Obtenção dos óleos essenciais

As folhas de P. dioica L. utilizadas neste estudo estão registradas nos arquivos botânicos do Instituto Biodinâmico (IBD) de Botucatu de acordo com certificado n^o CA021205. As cascas de C. sinensis L foram registradas no Instituto Federal do Maranhão pelo setor de fruticultura, como D-25 (laranja doce, variação: pera).

Obtenção dos óleos essenciais

As folhas de P. dioica L. e cascas de C. sinensis L. foram coletadas e transportadas para o Laboratório de Pesquisa e Aplicação de Óleos Essenciais da Universidade Federal do Maranhão (UFMA), onde foram secas em temperatura ambiente, trituradas e armazenadas para extração do OE.

Para extração dos OE, utilizou-se a técnica de hidrodestilação com um extrator de Cle-venger de vidro acoplado a um balão de fundo redondo acondicionado em manta elétrica como fonte geradora de calor. Foram utilizadas 30 g das folhas secas de P. dioica e 120 g das cascas C. sinensis, adicionando-se água destilada (1:10). A hidrodestilação foi conduzida a 100 °C por 5 h recolhendo-se o OE extraído. Cada OE foi seco por percolação com sulfato de sódio anidro (Na₂SO₄) e centrifugado. Essas operações foram realizadas em triplicatas e as amostras armazenadas em ampolas de vidro âmbar sob refrigeração de 4 °C. Posteriormente submetido as análises. O procedimento experimental é apresentado na figura 1.

Figura 1 Esquema experimental da extração dos OE. 

Os parâmetros físico-químicos dos OE foram determinados: densidade, solubilidade, cor e aparência de acordo com a Farmacopeia Brasileira [⁷]. O rendimento do OE foi expresso em porcentagem na relação massa/volume pela medida de densidade.

Toxicidade

Para a avaliação da letalidade de Artemia salina Leach, foi preparada uma solução salina estoque de cada OE na concentração de 10 000 mg L^-1 e 0,02 mg de Tween 80 (tenso ativo). Alíquotas de 5, 50 e 500 µL desta foram transferidas para tubos de ensaio e completados com solução salina já preparadas anteriormente até 5 mL, obtendo-se no final concentrações de 10, 100 e 1000 mg L^-1, respectivamente. Todos os ensaios foram realizados em triplicatas, onde dez larvas na fase náuplio foram transferidas para cada um dos tubos de ensaio.

Para o controle do branco utilizou-se 5 mL da solução salina, para o controle positivo K₂Cr₂O₇ e para o controle negativo 5 mL de uma solução 4 mg L^-1 de Tween 80. Após 24 h de exposição, realizou-se a contagem das larvas vivas, considerando-se mortas aquelas que não se movimentaram durante a observação e nem com a leve agitação do frasco.

Adotou-se o critério estabelecido por Dolabela [⁸] para classificação da toxicidade dos OE, sendo considerado altamente tóxico quando CL₅₀ ≤ 80 mg L^-1, moderadamente tóxico para 80 mg L^-1 ≤ CL₅₀ ≥ 250 mg L^-1 e levemente tóxico ou atóxico quando CL50 ≥ 250 mg L^-1.

Padronização do inóculo microbiano para ensaios de sensibilidade

Foram utilizadas duas cepas de bactérias: Escherichia coli (ATCC 25922) e Staphylo-coccus aureus (ATCC 25923). Foram identificadas e confirmadas pelas provas bioquímicas: citrato de Simmons (CIT), vermelho de metila (VM), Voges-Proskauer (VP), malonato (MAL), fermentação de carboidratos, descarboxilação de aminoácidos, indol (IND), motilidade (MOT) e produção de H₂S, teste de catalase, teste de coagulase e coloração de Gram e teste da urease (UR).

Culturas microbianas puras mantidas em ágar TSA foram repicadas para caldo de infusão de cérebro e coração (BHI) e incubadas a 35 °C até atingirem fase exponencial de crescimento (4-6 h). Após esse período, as culturas tiveram sua densidade celular ajustada em solução salina 0,85% estéril, de modo a se obter uma turbidez comparável à da solução padrão de McFarland 0,5, o que resulta em uma suspensão microbiana contendo aproximadamente 1,5 x 10⁸ UFC mL^-1 de acordo com as normas do Clinical and Laboratory Standards Institute [⁹].

