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INTRODUCCIÓN
El Tropaeolum tuberosum R&P mashua es una planta nativa, usada por los antiguos peruanos en la alimentación. El padre Bernabé Cobo en sus escritos hace referencia a esta planta, señalando que "tiene la virtud esta raíz de reprimir el apetito venéreo" [1].
La espermatogénesis es el proceso de formación de los espermatozoides, gametos masculinos, que comienza con la división de las espermatogonias y finaliza con la formación de espermatozoides [2,3]. En el ratón adulto este proceso tiene una duración de 34 a 35 días [4-6].
El Tropaeolum tuberosum R&P mashua actualmente, tiene importancia para satisfacer la alimentación de los habitantes en los Andes altos [7], pero su consumo no es solo por el alto valor nutricional que posee, sino también por los efectos que presenta sobre el ímpetu sexual [1]. La espermatogénesis es un proceso fisiológico fundamental en el varón, para dar lugar a la reproducción humana, su unidad funcional es el espermatozoide que contiene los gametos masculinos [7,8].
Existen antecedentes históricos que indican que los ejércitos del inca se alimentaban de mashua, presuntamente para inhibir su ímpetu sexual, al reducir los niveles de testosterona, es decir, que tiene propiedades anafrodisiacas [1], actualmente los comuneros consumen este producto no sólo por su alto valor nutritivo sino, además, por el efecto de inhibir la libido. Hasta el momento no se ha comprobado el efecto de la planta de Tropaeolum tuberosum R&P mashua sobre la espermatogénesis, ya que para la iniciación de este proceso es necesario la intervención de la hormona testosterona, edad, cambios fisiológicos [7,9,10].
El presente trabajo tiene como objetivo determinar científicamente el efecto de los extractos secos clorofórmico y de diclorometano de Tropaeolum tuberosum R&P mashua sobre la cantidad de espermatozoides en ratones albinos, y determinar la posible toxicidad aguda de esta especie vegetal en ratones albinos.
Al Tropaeolum tuberosum R&P mashua se le atribuyen propiedades medicinales como: diurético, antiinflamatorio de la próstata, inhibidor de la libido en varones. Esta especie vegetal es usada en la medicina tradicional para el tratamiento de dolencias genitourinarias, anemia y desordenes urinarios utilizándose básicamente bajo la forma de decocción del tubérculo [11,12].
MATERIAL Y MÉTODOS
Con el objetivo de evaluar y determinar el efecto sobre la espermatogénesis en ratones albinos se realizó un estudio experimental con grupos para cada extracto seco clorofórmico y de diclorometano de Tropaeolum tuberosum R&P mashua. Es un diseño con preprueba y un grupo control. Para la toxicidad aguda se realizó un estudio experimental, pues los animales de experimentación fueron seleccionados aleatoriamente, de series cronológicas con múltiples grupos y un diseño con grupo control y sin preprueba.
La investigación del efecto sobre la espermatogénesis y toxicidad aguda son experimentales cuenta con un grupo control y los animales de experimentación se asignaron al azar. Se siguió para el conteo de los espermatozoides la técnica de conteo de glóbulos blancos [13,14].
ANÁLISIS DE DATOS
Los datos obtenidos de cada uno de los indicadores sobre la espermatogénesis medidos para la evaluación y comparación del efecto entre los extractos, fueron procesados mediante el paquete estadístico SPSS. 21,0 (Statistical Package for Social Science). Se sometieron a un análisis de varianza (ANOVA). Así mismo, posterior al ANOVA, se realizó la prueba de comparaciones múltiples de medias, propuesta por Duncan, con el fin de detectar entre cuales grupos se ubican las diferencias.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Determinación del porcentaje de humedad
Para la determinación el porcentaje de humedad se utilizó el siguiente método gravimétrico que consiste en la diferencia de pesos.
Dónde: % H = porcentaje de humedad.
M1 = peso de muestra fresca.
M2 = peso de muestra seca
Análisis, interpretación y discusión
Se analizaron tres muestras de los tubérculos de Tropaeolum tuberosum R &P mashua, obteniéndose respectivamente, 85,1 %, 84,9% y 85% de porcentaje de humedad para cada muestra, luego se calculó el porcentaje de humedad promedio para las tres muestras, este valor fue del 85% de humedad.
Según A. Guerra [15] reporta el porcentaje de humedad de este tubérculo fue de 84,5%, mostrando similitud entre ambos estudios.
