Recolección de la muestra

Las hojas de Justicia secunda Vahl fueron recolectadas en el Jardín de Plantas Medicinales de la Facultad de Farmacia y Bioanálisis, ubicado en el municipio Libertador del estado Mérida, a una altitud de 1630 m s.n.m. La planta fue identificada botánicamente por el Ing. Juan Carmona, adscrito al Departamento de Farmacognosia y Medicamentos Orgánicos, de la Facultad de Farmacia y Bioanálisis (ULA). Se depositó una muestra en el herbario Dr. Luis Enrique Ruiz Terán (MERF), de la Facultad de Farmacia y Bioanálisis (ULA), Mérida, identificado como voucher, número 04 (25/09/2017).

Obtención de los extractos de las hojas de J. secunda Vahl

Se utilizaron hojas y tallos de la planta, se cortaron en trozos pequeños, se secaron en una estufa a 40 °C durante 48 h, se procedió a moler y pesar en una balanza Den-ver Instrument XL 3100, se obtuvieron 82,5 g. Se preparó el extracto hexanoico, por maceración a temperatura ambiente, para tal fin, se colocó el material vegetal en 200 mL de hexano (Merck) y se dejó macerar por 48 h, se procedió a filtrar y concentrar el extracto hasta sequedad empleando el rotaevaporador IKA RV 10 digital a 45 °C. Este procedimiento se repitió dos veces más. De la misma forma, se obtuvieron los extractos diclorometanoico (diclorometano Merck) y etanólico de la planta (etanol Merck). Se recuperaron 600 mg (extracto hexanoico), 1030 mg (diclorometanoico) y 1150 mg (etanólico).

Estudio fitoquímico preliminar

Para la caracterización química de los metabolitos secundarios presentes en los extractos hexanoico, diclorometanoico y etanólico, de las hojas y tallos de J. secunda Vahl., se efectuó una serie de pruebas químicas cualitativas siguiendo la metodología descrita [¹⁴].

Actividad antioxidante método DPPH•

Todos los reactivos químicos utilizados, incluyendo los disolventes fueron de grado analítico. El reactivo DPPH• (2,2- difenil-1-picrilhidrazilo) es de Sigma-Aldrich, el ácido ascórbico y metanol se obtuvieron de Merck. Se utilizó un espectrofotómetro UV-Visible Spectronic GeneSystm 10 Bio, para evaluar el comportamiento de los extractos como agentes antioxidantes.

La evaluación de la capacidad antioxidante de los extractos hexanoico, diclorometanoico y etanólico de las hojas deJ. secunda Vahl, se realizaron siguiendo el ensayo del test de actividad secuestrante de radicales libres del 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH•), según la metodología descrita [¹⁵-¹⁹].

Esta técnica consistió en preparar una solución madre de cada uno de los extractos, tomando 4 mg de cada uno, en tubos eppendorf y se disolvieron en 1 mL de metanol, el ensayo se realizó por triplicado para cada uno de los extractos, para tal fin, se prepararon 3 tubos de cada uno, que contenían 700 μL de DPPH» (6 x 10-² mM) y 300 μL del extracto, se dejó en reposo en la oscuridad por 30 min, después se procedió a medir la absorbancia en el espectrofotómetro a 517 nm, con cada uno de los extractos que presentaron un porcentaje de inhibición (% I) del radical DPPH• igual o superior a 50 a 4 mg/mL, se preparó una solución madre de concentración de 1 mg/mL y a partir de la misma se prepararon varias diluciones (0,75; 0,5; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025 mg/mL) y se procedió a determinar la actividad antioxidante. Se realizó una curva patrón con ácido ascórbico, partiendo de una solución madre con una concentración de 1 mM (17,6 mg en 100 mL de metanol). El porcentaje de inhibición (% I) de radicales libres de DPPH• se calculó mediante la siguiente ecuación:

En función de la concentración del analito se calculó por regresión lineal para cada muestra la concentración inhibitoria 50 (IC₅₀). Por razones de claridad, los resultados fueron expresados en términos de 1/IC₅₀ o poder antiradicalario (ARP), es decir, a mayor valor de ARP, mayor será la eficiencia del extracto como antioxidante [¹⁵, ¹⁶, ¹⁹].

Estudio estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron con el programa IBM SPPS Statistict editor de datos, versión 21 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Para determinar diferencias estadísticas en cada uno de los analitos evaluados con la actividad antioxidante por el método de DPPH• se realizó un análisis varianza (Anova) de una sola vía, como valores de media (n=3) y desviación estándar (SD).