Método de difusão de disco (MDD)

A técnica de difusão de disco foi realizada segundo Clinical and Laboratory Standards Institute [9] que padroniza os testes de sensibilidade de antimicrobianos por disco-difusão. Primeiro foram preparadas as placas com o meio de cultura Ágar Mueller Hinton (AMH) após sua solidificação foi distribuído à suspensão microbiana na superfície do ágar e deixado em repouso à temperatura ambiente por 30 min. Logo após são preparados os discos contendo 50 µL dos OE e os discos com concentrações definidas dos antibióticos. Utilizando-se pinça esterilizada, os discos foram distribuídos sobre a superfície do ágar. As placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 35 °C por 24 h. Os diâmetros dos halos de inibição foram mensurados, incluindo o diâmetro do disco. Esses ensaios foram feitos em triplicata. Os valores dos halos de inibição foram as médias das medidas dos três resultados. Ensaios realizados em triplicata.

Concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM)

O ensaio de concentração inibitória mínima (CIM) foi realizado empregando-se a técnica de diluição em caldo, proposta pela Clinical and Laboratory Standards Institute [⁹].

Primeiramente foram preparadas soluções dos OE utilizando-se dimetilsufoxido (DMSO) a 2%, sendo preparadas diluições seriadas em Caldo MH, resultando nas concentrações de 10 a 1000 µg mL^-1. A cada concentração foram adicionadas suspensão microbiana contendo 1,5 x 10⁸ UFC mL^-1 das cepas E. coli e S. aureus. Os tubos foram incubados a 35 °C por 24 h. Foram realizados os controles de esterilidade e crescimento para o ensaio realizado.

Após o período de incubação, foi verificada CIM dos OE, sendo definida como a menor concentração que visivelmente inibiu o crescimento bacteriano (ausência de turvação visível). Ensaios realizados em triplicata.

Para o ensaio de concentração bactericida mínima (CBM) empregou-se uma alíquota de 100 µL das diluições provenientes do caldo MH que visivelmente inibiram o crescimento microbiano. As alíquotas foram inoculadas em Ágar Mueller Hinton (AMH) com posterior incubação a 35 °C por 24 h. A CBM foi determinada como a menor dose que visualmente no ensaio de CIM apresentou inibição de crescimento e que na cultura em AMH também não apresentou crescimento bacteriano.

Propriedades físico-químicas

Os parâmetros físico-químicos dos OE são importantes não apenas para determinação da qualidade, como também para o controle da sua pureza e estes são apresentados na tabela 1. Observa-se que o OE de C. sinensis obteve um rendimento de 2,47% superior ao OE de P. dioica de 1,80%.

Ao compararmos individualmente o rendimento do OE de C. sinensis aos resultados obtidos por Silva et al. [¹⁰] que extraiu os OE da casca de frutos secos e frescos, os autores perceberam seu rendimento variando entre 1,80-2,00%, sendo que este estudo obteve um rendimento de +0,47% acima do rendimento máximo obtido pelos autores, visto que a densidade dos mesmos autores variou entre 0,8480 a 0,8490 g mL^-1, densidade essa que está semelhante este trabalho em uma variação de +0,0010 g mL^-1.

Mesmo o rendimento do OE da P. dioica sendo menor que o rendimento do C. sinensis é importante enfatizar que para os OE rendimentos acima de 1,5% são de extrema significância. Em estudo realizado Voris et al. [¹¹] ao extrair esse mesmo OE do fruto adquirido em um mercado varejista do Rio de Janeiro (RJ), os autores empregaram um período de 4 h em sua hidrodestilação, mas seu rendimento máximo foi de 1,60%, comparando-se ao estudo atual que empregou um tempo menor de hidrodestilação (3h-100 °C) e obtivemos um rendimento de 1,80% utilizando uma parte regenerativa da planta, torna-se de extrema importância e significância para a visualização do seu potencial de aplicação.

Comparando os valores para o OE estudado com os da literatura, pode-se observar que houve uma similaridade entre eles, no que diz respeito aos parâmetros analisados. As pequenas diferenças nos valores encontrados podem ser atribuídas a fatores tais como época de coleta, diferentes tipos de solo, condições e tempo de armazenamento [¹²]. Sendo importante enfatizar o rendimento de 2,47% para o OE de C. sinensis que foi observado em resultados superiores a literatura, incentivando sua produção em virtude do aproveitamento de cascas que são comumente descarte em feiras públicas ou bairros locais de São Luís-MA.

Caracterização química dos óleos essenciais

Os picos cromatográficos foram identificados através da comparação dos respectivos espectros de massa com os dados das espectrotecas (1) WILEY 139; (2) NIST107 e (3) NIST21. De acordo com os resultados obtidos são apresentados na tabela 2 os compostos identificados no OE extraído das cascas de C. sinensis e na tabela 3 os compostos identificados no OE extraído das folhas da P. dioica.