El valor de 85% de humedad indica que los tubérculos de Tropaeolum tuberosum R&P mashua presentan un alto contenido de agua, por lo cual se debe señalar que el secado de la muestra debe realizarse cuidadosamente, trozando la muestra en pequeños fragmentos para que estos puedan liberar con mayor facilidad su contenido de agua, esto para evitar que proliferen formas de vida externas (hongos), ya que estos pueden alterar los metabolitos de la muestra vegetal.
Determinación del porcentaje de rendimiento
Tenemos la cantidad de producto obtenido en la extracción química.
Dónde: %E = porcentaje de rendimiento
Pf = peso final (extracto seco)
Pi = peso inicial (muestra molida)
Análisis, interpretación y discusión
Donde el extracto de diclorometano presentó un porcentaje ligeramente mayor de rendimiento en comparación con el extracto clorofórmico, esto podría deberse al uso de solventes de diferente polaridad, puesto que el diclorometano es más polar que el cloroformo, estas observaciones nos indican que al usar solventes más polares se pueden obtener mayores porcentajes de rendimiento.
Pruebas de solubilidad
Las pruebas de solubilidad se realizaron utilizando diferentes solventes de polaridad decreciente; obteniéndose los resultados consignados en la tabla 3.
Análisis, interpretación y discusión
Se utilizó el modelo P. Hurtado empleando una escala de solubilidad del solvente más polar al solvente más apolar [16,17].
Mostrando los siguientes resultados de solubilidad de los extractos secos clorofórmico y de diclorometano de Tropaeolum tuberosum R & P mashua, se utilizaron solventes de polaridad decreciente que permitieron deducir la presencia de los grupos de metabolitos secundarios en los extractos. El extracto clorofórmico es soluble en solventes apolares, debido a que el cloroformo es de naturaleza altamente apolar, por ende, este extracto será más soluble en solventes de su misma o similar naturaleza (hexano, benceno, éter etílico, cloroformo y diclorometano), poco soluble en solventes polares (metanol y etanol) e insoluble en agua.
Así mismo, el extracto de diclorometano es soluble en solventes apolares, debido a que el diclorometano es de naturaleza apolar, aunque menos que el cloroformo, por lo cual dicho extracto será más soluble en solventes de su misma o similar naturaleza (acetona, diclorometano, cloroformo y éter etílico) y poco soluble en solventes polares (metanol y etanol) e insoluble en agua destilada.
Análisis fitoquímico cualitativo
En la determinación de metabolitos secundarios realizados en los extractos secos cloro-fórmico y de diclorometano de Tropaeolum tuberosum R &P mashua se obtuvieron los resultados que a continuación se presentan en la tabla 4.
Análisis, interpretación y discusión
En el análisis fitoquímico del extracto seco clorofórmico de Tropaeolum tuberosum R & P mashua se determinó la presencia de abundantes triterpenoides y esteroides, moderada cantidad de: compuestos fenólicos, azúcares reductores, glucósidos, antraquinonas y naftoquinonas.
Por otro lado, en el extracto seco de diclorometano de Tropaeolum tuberosum R & P mashuase determinó la presencia abundante de triterpenoides y esteroides, azúcares reductores y aminoácidos en abundante cantidad y en moderada cantidad se encontraron compuestos fenólicos, flavonoides, antraquinonas y naftoquinonas.
Además, otros estudios de referencia como el del Instituto de Investigación Agropecuaria de Ecuador señalan que el Tropaeolum tuberosum R & P mashua tiene en su composición abundantes compuestos fenólicos, flavonoides, terpenos y aminoácidos, los cuales se encuentran en el análisis fitoquímico [18]; cabe resaltar que el análisis que se realizó en el trabajo de investigación, no muestra abundancia a diferencia de lo que refieren los estudios ya realizados, esto podría deberse a que los extractos son bastante apolares y los metabolitos son más solubles en solventes polares.
Del efecto sobre los parámetros seminales
Luego del tratamiento de los grupos experimentales con los extractos secos mashua, por un período de siete días, se realizó el recuento de espermatozoides. Los resultados se muestran en la tabla 5.
Análisis, interpretación y discusión
En el análisis cuantitativo de los espermatozoides podemos decir que en el grupo que fue tratado con el extracto seco clorofórmico de Tropaeolum tuberosum R & P mashua se produjo una disminución del 79,9% en el conteo de espermatozoides con respecto al grupo control.
