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INTRODUCCIÓN
Perú es uno de los 12 países con la mayor diversidad biológica, con aproximadamente 10 % de flora mundial, estimada en 25 000 especies, 30 de ellas son endémicas [1]. Existe un interés creciente en compuestos bioactivos y las propiedades antioxidantes de sustancias de fuentes naturales que potencialmente pueden ser utilizadas en las industrias alimentarias. Se sabe que los aceites esenciales de plantas aromáticas y medicinales poseen actividad biológica [2,3]. Los aceites esenciales son productos vegetales naturales que contienen una mezcla compleja por tanto tienen múltiples propiedades antimicrobianas [4]. Siendo los constituyentes de los grupos de materias primas más importantes para la industria alimentaria, farmacéutica, de perfumería y afines [5]. La mayoría de estos compuestos se derivan de terpenoides oxigenados, particularmente terpenos fenólicos, fenilpropanoides y alcoholes [6,7]. Las especies de Tagetes se utilizaron originalmente como fuente de aceites esenciales que eran extraídas de hojas, tallos y flores, aplicándose como aromatizantes en la industria alimentaria, además sus pigmentos tienen potencial como colorante alimentario natural.
Tagetes es un género importante perteneciente a la familia Asteraceae [8], aromático, originario de Centro y Sudamérica con una distribución cosmopolita debido a actividades antrópicas [9]. Tagetes minuta L. es una planta aromática con amplio espectro de actividad biológica que posee propiedades medicinales, antioxidantes y antimicrobianas [10]. La gran importancia de Tagetes se debe a la presencia de aceite esencial en casi todas las partes de sus plantas, excepto en el tallo [11]. Además, presenta actividades biológicas como actividades antibacterianas, antifúngicas, antivirales, antioxidantes, anticancerosas, acaricidas, nematicidas, insecticidas y alelopáticas [12]. El creciente interés en las industrias de la alimentación, el sabor, la perfumería contribuye a la investigación de las condiciones ambientales afectan su composición cualitativa y rendimiento [13].
Tagetes minuta L. es conocido con el nombre común de huacatay en Perú, en México se le conoce como caléndula mexicana. Es una especie que acumula una larga historia mundial de usos tales como alimentos, terapéuticos y aromaterapia que son inherentes a los químicos tagetonas y ocimenonas (E y Z) único de la planta su composición y bioactividades. De acuerdo con la revisión de antecedentes investigativos, acerca de metabolitos bioactivos y actividad antioxidantes de las especies aromáticas Tagetes minuta L. y Tagetes elliptica Sm., no se reportan publicaciones en nuestro país, sin embargo, existen informes sobre aceites esenciales de estas especies en otros países.
A pesar de su importancia como especies alimentarias, las investigaciones en especies Tagetes minuta L. y Tagetes elliptica Sm. relacionadas con su composición química, diversidad genética y propiedades biológicas son limitadas. Por lo tanto, el objetivo fue determinar las propiedades físicas e identificar los metabolitos bioactivos y actividad antioxidante de los aceites esenciales de ambas especies del género Tagetes que crecen en forma silvestre y están adaptadas a ecosistemas de moderada altitud de la región andina del Perú.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materia vegetal e identificación botánica
Se utilizaron las hojas de Tagetes minuta L. y Tagetes elliptica Sm. recolectadas de la zona alto andina del distrito de José María Arguedas (13°42 S.73°24 O a una altitud de 2935 m s.n.m.) perteneciente a la provincia de Andahuaylas, región Apurímac. Con clima Cwd de acuerdo con Koppens, con precipitaciones media anual alrededor de 1000 mm/año, humedad relativa media de 50 %y temperatura de -5 °C a 21 °C, con moderada incidencia de heladas. Las hojas de Tagetes minuta L. y Tagetes elliptica Sm. fueron recolectadas durante los meses de febrero a marzo del 2019. Las plantas fueron identificadas, autentificadas y depositadas en el laboratorio de botánica del pabellón de Ciencias Básicas de la Universidad Nacional José María Arguedas.
Extracción de aceites esenciales
Para la extracción de los aceites esenciales se seleccionaron las hojas frescas de Tagetes minuta L. y Tagetes elliptica Sm.; se utilizaron 2,5 kilogramos de hojas frescas de cada especie y se sometieron a extracción mediante destilación por arrastre a vapor de agua a una presión de 10 PSI. Una vez destilado los aceites esenciales se separaron por diferencia de densidades utilizando un decantador florentino graduado. Luego se secaron sobre sulfato de sodio anhidro y se almacenaron a 4 °C hasta el momento de realizar análisis, los rendimientos de extracción se evaluaron según la ecuación 1.