Como pode ser observado na tabela 2 foram identificados 15 componentes na amostra do OE de C. sinensis, sendo o constituinte majoritário do OE d-limoneno com 81,50% da composição, seguido do linalol (6,36%) e do β-Mirceno (2,95%).

O composto químico d-limoneno é confirmado como constituinte majoritário do OE por Araújo et al. [¹³] que ao extraí-lo das cascas de frutos de C. sinensis do mercado local de Aracaju, Sergipe realizou a caracterização química do mesmo através de CG/ EM e notou a presença do constituinte em 91,88% de sua amostra.

Resultados semelhantes a este estudo também é notificado por Martins et al. [¹⁴] que ao realizarem a caracterização química de OE comerciais do gênero Citrus, observaram a presença do d-limoneno em 83,33% da composição do OE de C. sinensis.

O d-limoneno é um terpeno relativamente estável que possui aplicações na literatura para o desenvolvimento de bioprodutos vegetais [¹⁵]. Os OE do gênero Citrus possuem esse componente como majoritário em sua composição e propriedades como a atividade antimicrobiana pode ser comprovada por Rodrigues [¹⁶], porém ao retratarmos o C. sinensis seu potencial bactericida foi pouco estudado, sendo relatados muitos trabalhos com relação a sua ação antimicrobiana antifúngica [¹⁷] e larvicida [¹³]. Assim, observa-se que o OE de C. sinensis possui potencial para explorarmos sua atividade bactericida neste estudo, sendo de vital importância para o estado e para o país um produto natural obtido através da parte de um vegetal que é comumente descartado ou de aplicações superficiais.

Como pode ser observado na tabela 3 foram identificados 7 componentes na amostra, sendo o constituinte majoritário do OE o eugenol com 85,673%, seguido do chavicol (6,79%) e do mirceno (2,76%).

O teor de eugenol (85,67%) relatado neste estudo torna-se significante ao compararmos com Oliveira [¹⁸] que extraiu o OE das folhas de P. dioica coletadas em Minas Gerais também observou que o eugenol como o constituinte majoritário, porém o teor observado foi de 44,9%. Outro fato relatado foi a presença do limoneno em 10,1% da composição e o chavicol sendo exibindo em um teor de 7,5%. Essa composição também poderá estar ligada ao rendimento inferior de 0,49% obtido por Oliveira [¹⁸], ainda sendo ressaltado que os autores utilizaram um tempo de extração de 4 h.

Resultados semelhantes foram relatados por Oliveira et al. [¹⁹] utilizando plantas do sul do estado da Bahia coletadas em 2006, onde obtiveram o eugenol (75,07%) como constituinte majoritário da sua amostra do OE das folhas de P. dioica, porém diferente deste estudo componente secundário dos autores foi o mirceno com 8,19% e o chavicol esteve em seguida com 6,35%.

O eugenol é uma molécula extraordinariamente versátil e foi incluída como um aroma picante em sorvete, produtos de panificação e doces em concentrações restritas [²⁰], enxaguatórios bucais, preparações farmacêuticas e dentárias [²¹,²²]. Além de possuir propriedades biológicas comprovadas por Kamatou et al. [²³], assim é de vital importância o estudo do OE extraído da P. dioica como uma fonte natural significativa de eugenol tanto para aplicações biológicas quanto para as indústrias em geral.

Toxicidade

Na tabela 4 são apresentadas as concentrações letais 50% referentes a ação dos OE frente a Artemia salina L. e sua posterior classificação segundo o critério de Dolabela [⁸].

A concentração letal 50% (CL₅₀) refere-se ao ponto em que o número de animais sobreviventes é igual ao número de animais mortos, e seguindo o critério de Dolabela [⁸] é possível determinar a toxicidade de produtos naturais visando uma aplicação específica do agente no organismo alvo, visto que óleos com toxicidade elevada não são recomendados para aplicações biológicas.

Na tabela 4 foi possível observar que nenhum dos óleos foi classificado como tóxico, logo, suas aplicações podem ser relativamente aceitáveis e sendo encorajadas. Desta forma, os ensaios de atividade antimicrobiana foram iniciados. É importante ressaltar que o OE de C. sinensis extraído das cascas do fruto apresenta até agora um rendimento significativo e componentes químicos de importância biológica e neste ensaio de toxicidade apresenta a CL₅₀ de 511,6 mg L^-1, muito acima do critério que era de apenas 250 mg L^-1 para ser classificado como atóxico. Logo, este OE tem seu potencial de aplicação novamente incentivado.