Toxicidad en Artemia salina

La evaluación de toxicidad sobre nauplios (larvas) de A. salina del extracto etanólico de las partes áreas de Justicia secunda Vahl se realizó en el Departamento de Ciencias de los Alimentos de la Facultad de Farmacia y Bioanálisis, este método estándar se basa en la determinación de la dosis letal 50 (DL₅₀), es decir, concentración que causa la muerte al 50 % de una población de nauplios, en 24 h.

Reactivos

Los reactivos utilizados para evaluar la toxicidad del extracto etanólico frente a A. salina, de marca Sigma-Aldrich y Merck fueron: cloruro de sodio (NaCl), sulfato de magnesio hexahidratado (MgSO₄.6H₂O), cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl.6H₂O), cloruro de potasio (KCl), bicarbonato de sodio (NaHCO₃), carbonato de sodio (Na₂CO₃), cloruro de calcio (CaCl₂) y dodecil sulfato de sodio, levadura comercial y quistes del crustáceo A. salina (Brine Shrimp Egg. Artemia cysts O.S.I. Pro 100. Ocean Star International. INC. Snowville. UT 84336. EE.UU.). En el desarrollo del bioensayo, primero se preparó una solución marina de aproximadamente 1000 mL (agua de mar artificial), que proporcionó las condiciones necesarias para el desarrollo de los nauplios de Artemia. Esta solución se mantuvo en aireación constante (burbujeo) 72 h previas al bioensayo, con la finalidad de oxigenar la misma [²⁰].

Eclosión de los quistes

Al finalizar el tiempo de aireación de la solución marina (72 h) se dividió la solución en dos recipientes (fiolas) con 500 mL aproximadamente en cada una, en una se añadió alrededor de 250 mg de quistes, manteniendo una temperatura constante de 28 ± 2 °C por 48 h. La solución marina libre de nauplios, se utilizó como disolvente para preparar las diferentes diluciones del extracto etanólico y llenado de las placas [²⁰].

Desarrollo de la prueba

Primero, se colocaron 130 μL de solución salina (aireada) en cada pozo de una placa de microtitulación, posteriormente, se agregaron a cada pozo 10 μL de solución que contenían entre 10 y 15 nauplios de A. salina, luego se le adicionó 10μL de una solución de levadura comercial marca Fleischmann (5 mg/mL) a cada pozo y se incubaron las placas en un área con iluminación permanente por 24 h para excitar su actividad metabólica. Finalmente, se colocaron 50 μL del extracto etanólico, a distintas concentraciones (5, 25, 250, 750, 1250 y 2500 ppm). El extracto se diluyó en solución salina: DMSO (9:1). Se incluyó, además, un grupo control negativo (con todos los elementos del ensayo, excepto la muestra a ensayar) y un grupo control positivo (Dodecil sulfato de sodio, DDSS 10 %) con 6 réplicas para cada grupo. Se registraron el número de nauplios presentes inicialmente en cada pozo (NV), y al cabo de 24 h de contacto con los extractos se realizó el conteo del número de nauplios muertos (NM). Se calculó el porcentaje de letalidad mediante la ecuación: porcentaje de letalidad = (NM/NV) x 100 [²¹]. Se determinó la dosis letal 50 (DL₅₀) con un intervalo de confianza del 95 %, se usó el método de análisis Probit y el programa estadístico SPSS, 21.0 para Windows. Se clasificaron la DL₅₀ de los extractos evaluados según la toxicidad, tomando como referencia las recomendaciones el Programa Iberoamericano de Ciencias y Tecnología para el desarrollo (Cyted) [²¹].

Estudio fitoquímico de los extractos de la hojas de J. secunda Vahl.

El estudio fitoquímico preliminar se realizó mediante pruebas químicas y arrojó la presencia de esteroles en el extracto hexanoico; esteroles y compuestos fenólicos en el extracto diclorometanoico; alcaloides, esteroles y compuestos fenólicos en el extracto etanólico (tabla 1).

Tabla 1 Resultados del estudio fitoquímico de los extractos hexanoico, diclorometanoico y etanólico, de las hojas de J. secunda Vahl. 

+++ Muy abundante, ++ abundante, + presente en poca concentración. EH: extracto hexanoico, ED: extracto diclorometanoico, EE: extracto etanólico.