Determinación de propiedades físicas del aceite esencial
En los aceites esenciales obtenidos de cada especie se determinaron: la densidad relativa a 20 °C de acuerdo con la norma técnica peruana: NTP 3129.081:1974; índice de refracción en refractómetro ABBE; rotación óptica en polarímetro y solubilidad en etanol. Para este último se empleó una solución al 70 % tomando 100 μL de aceite esencial.
Determinación de compuestos químicos mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS)
El análisis de la composición química de los aceites esenciales fue identificado mediante Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) en el centro de investigación de productos naturales de la Universidad Peruano Cayetano Heredia.
Para el análisis de cada muestra se utilizó 20 μL de aceite esencial en 980 μL de diclorometano, que se inyecto al cromatógrafo de gases acoplado a un detector selectivo de masas. Se separaron los compuestos en una mezcla mediante una columna capilar apolar DB-5MS (60 m x250 μm x 0,25 μm) (J y W Scientific de 5 % fenil-polimetilsiloxano).
La temperatura del inyector se mantuvo a 250 °C con una inyección en modo Split (50:1), la programación de temperatura del horno fue: temperatura inicial 50 °C, mantenida por 5 min; posteriormente incrementándose a 10 °C/min hasta alcanzar 100 °C y finalmente a 10 °C/min hasta 270 °C, manteniéndose temperatura final por 1 min. El tiempo de corrida fue de 77,8 min, se utilizó helio como gas de arrastre a un flujo constante de 1mL/min. Los compuestos de los aceites de Tagetes minuta L. y Tagetes elliptica Sm. fueron identificados utilizando el software proporcionado por Agilent; MSD chemstation (versoon EO2.00.493), Por comparación de los espectros de masas de cada pico con los de la librería de espectros de masas de las bases de datos de flavor y del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST, 08).
Evaluación de la actividad antioxidante de los aceites esenciales
Para la determinación de la actividad antioxidante de los aceites esenciales de las especies del género Tagetes se emplearon dos metodologías:
Método del radical DPPH
Se prepararon diluciones en etanol acuoso de extractos hidroalcohólicos hasta obtener concentraciones de 0,0 a 150, 0 μg/mL. Se combinaron 1,0 mL de cada dilución con 0,5 mL de una solución de 0,3 mM de DPPH en etanol dejándose reaccionar a temperatura ambiente por 30 min, posteriormente se llevó a medir la absorbancia de las mezclas a 517 nm en el equipo de espectrofotometría. El porcentaje de actividad antioxidante de cada muestra se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación 2:
AM: es la absorbancia de la muestra +DPPH, AB: es la absorbancia del blanco (muestra +etanol) y AC: es la absorbancia del blanco del reactivo (DPPH+etanol)
La concentración del extracto hidroalcohólico se neutralizó al 50 por ciento de los radicales de DPPH (EC 50, concentración efectiva media) y se obtuvo directamente al graficar la recta entre el porcentaje de actividad antioxidante, frente a la concentración de la muestra de los aceites esenciales mg/mL.
Método del radical BTS *+
La actividad captadora de radical libre ABTS+ se determinó a través del método desarrollado por Re et al., con algunas modificaciones.
3,5 mM de ABTS reaccionaron con 1,25 mM de persulfato de potasio. Las muestras se incubaron a temperaturas de 2-8 °C durante 16-24 h. en oscuridad. El radical BTS*+ formado se diluyó con etanol hasta obtener una absorbancia de 0,7+menos 0,05 a 734 nm. A un volumen de 190 μL de dilución del radical BTS*+ se agregó 10 μL de la muestra de AE y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Pasado el tiempo se determinó mediante el equipo espectrofotómetro a 734 nm en el lector de microplacas Themoscientific. Para el control positivo de captación de los radicales BTS*+ se utilizó ácido ascórbico (4 μg/mL).
Análisis estadístico
Los análisis fueron realizados por triplicado, para la evaluación estadística se utilizó el diseño completamente al azar (DCA); el análisis de varianza se trabajó con 0,05 de significancia; al encontrar diferencia significativa se procedió a realizar la prueba de comparaciones de medias de Fisher (LSD) a un nivel de α=0,05. Los datos fueron procesados con la ayuda de los programas estadísticos Centurión XVII y la hoja de cálculo Microsoft Excel 2016.
RESULTADOS
Rendimiento y propiedades físicas de los aceites esenciales
La determinación de las propiedades fisicoquímicas nos permite conocer la calidad y el control de pureza en los aceites esenciales.
De acuerdo con la tabla 1 se muestra el porcentaje de rendimiento de extracción y las propiedades físicas de aceites esenciales de ambas especies del género Tagetes.