É importante enfatizar que estudos relativos à toxicidade de produtos naturais são de vital importância para aplicações biológicas e estudos da literatura ainda não divulgam toxicidade das plantas em estudo em um teste específico como o bioensaio frente a Artemia salina.

Os resultados referentes aos ensaios para determinação da atividade antimicrobiana são apresentados na tabela 5. Todos os óleos apresentaram atividade antimicrobiana frente a Escherichia coli e Staphylococcus aureus.

Tabela 5 Halos de inibição (HI), concentração inibitória mínima (µg/mL) dos OE frente a Staphylococcus aureus e Escherichia coli. 

Ao observarmos a tabela 5 notamos que o OE de P. dioica foi mais eficiente ao inibir a bactéria Staphylococcus aureus pelo método de difusão de disco se compararmos o seu halo de 25 mm com o 15 mm resultado da ação do óleo frente a Escherichia coli. Ambos os halos de inibição permitem classificar as bactérias como sensíveis pelo critério estabelecido por Moreira et al. [²³]. O ensaio de concentração inibitória mínima revelou que o OE de P. dioica inibe o crescimento microbiano de Escherichia coli a partir de 25 µg mL^-1 e de Staphylococcus aureus a partir de 10 µg mL^-1.

O estudo de Oliveira [¹⁸], onde a autora relata a atividade do mesmo óleo com uma CIM de 5 µg mL^-1 para E. coli e 20 µg mL^-1 para S. aureus retrata a diferença deste estudo onde o mesmo óleo obtido em dois locais diferente possuem propriedades diferentes, visto que o óleo da autora foi mais eficiente frente a E. coli do que a S. aureus, enquanto que, neste estudo ocorreu o inverso do observado pela autora.

Em um estudo recente Lorenzo-Leal et al. [²⁴] em Puebla, México, utilizou a técnica de micropoços para determinar a CIM do OE da P. dioica extraída de frutos comercializados e diferentemente deste estudo não observou atividade do óleo frente a E. coli e obteve uma CIM extremamente alta de 2000 µg mL^-1 para S. aureus, o que revigora os resultados satisfatórios obtidos neste estudo, onde para S. aureus obtivemos uma CIM de 10 µg mL^-1.

Ao notarmos a tabela 5 podemos visualizar que o OE de C. sinensis também foi mais eficiente ao inibir a bactéria Staphylococcus aureus pelo Método de Difusão de Disco se compararmos o seu halo de 30 mm com o halo de 15 mm resultado da ação do óleo frente a Escherichia coli. Ambos os halos de inibição permitem classificar as bactérias como sensíveis pelo critério estabelecido por Moreira et al. [²³]. O ensaio de concentração inibitória mínima revelou que o OE de P. dioica inibe o crescimento microbiano de Escherichia coli a partir de 50 µg mL^-1 e de Staphylococcus aureus a partir de 10 µg mL^-1.

É importante ressaltarmos que os estudos antimicrobianos no Brasil com a espécie C. sinensis são relativamente novos, destacando a importância do estudo para obtenção de um produto natural com potencial biológico obtido de uma parte comumente descartada de um fruto de alto consumo local tanto para o estado quanto para o país.

Desta forma, os resultados obtidos foram comparados aos dos autores Eldahshan e Halim [²⁵] que extraíram o OE das folhas de C. sinensis coletadas no Egito realizando uma hidrodestilação por 5 h. Os autores obtiveram um halo de 20,1 mm para a ação do OE frente a S. aureus e um resultado semelhante de 16,2 mm frente a E. coli, visto que neste estudo obtivemos um halo de 15 mm empregando o OE obtido da casca.

Eldahshan e Halim [²⁵] ainda enfatizam que esse óleo teve essa atividade pela presença dos compostos oxigenados em sua composição. Os autores realçam o potencial do OE para ser utilizado como aditivos antibacterianos em alimentos e em produtos cosméticos em a fim de reduzir a dependência de produtos químicos sintéticos preservação de alimentos [²⁵]. Por fim, destaca-se novamente o potencial biológico de ambas as espécies estudadas neste trabalho como extremamente eficientes no controle de microrganismos patogênicos, representados pela Escherichia coli como Gram-negativa e Staphylococcus aureus como Gram-positiva.

Através dos resultados obtidos nos estudos químicos, na avaliação da toxicidade e antimicrobiana dos OE de P. dioica e C. sinensis, conclui-se que os OE avaliados são compostos por substâncias que propiciam e incentivam sua aplicação em virtude de seus potenciais para atividade biológica antimicrobiana.