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Producción de lacasa utilizando Pleurotus ostreatus sobre cáscaras de plátano y bagazo de caña

Produção de lacasa utilizando Pleurotus ostreatus sobre cascas de plátano e bagazo de cana

^* Ingeniería de Alimentos. Candidata a Maestría en Ciencia y Tecnología de Alimentos Universidad Nacional de Colombia. Medellín. Antioquia.
^** Ingeniera de Alimentos. Master en Administración de Negocios (MBA). Universidad de los Andes. Bogotá.
^*** Ingeniero Químico. Ph D. en Ingeniería de Alimentos. Docente Asociado. Departamento de Ingeniería Agrícola y Alimentos. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad Nacional de Colombia. Medellín. Antioquia.

Correspondencia: Eduardo Rodríguez Sandoval. e-mail: edrodriguezs@unal.edu.co.

Artículo recibido: 16/12/2009; artículo aprobado: 3/12/2010

Resumen

Introducción. La cáscara de plátano de uso industrial representa del 35% al 40%, del peso total del fruto, siendo una cantidad considerable de residuos que se podrían aprovechar para la producción de complejos enzimáticos. Objetivo. Investigar el potencial que tiene la cáscara de plátano (verde y madura) variedad Dominico-Hartón como sustrato para la producción de la enzima extracelular lacasa utilizando el hongo Pleurotus ostreatus. Materiales y métodos. El hongo Pleurotus ostreatus se cultivó en diferentes mezclas así: Cáscaras de plátano verde (PV), cáscaras de plátano maduro (PM), cáscaras de plátano verde-bagazo de caña (50/50) (PVB), cáscaras de plátano maduro-bagazo de caña (50/50) (PMB). Las unidades de fermentación se mantuvieron a un pH de 4.8, una temperatura de 28°C y un contenido de humedad de 63%. La determinación de la enzima lacasa se llevó a cabo por la oxidación ABTS. Resultados. En los sustratos utilizados se obtuvieron un máximo de actividad lacasa el día 24; con excepción del tratamiento con PM que lo alcanza en el día 34. El sustrato PMB tuvo la mayor producción de lacasa con una concentración de 19.4 U/ml. Conclusión. La cáscara de plátano puede ser un buen sustrato cuando se suplementa con otros residuos lignocelulósicos como por ejemplo el bagazo de caña. La lacasa puede ser un indicador morfogenético al mostrar el máximo crecimiento del micelio.

Palabras clave: cáscara de plátano, bagazo de caña, Pleurotus ostreatus, lacasa.

Abstract

Introduction. Plantain peel for industrial purposes represents from 35% to 40% of the total fruit weight, becoming a considerable quantity of waste which could be used to produce enzymatic complexes. Objective. To investigate the potential green and mature plantain peel of "Dominico-Hartón" as a supportsubstrate to produce laccase extracellular enzyme by the use of Pleurotus ostreatus fungus. Materials and Methods. Pleurotus ostreatus fungus was cultivated in different mixtures, as follows: Green plantain peel (GPP), mature plantain peel (MPP) green plantain peel-cane bagasse (50/50) (GPPCB), mature plantain peel-cane bagasse (50/50) MPPCB). Fermentation units were kept at pH 4.8, 28°C and a 63% humidity. The determination of the laccase enzyme was carried out by ABTS oxidation. Results. In the substrates used, a maximum laccase activity was achieved in the 24^th day, except in the mature plantain treatment, which achieved it in the 34^th day. MPPCB substrate had the highest production of laccase with 19.4 U/mL concentration. Conclusion. Plantain peel can be a good substrate when is supplemented with other lignocellulosic wastes, such as sugar cane bagasse. Laccase can be used as a morphogenetic indicator because it shows the maximum growth of the mycelium.

Key words: plantain cane, cane bagasse, Pleurotus ostreatus, laccase.

Resumo

Introdução. A casca de plátano de uso industrial representa do 35% ao 40%, do peso total do fruto, sendo uma quantidade considerável de resíduos que se poderiam aproveitar para a produção de complexos enzimáticos. Objetivo. Pesquisar o potencial que tem a casca de plátano (verde e madura) variedade Dominico-Hartón como substrato para a produção da enzima extracelular lacasa utilizando o fungo Pleurotus ostreatus. Materiais e métodos. O fungo Pleurotus ostreatus se cultivou em diferentes misturas assim: Cascas de plátano verde (PV), cascas de plátano maduro (PM), cascas de plátano verde-baguaçu de cana (50/50) (PVB), cascas de plátano maduro-baguaçu de cana (50/50) (PMB). As unidades de fermentação se mantiveram a um PH de 4.8, uma temperatura de 28°C e um conteúdo de umidade de 63%. A determinação da enzima lacasa se levou a cabo pela oxidação ABTS. Resultados. Nos substratos utilizados se obtiveram um máximo de atividade lacasa o dia 24; com exceção do tratamento com PM que o atinge no dia 34. O substrato PMB teve a maior produção de lacasa com uma concentração de 19.4 Ou/ml. Conclusão. A casca de plátano pode ser um bom substrato quando se suplementa com outros resíduos lignocelulósicos como, por exemplo, o baguaçu de cana. A lacasa pode ser um indicador morfogenético ao mostrar o máximo crescimento do micélio.