Los resultados obtenidos en la composición fitoquímica (tabla 1) son similares a los reportados por algunos investigadores [⁵, ⁹, ¹⁰, ¹¹], sin embargo, difieren en varios compuestos reportados: taninos, quinonas, saponinas y flavonoides, que están ausentes en el presente estudio, esto podría deberse a las diferencias en los sitios de recolección del material vegetal, donde probablemente existen características ambientales como: luz, temperatura y precipitaciones, diferentes a las de Venezuela, que pueden influir en la producción de los metabolitos secundarios de la planta [²²].

La luz es posiblemente el factor más significativo, ya que favorece el crecimiento de los tejidos jóvenes, etapa en la cual ocurre la acumulación de los principios activos. La temperatura también juega un papel importante en la producción de metabolitos secundarios e influye en el crecimiento acelerado y en el equilibrio entre el proceso de fotosíntesis y respiración, por consiguiente, en la producción de los principios activos, con relación a las precipitaciones, esta juega un rol fundamental al modificar los efectos ecológicos de otros factores, por ejemplo, la regulación de las temperaturas [²²].

Por otra parte, la disponibilidad de agua contribuye a la producción de taninos condensados; ya que, al encontrarse en periodo de escasez de agua, las plantas cierran sus estomas y restringen el proceso de fotosíntesis, de este modo se esperaría una relación negativa entre el estrés hídrico y la producción de compuestos fenólicos [²³].

Valares [²⁴] afirmó que las características de la planta, como el contenido de agua, proteínas y metabolitos secundarios generalmente cambian, dependiendo de las condiciones de crecimiento y estado de desarrollo de un órgano. Las hojas jóvenes secretan mayor cantidad de flavonoides y diterpenos que los tallos y estos a su vez más que las hojas maduras. Por tanto, la edad de la planta es otro aspecto que pudo haber influido en que algunos metabolitos no hayan sido aislados.

Otro aspecto inherente a la planta (que incide en el contenido de metabolitos secundarios) es la parte de la planta utilizada. Se ha demostrado que las diferentes partes de la planta presentan distintas productividades de metabolitos secundarios, además de que se acumulan cantidades de metabolitos diferentes dependiendo de la parte de la misma a la cual corresponde tal acumulación [²³]. También, la altura de la planta puede afectar la producción y acumulación de compuestos fenólicos y flavonoides [²⁵].

Actividad antioxidante de los extractos de las hojas de J. secunda Vahl

Los resultados de la evaluación de la actividad antioxidante realizada con el método de la capacidad secuestrante de radicales libres sobre el reactivo 2,2-difenil-1-picrilhidra-zilo (DPPH•) de los extractos diclorometanóico y etanólico, obtenidos de las hojas de la especie Justicia secunda Vahl., revelaron porcentajes de inhibición de estos radicales, superiores al 50 % a la concentración de 4 mg/mL (figura 1).

Figura 1 Porcentaje de inhibición del radical DPPH• de los extractos diclorometanóico y etanólico de las hojas de Justicia secunda Vahl a 4 mg/mL. 

Las curvas de porcentaje I vs. concentración de los extractos (figura 2) se construyeron hasta una concentración máxima de 0,75 mg/mL, como el poder captador de radicales libres de los extractos es inversamente proporcional a la IC50, es decir, a menor valor de IC50 mayor será la capacidad antioxidante del analito, para evitar confusiones, todos los resultados se expresaron como ARP (por sus siglas en inglés antirradical power) o el inverso de la IC₅₀ [¹⁵,¹⁶,¹⁹].

Figura 2 Curvas de % I vs concentración de los extractos diclorometanóico y etanólico de las hojas de Justicias secunda Vahl. 

En la tabla 2 se muestra la actividad antioxidante de los extractos de las hojas de Justicia secunda Vahl, el extracto diclorometanóico mostró 27,7 % de inhibición del radical DPPH•, con un IC₅₀ de 1,85 mg/mL y ARP 0,54 mL/mg y el extracto etanólico, 53,0 % de inhibición del radical DPPH•, un IC₅₀ de 0,69 mg/mL y ARP 1,45 mL/mg, comparado con el ácido ascórbico con porcentaje I de 96,1; IC₅₀ de 0,047 mg/mL y ARP 21,27 mL/mg (tabla 2).

Tabla 2 Actividad antioxidante de los extractos de las hojas de Justicia secunda Vahl. 

Existen diferencias estadísticamente significativas entre datos (p < 0,05) con un nivel de confianza de 95,0 %.

