias infecciones en los rumiantes ⁴. Esto representa un problema en el nivel mundial, en especial a los bovinos, debido a que la productividad del hospedador se ve afectada al causar reducciones en las tasas de crecimiento, fecundidad, así como un incremento en la mortalidad ⁵.

Las infecciones por nematodos son más comunes en animales de corta edad, debido a que su sistema inmunológico no está suficientemente desarrollado ⁶. En la literatura es común encontrar que los nematodos que se reportan principalmente en rumiantes son: Cooperia, Trichostrongylus, Haemonchus, Oesophagostomum, Ostertagia y Nematodirus⁷.

Por otra parte, no se han encontrado estudios donde se hable acerca de cómo afecta la variación del tiempo en la obtención de nematodos gastrointestinales a partir de un coprocultivo en heces de bovinos. Por ese motivo, este estudio evaluó el tiempo en la recuperación de larvas de nematodos a partir de un coprocultivo con aserrín de laurel.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se identificó un bovino con alta carga de huevos de nematodos, mediante el método de flotación con solución hipersaturada de sacarosa ⁸. Luego se preparó un coprocultivo, dentro de un recipiente de vidrio, con 10g de heces, 10g de aserrín de laurel (Laurus nobilis) y se adicionó aproximadamente 40 ml de agua destilada, se tapó con papel aluminio perforado (Figura 1A), y se dejó reposar por 8 días a 27°C. Posteriormente, se le adicionan cantidad suficiente de agua destilada a 37°C hasta que se forma un menisco con forma convexa, dos horas después se coloca una placa de Petri invertida sobre el recipiente y se le dio vuelta.

Figura 1 (A) Coprocultivos en envases de vidrio cubiertos con papel aluminio perforado. (B) Envase invertido sobre placa de Petri cubierta con agua destilada como medio de obtención de larvas. (C) Larvas en estadio L3 observadas a través del microscopio utilizando la cámara de McMaster. 

Se adicionó 16 mL de agua destilada a 37°C en el exterior de la placa, asegurándose cubrir los alrededores del recipiente (Figura 1B). Se mantuvo en reposo y el procedimiento se evaluó por triplicado en los tiempos de 0.5, 1, 2, 3 y 4 horas. Se realizó la recolecta del líquido externo a cada una de las muestras realizadas, se trasladaron a un tubo de ensayo que se mantuvo a 4 °C durante una hora. Pasado este tiempo se tomó 0.4mL del fondo del tubo y se mezcló con una gota de lugol para ser analizado utilizando un McMaster como instrumento para realizar el conteo de larvas (Figura 1C) ⁹. Además, para el ensayo propuesto se evaluó a las 2 horas la especificidad comparando el medio de cultivo con heces vs uno sin heces, y la precisión a través de 6 repeticiones. El análisis de los resultados se realizó con el software Minitab versión 19, y se aplicó un ANOVA con un análisis post hoc de Tukey ¹⁰.

RESULTADOS

El animal del que se tomaron las muestras para el estudio tenía una edad de 4 meses y un conteo de 10050 huevos por gramo de heces, donde se encontró únicamente la especie Trichostrongylus sp., que coincide con las larvas obtenidas luego de que se realizara el cultivo. En la tabla 1 se muestran los resultados de la especificidad del método de cultivo, a través del uso de aserrín de laurel (Laurus nobilis).

Al realizar diferentes repeticiones de la misma muestra se puede observar que la desviación estándar para la técnica resulta ser amplia, según se muestra en la tabla 2.

Se determinó la variación en el conteo de larvas de nematodos a distintos tiempos de recolecta posterior al cultivo, como se muestra en la figura 2. A las 3 horas se recuperó la mayor cantidad de larvas de Trichostrongylus sp. mostrando una diferencia significativa con respecto a los otros tiempos ensayados. El conteo de nematodos a las 3 horas mostró un porcentaje aparente de eclosión del 23%.

Figura 2 (A) Gráfica de intervalos de Q (cantidad de larvas) con respecto a T (Tiempo) a 95% IC para la media. 1 = 0.5 horas, 2 = 1 hora, 3 = 2 horas, 4 = 3 horas, 5 = 4 horas. (B) ICs simultáneos de 95% de Tukey. Diferencias de las medias para Q (cantidad de larvas). 

DISCUSIÓN

Se evaluó la especificidad de los datos del crecimiento de larvas al comparar un medio de cultivo con y sin muestra de heces, y se demuestra que hay una correcta especificidad de la técnica con el uso de aserrín de laurel, por lo que se puede decir que el aserrín de laurel (Laurus nobilis) se relaciona con falsos positivos, por lo tanto, no es un factor que afecte en los resultados obtenidos en los cultivos ^3,11.

Para evaluar la precisión del estudio se elaboraron 6 cultivos como se muestra en la tabla 2. Esta representa la reproducibilidad que tiene la investigación o en otras palabras la homogeneidad que tiene la muestra a la hora de realizar los coprocultivos. Para efectos de la precisión, el método resulta generar una desviación estándar bastante considerable entre los diferentes ensayos a un mismo tiempo de espera ¹². Pero esto podría ser consecuencia de pequeñas diferencias de minutos entre los tiempos de recolecta a las 2 horas, ya que como se podrá observar una diferencia en los tiempos de 60 minutos marca un importante cambio.

Luego de invertir el frasco con la placa Petri y añadirle agua alrededor de esta, el tiempo que se espera para recoger el sobrenadante es crucial ya que las larvas migran en un tiempo determinado. Por este motivo, se evaluó el ensayo por medio del método de análisis de exactitud donde se establecieron los tiempos indicados en la figura 2 ¹³. Haciendo uso del programa estadístico Minitab 19 y aplicando la prueba ANOVA de un factor con comparaciones múltiples post hoc en Tukey, se observó un incremento en el número de larvas de Trichostrongylus sp. a partir de una hora. Llegadas las tres horas se obtuvo un pico considerable de larvas en donde el conteo de estas era muy superior al de 2 horas. Por otra parte, un tiempo de espera de cuatro horas dio resultados similares a los de dos horas. Este último aspecto podría ser explicado por una situación en la que las larvas que ya han migrado al exterior, posterior a un tiempo de 3 horas intenten retornar a la zona de donde salieron, debido a la disminución de la temperatura en el medio externo. Otra posibilidad de este cambio podría estar relacionada a la vitalidad de la larva posterior a las 3 horas, lo cual deja claro que no es propicio una espera superior a ese tiempo, ya que los resultados no serían adecuados, mientras que la mayor recolecta se obtiene en ese punto máximo, y la diferencia con respecto a los otros tiempos es de significancia estadística. Para finalizar es importante señalar que los nematodos gastrointestinales en general poseen una buena resistencia a las temperaturas cálidas como frías, lo cual hace que el método utilizado y en los tiempos propuestos no afecte de mayor manera los resultados.