De otro lado, el grupo que fue tratado con el extracto seco de diclorometano de Tropaeolum tuberosum R & P mashua tuvo una disminución del 77,1% en el conteo de espermatozoides con respecto al grupo control.
La mayor disminución de espermatozoides fue la del grupo tratado con el extracto seco clorofórmico en el que se observa una disminución del 79,9%, en cambio, el grupo tratado con el extracto seco de diclorometano presentó una disminución del 71,1% (respecto al grupo de control).
Así, es importante mencionar que los triterpenoides y esteroides comparten mucho de su estructura química ya que provienen de la misma ruta biosintética, estos forman parte de la porción lipídica insaponificable, y se extraen con disolventes halogenados habituales [19-21].
Es necesario en este punto revisar otros estudios relacionados con el tema de esta investigación. Por ejemplo, los estudios realizados por Uttam Kumar Das y colaboradores [22-25], en ratas, indican que los niveles bajos de testosterona en plasma inhiben las actividades de las enzimas esteroideas genitales, con lo que se produce la disminución del número de espermatozoides. En el caso de la presente investigación los triterpenoides y esteroides al ser de naturaleza esteroidal y precursores de hormonas, podrían afectar la actividad de las enzimas que se mencionan en el estudio.
Estudios reportados por J. Pino y R. Alvis (2009) [26,27] en su trabajo de investigación Efecto de Brugmansia arborea (L.) Lagerheim (Solanacea) en el sistema reproductor masculino de ratón muestran resultados después del tratamiento de 5,440 x 106 ± 3,164 x 106, datos similares a los encontrados en el estudio con extractos secos clorofórmico y de diclorometano de especie vegetal tropaeolum tuberosum (Ruiz & Pavón) mashua. Ambos mostraron disminución de los espermatozoides después de los tratamientos.
Además, algunos de los esteroides presentes en los extractos secos clorofórmico y de diclorometano de Tropaeolum tuberosum R &P mashua, podrían presentar una estructura similar a la de la testosterona, con lo cual podrían disminuir los niveles de gonadotropina, y así disminuir el conteo de espermatozoides
Del examen de espermatograma
Luego del tratamiento de los grupos experimentales con los extractos mashua, se realizó un espermatograma, la muestra que se utilizó para este examen fue el homogeneizado obtenido a partir de las colas de los epidídimos de los ratones pertenecientes a cada grupo de experimentación, estos resultados se muestran a continuación.
El examen macroscópico se realizó con el método de conteo de la cámara de neubauer, siguiendo el protocolo de conteo de glóbulos rojos. Homogenizando las colas de epidídimo de los ratones [25].
Análisis, interpretación y discusión
En el examen macroscópico, realizado en el homogeneizado de las colas de los epidídimos para cada grupo de experimentación, podemos apreciar que no existe mayor diferencia entre los grupos experimentales y el grupo control, este hecho podría deberse a que se trabajó con los homogenizados, los cuales fueron preparados en 0,5 mL de solución fisiológica, esta tiene un pH de 7, por lo tanto al añadir las colas de los epidídimos y homogeneizarlas el pH de la solución fisiológica no se altera de manera significativa.
Respecto al color y la turbidez de las muestras, todas presentaron un color ligeramente blanco y una escaza turbidez, esto también podría deberse a que se trabajaron en medio de solución fisiológica, utilizándose para cada muestra la misma cantidad de esta solución. Por lo tanto, el grupo control y los grupos experimentales no presentan mayores diferencias macroscópicas.
Figura 1 Espermatozoide de ratón. Laboratorio de Oficina Criminalística Cusco Policía Nacional del Perú. Fuente: elaboración propia.
Análisis, interpretación y discusión
Podemos apreciar que en los dos grupos experimentales al igual que en el grupo control la movilidad de los espermatozoides es nula, esto podría deberse al proceso del homogeneizado durante el cual se trabajó a una temperatura ambiente, sin tomar en cuenta la temperatura corporal de los ratones. Así mismo, cabe mencionar que para realizar la observación microscópica se realizó previamente una tinción con cristal violeta [28-31], este colorante podría haber fijado los espermatozoides en la lámina porta objetos, evitando su normal movilidad.