Se pudo observar y comprobar la capacidad antioxidante del extracto etanólico, el porcentaje de inhibición fue de 53.0 ± 0.1 % a su máxima concentración de dilución (0,75 mg/mL), además, se corroboró que la capacidad antioxidante del extracto diclorometanóico fue de 27,7 ± 0,3 % a 0,75 mg/mL, en comparación de 96,1 % (176 μg/mL) del ácido ascórbico utilizado como control positivo (tabla 2).

De acuerdo con los resultados obtenidos se puede inferir que el extracto etanólico de las hojas de Justicia secunda Vahl presentó la mayor actividad antioxidante de los dos extractos, con un porcentaje de inhibición por encima del 50 %. Los resultados de este estudio coinciden con los reportados por Onoja et al. [²⁶], quienes mostraron que los extractos de Justicia secunda Vahl tienen alto potencial antioxidante.

Dentro de estos parámetros de actividad antioxidante, se podría decir que la capacidad de secuestrar radicales libres de los extractos se debe a la presencia de componentes fenólicos en los mismos [²⁷, ²⁸], varios investigadores relacionan la capacidad antioxidante con el contenido de compuestos fenólicos ya que cada componente puede contribuir de forma y proporción diferente. Además, es necesario considerar que dicha correlación no solo depende de la concentración y la calidad antioxidante, sino también de su interacción con otros componentes y la metodología aplicada.

Según el estudio realizado por Echavarria et al. [²⁹], las especies vegetales que presentan valores de IC50 similares entre sí tienen una capacidad análoga de capturar el radical DPPH•, además esta capacidad corresponde a una mayor concentración de fenoles totales. Es decir, los extractos con mayor contenido fenólico son los de mayor actividad inhibidora del radical DPPH•.

Del mismo modo, otros estudios confirmaron que existe una relación inversamente proporcional entre la IC₅₀ y la actividad antioxidante, a menor valor del IC₅₀ mayor actividad antiradical. Mediante las pruebas químicas de caracterización se detectó la presencia de flavonoides, taninos, triterpenos, alcaloides y saponinas en plantas con IC50 bajo y en algunas especies también se han reportado, polifenoles, glucósidos cianogénicos, lactonas, cumarinas, esteroles y antraquinonas [³⁰].

Todas estas afirmaciones se pudieron confirmar en este estudio, ya que el extracto etanólico, que presentó mayor concentración de compuestos fenólicos fue el que mostró mayor actividad antioxidante y un IC₅₀ de 0,69 ± 0,01 mg/mL (tabla 2).

Toxicidad del extracto etanólico de las hojas de J. secunda Vahl sobre Artemia salina

En la tabla 3 se muestran los resultados del bioensayo de letalidad en Artemia salina, aplicado solamente al extracto etanólico de las hojas de J. secunda Vahl y los controles. En la figura 3 se exponen los porcentajes de letalidad del extracto etanólico de J. secunda Vahl sobre A. salina.

Tabla 3 Cuantificación de DL50 del extracto etanólico de las hojas de Justicia secunda Vahl y los controles sobre Artemia salina. 

DL50: dosis letal 50; signo (-) valores muy altos; DMSO: dimetilsulfóxido; DDSS: dodecil sulfato de sodio.

Figura 3 Porcentaje de letalidad del extracto etanólico de las hojas de Justicia secunda Vahl sobre Artemia salina, a las concentraciones probadas en unidades de ppm μg/mL). 

El resultado de la toxicidad del extracto etanólico de las hojas de J. secunda Vahl sobre A. salina de la presente investigación coinciden con los resultados de Cantillo et al. [³¹], quienes reportaron que los extractos metanólico, diclorometanóico y acuoso de esta especie, además, mostraron baja toxicidad, sobre A. salina.

Según, Sanabria et al. [³²], la presencia de algunos metabolitos secundarios en los extractos de las plantas se relaciona directamente con la letalidad sobre las larvas de A. salina, estos metabolitos son los taninos, las saponinas, las cumarinas y especialmente los alcaloides y las lactonas terpenicas. Los autores destacan que la letalidad sobre A. salina depende además de la concentración de dicha sustancia. Esto podría explicar la baja toxicidad mostrada por el extracto etanólico de las hojas de J. secunda Vahl, ya que, en este estudio estuvieron ausentes los metabolitos secundarios, taninos, saponinas y cumarinas (tabla 1).