Palavras importantes: casca de plátano (Banana da Terra), Baguaçu de cana, Pleurotus ostreatus, lacasa.

Introducción

El cultivo de plátano en Colombia tiene gran importancia socioeconómica como generador de empleo y de seguridad alimentaria, entendida esta última como la disponibilidad estable y suficiente de alimentos. El plátano (de consumo interno y exportación) alcanzó un área total de cultivo de 346.524 ha y un nivel de producción de 2.699.099 ton en el 2008¹. Actualmente, cerca de un 4% de la producción nacional de plátano se destina al mercado de exportación, el restante se dirige hacia el consumo interno en fresco y una muy pequeña proporción, menos del 1%, se destina como materia prima para la agroindustria nacional. Se estima que el mercado industrial del plátano absorbe aprox. 12 mil ton/año y se destinan a productos procesados para consumo humano y concentrados para consumo animal², donde se generan grandes residuos ricos en lignina y celulosa.

La lignocelulosa es uno de los recursos bioenergéticos renovables más abundantes en la naturaleza, el cual se compone de celulosa, hemicelulosa y lignina. Sin embargo, su utilización como fuente de energía se ve limitada en el presente porque la lignina es difícil de degradar y transformar a glucosa³. El porcentaje en peso de cáscara de las variedades de uso industrial puede estar entre un 35% a 40%, el cual es una cantidad considerable de residuos durante el procesamiento del plátano⁴. La cáscara contiene celulosa (10.5%) y hemicelulosa (14%) y lignina (17%)⁵. Por esta razón, se podría utilizar para la producción de complejos enzimáticos. Se han realizado diversas investigaciones sobre la obtención de enzimas ligninolíticas y celulolíticas con diferentes clases de hongos empleando como sustrato residuos de plátano (hojas, tallos, cáscaras). Reddy et al. (2003),⁶ investigaron la obtención de lacasa, lignina peroxidasa, xilanasa, CMCasa y Fpasa sobre residuos de banano utilizando Pleurotus ostreatus y Pleurotus sajorcaju. Osma et al. (2007),⁷ investigaron la producción de lacasa a partir de cáscara de banano con el hongo Trametes pubescens. Otros estudios se han enfocado en la evaluación de lacasa, manganeso peroxidasa y ligninoperoxidasa utilizando Pleurotus djamor y Lentinus crinitus en residuos de plátano y aserrín^8-9.

Los hongos del género Pleurotus son basidiomicetos de pudrición blanca, con un alto valor nutricional, propiedades terapéuticas y variadas aplicaciones biotecnológicas. El hongo Pleurotus ostreatus (P. ostreatus) posee la capacidad de degradar grandes polímeros (lignina y celulosa) que constituyen el substrato vegetal, así como contaminantes ambientales mediante la secreción de un complejo enzimático. La efectividad de esta degradación depende en gran medida de las oxidoreductasas extracelulares y los metabolitos secundarios de bajo peso molecular³. Según estudios previos, el hongo P. ostreatus es capaz de crecer sobre sustratos muy económicos como los residuos agrícolas¹⁰.

La importancia biotecnológica de la enzima lacasa radica en su habilidad para oxidar los compuestos fenólicos y los relacionados con la lignina, como también degrada ciertos contaminantes ambientales⁷. La lacasa se ha utilizado como agente blanqueador en la pulpa de madera y la industria de papel, en la desinfección con cloro y en la eliminación de compuestos fenólicos de las aguas residuales. En lo referente al sector alimenticio esta enzima hace parte indispensable de los análisis de fenoles en los jugos naturales; además tiene aplicaciones como biosensor para la determinación de los catecoles de los polifenoles en el té. La lacasa inmovilizada se ha utilizado para eliminar fenoles del zumo de manzana y del vino¹¹. Teniendo en cuenta lo anterior, esta propuesta plantea la evaluación de la actividad enzimática de lacasa producida mediante el cultivo Pleurotus ostreatus sobre cáscaras de plátano verdes y maduras, y bagazo de caña como fuente de carbono en fermentación sólida.