En conclusión, al observar la morfología de los espermatozoides en los dos grupos experimentales no se observaron formas anormales en comparación a la morfología observada en el grupo control.
En la figura 2 observamos un espermatozoide de ratón y en la figura 3 observamos un espermatozoide humano, comparando ambas figuras podemos apreciar que la morfología de los espermatozoides de los ratones no difiere de la de los seres humanos, salvo en el tamaño que según la bibliografía en los ratones es de 8 micras y en el ser humano de 45 micras, esta diferencia de tamaño hace que en el espermatozoide humano se pueda apreciar y diferenciar con mucha claridad las partes de un espermatozoide (cabeza, cuello y cola).
Figura 2 Espermatozoide humano. Laboratorio de Oficina Criminalística Cusco, Policía Nacional del Perú. Fuente: elaboración propia.
Análisis estadístico
Tomando en cuenta como factor al grupo control
Tabla 8 Cuantificación de espermatozoides de los grupos control, extracto clorofórmico y extracto de diclorometano de mashua.
Tabla 10 Análisis de estadísticas básicas de los grupos de ratones: control, extracto clorofórmico y extracto de diclorometano de la especie vegetal mashua.
Promedio general = 17,52
Nos indica que únicamente el 1,07% de los datos no son representados por la media general, de esto se puede concluir que los datos son altamente confiables.
i) Decisión
Como p < α, entonces se rechaza Ho.
ii) Conclusión
Como p = 0,000000 < 0,01 (1%), entonces se rechaza la hipótesis nula (Ho), y aceptamos la hipótesis alterna lo que podemos decir que existe una diferencia altamente significativa entre los dos tipos de extractos y el grupo control aplicados a los ratones.
De la toxicidad aguda
Al realizar la prueba de toxicidad aguda con los extractos secos clorofórmico y de diclorometano de Tropaeolum tuberosum R &P mashua se obtuvieron los resultados consignados en la tabla 12.
Tabla 12 De la toxicidad aguda sometida por el extracto seco clorofórmico y de diclorometano en los ratones.
Teniendo como referencia a Loomis y otros autores [32,33] para la determinación de la toxicidad aguda por vía oral en ratones albinos sometidos a dosis crecientes de extracto seco de diclorometano de Tropaeolum tuberosum R & P mashua, según el criterio de Williams se comprobó que el extracto es prácticamente atóxico hasta la dosis de 16.000 mg/kg de peso, de lo cual se deduce que la dosis letal media está por encima de esta medida, dosis que por ser muy elevada no se llega a administrar a una persona con peso promedio de 70 kg. [10,20]
El comportamiento de los ratones al administrarles las dosis correspondientes se observan en la tabla 12, donde se evidenció signos de estimulación los mismos que se aprecian por periodos cortos a partir de la dosis de 10.000 mg/kg; con dosis a partir de 16.000 mg/kg se observó disminución de la actividad motora los cuales también desaparecían al cabo de un tiempo. Al cabo de una semana de observación, los animales evidenciaron sus funciones vitales sin ningún tipo de alteración lo que comprueba que el extracto seco de diclorometano de Tropaeolum tuberosum R & P mashua aplicado por vía oral es atóxico.
CONCLUSIONES
Se determinó el efecto de los extractos secos clorofórmico y de diclorometano de Tropaeolum tuberosum R & P mashua, sobre los parámetros seminales los cuales disminuyen la producción de espermatozoides, y presentan movilidad nula en ratones albinos y se determinó la toxicidad aguda de los extractos secos siendo ambos atóxicos en ratones albinos, según el criterio de Williams.
Se obtuvieron los extractos secos clorofórmico y de diclorometano a partir de los tubérculos de Tropaeolum tuberosum R & P mashua.
Se realizaron las pruebas preliminares (porcentaje de humedad, porcentaje de rendimiento, solubilidad y estudio fitoquímico) de los extractos secos clorofórmico y de diclorometano de Tropaeolum tuberosum R & P mashua, también se realizó exámenes de los parámetros seminales en la solución de los epidídimos de los ratones.
Finalmente, se concluye que la toxicidad aguda de los extractos secos clorofórmico y de diclorometano de Tropaeolum tuberosum R & P mashua en ratones albinos machos es nula, considerándoseles atóxicos. Concluyéndose que la DL50 se encuentra por encima de la dosis de 20.000 mg/kg de peso corporal para ambos extractos, según el criterio de Williams.