Tabla 1 Rendimiento y propiedades físicas de los aceites esenciales de Tagetes minuta L. y Tagetes elliptica Sm.
| Análisis | Tagetes minuta L. | Tagetes elliptica Sm. |
|---|---|---|
| Rendimiento | 0,05± 0,002a | 0,048± 0,001a |
| Densidad(g/ml) a 24 °C | 0,900 ±0,0004a | 0,882± 0,0043b |
| Índice de refracción a 24 °C | 1,493± 0,05a | 1,482± 0,04a |
| Solubilidad EtOH 70 % (v/v) | Positiva | Positiva |
| Gravedad específica a 20 °C | 0,872a ± 0,01 | 0,945± 0,034b |
Valores con diferentes letras (a, b) dentro de cada columna denotan significancia en la prueba de Tukey, con α=5%
Composición química de los aceites esenciales de dos especies del género Tagetes
Los componentes mayoritarios de los aceites esenciales de ambas especies del género Tagetes se muestra en la tabla 2.
Tabla 2 Componentes mayoritarios detectados en los aceites esenciales de Tagetes minuta L y Tagetes elliptica Sm.
| Compuesto | Porcentaje de abundancia relativa (TR %) | |
|---|---|---|
| Tagetes minuta L. | Tagetes elliptica Sm. | |
| β-trans-Ocimeno | 21,07 (25,03) | 16,5 (11,45) |
| β-Mirceno | NP | 15,01 (2,78) |
| β-Linalol | NP | 18,56 (1,18) |
| Cis-Tagetona | 25,6 (3,5) | 20 (16, 27) |
| m-tert-butil-fenol | NP | 22,6 (1,44) |
| Trans-Tagetona | 25,94 (51,37) | 20,22 (10,25) |
| β-Cariofileno | 36,39 (0,48) | 28,21 (1,17) |
| Guaiol | 41,96 (1,25) | NP |
| Apiol | 42,45 (3,28) | 33,41 (0,43) |
| α-Bisabolol | 44,29 (1,1) | NP |
Tiempo de retención (TR) y abundancia relativa (%) de los aceites esenciales, no presento (NP).
En el análisis de la composición química se detectaron y cuantificaron un total 26 compuestos químicos en el aceite esencial de Tagetes elliptica Sm con fracción principal en monoterpenos en (61,00 %) y 16 compuestos químicos para el aceite esencial de Tagetes minuta L. encontrándose como fracción principal a los monoterpenos (50,0 %), entre ambas especies se obtuvo una desviación estándar por debajo del 5 % entre los porcentajes de cada analito en ambas columnas utilizadas. Se identificaron como metabolitos bioactivos en los aceites esenciales en las especies del género Tagetes al β-trans-Ocimeno, Trans-Tagetona, Cis-Tagetona, β-Mirceno y β-Cariofileno.
Actividad antioxidante de AE de Tagetes minuta L. y Tagetes elliptica Sm
En la tabla 3. Se muestra los resultados de actividad antioxidante en los aceites esenciales de ambas especies del género Tagetes, mediante los métodos de DPPH y ABTS.
Tabla 3 Actividad antioxidante mediante métodos DPPH y ABTS.
| Métodos | ||
|---|---|---|
| Aceite esencial | DPPH IC50 (mg/mL) | ABTS IC50 (mg/mL) |
| Tagetes minuta L. | 1,77±0,02 | 21,02±0,14 |
| Tagetes elliptica Sm. | 2,56±0,12 | 41,06±0,23 |
Se encontró diferencias significativas en la actividad antioxidante de ambas muestras de Tagetes como se muestra en la tabla 3. De acuerdo con la metodología de DPPH el IC50 vario de 1,77 mg/mL a 2,56 mg/mL, sin embargo, el IC50 de BTS*+ varió de 21,02 a 41,06 mg/mL, se encontró una actividad antioxidante más alta: IC 50 41,06 mg/mL. El aceite esencial de Tagetes minuta presento una IC50 más bajo 1,77 mg/mL, respectivamente exhibió una considerable actividad de eliminación de radicales DPPH en comparación con el método de BTS*+.
DISCUSIÓN
Los aceites esenciales de Tagetes minuta L. y Tagetes elliptica Sm. no presentaron diferencias significativas en el porcentaje de rendimiento. El rendimiento del aceite esencial depende de la planta y el distrito donde se cultiva [14]. De acuerdo con los resultados de propiedades físicas del aceite esencial, la densidad presento una variación para ambas especies del género Tagetes, sin embargo, el índice de refracción no presentó una variación entre ambas especies. La presencia de un valor menor del índice de refracción y densidad está relacionada con la cantidad de fenoles [15].