Materiales y métodos

Materia prima

Los plátanos verde y maduro variedad Dominico-Harton, fueron adquiridos en un supermercado local de la ciudad de Bogotá D.C y almacenados a temperatura ambiente hasta su posterior uso. Las cáscaras fueron retiradas de los plátanos y desinfectadas con hipoclorito de sodio al 1% en agua y cortadas en láminas de aproximadamente 2 cm x 2cm. El bagazo de caña adquirido por la Universidad Jorge Tadeo Lozano fue cortado en trozos de 2 cm x 2cm y mezclado con la cáscara verde y madura en diferentes proporciones. Los sustratos utilizados en la experimentación fueron los siguientes: cáscaras de plátano verde (PV) (100%), cáscaras de plátano maduro (PM) (100%), cáscaras de plátano verde-bagazo de caña (PVB) (50/50), cáscaras de plátano maduro-bagazo de caña (PMB) (50/50).

Cultivo de Pleurotus ostreatus

Los inóculos de Pleurotus ostreatus se obtuvieron de semillas de trigo cultivada con esta cepa utilizando una relación de 4% (p/p en base húmeda) para cada unidad de fermentación. Las unidades de fermentación fueron bolsas de polipropileno biorientado (esterilizables), con tapón de algodón y capacidad de 500g, pero solo empleando 200 g en cada una de ellas. La fermentación se llevó a cabo a 28°C, en oscuridad, y ajustando la humedad a 63%, condiciones apropiadas para el crecimiento del organismo y la producción de enzimas³.

Medición de la actividad enzimática lacasa (Lcc)

Los extractos enzimáticos de cada cultivo se obtuvieron con buffer de acetato 0.05 M, pH 4.8, en una relación 0.25 g de sustrato/mL de buffer. Se agitaron vigorosamente y se centrifugaron a 4000 rpm durante una hora. El sobrenadante se filtró sobre gasa y se centrifugó de nuevo a 4000 rpm durante 30 min y se almacenó a 4°C para una posterior medición de su actividad enzimática.

La determinación de la enzima lacasa se llevó a cabo por la oxidación ABTS [2,2'- Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] al catión ABTS⁺ con un volumen de reacción de 2 ml que comprende a 200 μl de ABTS 1 mM, 600 μl de buffer acetato de sodio 0.1M, pH 5 y 1200 μl de extracto enzimático¹². La absorbancia se tomó a una longitud de onda de 420 nm en un espectofotometró (Unicam Helios B NC 9432 UVB 1000E, Termo Spectronic, Rochester NY), realizando medidas al inicio de la reacción y tres minutos después, para obtener un delta de absorbancia útil en los cálculos, donde se utilizó un coeficiente de extinción de 36000 M^-1 cm^{-1 12-13}. Una unidad enzima se define como 1 μmol de producto formado por minuto (U = μmol / min), bajo las condiciones del ensayo. Las unidades enzimáticas (U/L) de lacasa se calculan utilizando la Ecuación 1.

En los ensayos preliminares se observaron diferentes intensidades de color amarillo en los extractos de cada uno de los tratamientos, los cuales se utilizaron para la cuantificación de la actividad lacasa (Figura 1). Durante el tiempo de experimentación la coloración de los extractos enzimáticos aumentaba lo que se atribuye al estado de maduración del sustrato en el momento de hacer las mediciones. Amaga et al (2008)¹⁸ establecieron que se incrementa el porcentaje de lignina (14.3–15.4%) a medida que las cáscaras de plátano maduran, y si se tiene en cuenta que la lignina es utilizada por los hongos filamentosos para producir enzimas ligninasas como la lacasa, se podría afirmar que las cáscaras de plátano maduro pueden tener una mayor producción de lacasa.

En la figura 2 se presenta el comportamiento de la actividad lacasa para los diferentes tratamientos durante el tiempo de experimentación. A partir del día 12 de cultivo se observa un pequeño valor en la producción de lacasa. En los sustratos utilizados se obtiene un máximo de actividad lacasa el día 24; sin embargo, el tratamiento PM alcanza su máximo en el día 34. Luego comienza a descender, aunque en el día 45 hay un leve aumento de esta actividad para el tratamiento con sustrato PMB. Este comportamiento es similar al reportado por Murrieta et al. (2002)¹⁵, quienes evaluaron la producción de lacasa utilizando Pleurotus pulmonarius y Trichoderma viride sobre pulpa de café.

Los valores de la actividad lacasa obtenidos por ml de extracto (U/ml) para cada uno de los tratamientos de cultivo durante 45 días se muestran en la Tabla 1. Los resultados de la actividad lacasa tuvieron diferencias significativas entre tratamientos. El sustrato PMB resultó ser el más adecuado para la producción de lacasa, teniendo una mayor concentración de esta en un tiempo de 24 días (19.4 U/ml), seguido del sustrato PVB que al mismo tiempo reportó un valor de 17.6 U/ml. Los PV y PM obtuvieron las actividades más bajas con valores entre 12-12.6 U/ml para ese mismo tiempo de cultivo (24 días). Si se comparan estos dos últimos sustratos se puede apreciar que se produce más lacasa cuando se utiliza sustrato de cáscaras de plátano maduro (PM), lo cual pudo contribuir a la mayor actividad de esta enzima empleando bagazo de caña (PMB).

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