El índice de refracción de ambas especies presentó valores elevados, que indican presencia de compuestos de alto peso molecular tales como sesquiterpenos y diterpenos y eventualmente oleorresinas en concentraciones altas [16], así mismo, el aceite esencial es de mayor calidad y pureza [17].
De acuerdo con los resultados de gravedad específica de los aceites esenciales de ambas especies se encontró diferencias significativas con presencia a mayor calidad (0,945± 0,034) en el aceite esencial de Tagetes elliptica Sm. se encontraron valores similares a los reportados en otros estudios [18].
El análisis de los componentes químicos en los aceites esenciales de las especies Tagetes minuta L. y Tagetes elliptica Sm. mostraron mayormente la presencia de los siguientes compuestos: Trans-Tagetona, β-trans-Ocimeno, Cis-Tagetona, β-Cariofileno y Apiol.
Los aceites esenciales de la especie Tagetes spp. son ricos en hidrucarburos monoterpe-nicos (Ocimenos, limoneno, terpineno, mirceno y cetonas monoterpenicas aciclicas (tagetona, dihidrotagetona, y tagetenona) que son los odorates primarios además de cantidades menores de hidrocarburos sesquiterpenicos compuestos oxigenados [19].
De acuerdo con los resultados del estudio en especies de Tagetes patula se encontró una fuerte bioactividad en sus aceites esenciales contra los organismos patógenos de ensayo, lo cual se atribuye a la presencia de terpinoleno, E-cariofeno, Z-tagetona, E- tagetona, óxido de cariofeno, germacreno D.
En cuanto a sus bioactividades de la familia de especies del género Tagetes se encontró una actividad antibacteriana de fuerte a leve contra cepas de bacterias gran-positivas y gran-negativas probadas en el estudio [4].
En cuanto a las aplicaciones del aceite esencial, se encontró que los metabolitos sintetizados por las plantas del género Tagetes muestran efectos significativos como antioxidantes, inhibidores de enzimas, precursores de sustancias toxicas y pigmentos. Se cree que la actividad de los metabolitos secundarios en las especies del género Tagetes está relacionado con su composición, concentración y condiciones ambientales que afectan su contenido.
Los aceites esenciales obtenidos de las diferentes partes de la planta pueden mostrar diferentes capacidades biológicas y por lo tanto pueden usarse en una variedad de industrias incluida la cosmética, farmacéutica o la producción de alimentos [20].
De acuerdo con Gakuubi [21] se reportó actividad antimicrobiana de los aceites esenciales de Tagetes minuta L. contra bacterias fitopatógenas, Pseudomonas savastanoi pv, Phaseoli axonopodis pv que son responsables de las diferentes enfermedades de las plantas como antracnosis, tizón y Ralstonia solanacearum.
Los resultados indicaron que Tagetes spp. desempeña un papel importante en la preparación y conservación de alimentos, así como para su uso como una excelente especie para alimentos. Incluso desde un punto de vista tradicional, la naturaleza de Tagetes spp. y su composición afecta la cantidad y calidad de los extractos [22]. A pesar de los prometedores resultados obtenidos in vitro, estudios más detallados de los mecanismos de acción de los extractos y aceites esenciales de Tagetes spp. serían beneficiosos para alcanzar su potencial en biotecnología. Se documentó que los componentes de aceites esenciales, especialmente los terpenoides como los dihidrotagetonos, tagetonas y ocimenonas, son suficientes para explicar la actividad antimicrobiana observada [23]. La diferencia en la actividad antioxidante entre ambas muestras podría atribuirse a la presencia de los monoterpenos en sus compuestos polifenólicos, los monoterpenos oxigenados conducen a actividades antioxidantes, antibacterianas y antifúngicas más altas [24-26].
CONCLUSIONES
En el estudio se logró determinar los metabolitos bioactivos de los aceites esenciales de las especies de Tagetes minuta L. y Tagetes elliptica Sm., se encontraron los metabolitos bioactivos: β-trans-Ocimeno, Trans-Tagetona, Cis-Tagetona, β-Mirceno y β-Cario-fileno. Los monoterpenicas acíclicas son, con efectos significativos como antioxidantes, inhibidores de enzimas, precursores de sustancias tóxicas y pigmentos beneficiosos para alcanzar su potencial en biotecnología. La abundancia en monoterpenos conducen a actividades antioxidantes, en el estudio se encontró mayor presencia de antioxidantes en la especie de Tagetes elliptica L. Las propiedades físicas de ambas especies del género Tagetes estaban en los rangos de calidad para aceites esenciales.
