Obtenção de material biológico

Os frutos do abacateiro (Persea americana) foram colhidos manualmente da mesma planta localizada na região norte do estado Rio Grande do Sul, Brasil de junho a setembro de 2019. Após a colheita os abacates ficaram armazenados em caixas de papelão ao abrigo de luz até o término da maturação da fruta em condições ambientes (~20 °C).

Após a maturação completa do fruto, as sementes de abacate foram removidas, lavadas em água corrente, embaladas em sacos de polietileno a vácuo e armazenados a -18 °C. As sementes apresentavam um teor de umidade de 52%.

Secagem das sementes de abacate

Antes de começar o processo da secagem o tamanho das sementes foi reduzido até aproximadamente 2 cm, por meio do corte dos caroços com a utilização de uma faca doméstica. A desidratação foi realizada em liofilizador (Edwards, Modulyo) em três etapas: congelamento do material fracionado até a formação dos cristais do líquido presente nas amostras, secagem primária por sublimação do gelo formado no congelamento e secagem secundária que remove o restante de água por evaporação a vácuo. A perda de umidade das amostras foi acompanhada em intervalo de tempo de 1 hora até atingir o peso constante.

Após a secagem, as sementes foram moídas em moinho de facas (micromoinho tipo Willye, MA048) para obtenção de farinha com diâmetro médio de partículas de 0,3 mm e armazenadas em sacos de polietileno ao abrigo de luz em refrigerador doméstico (Bras-temp Frost Free Duplex) a temperatura de 4 °C.

Caracterização físico-química das farinhas de semente de abacate

A farinha das sementes de abacate foi avaliada em relação a umidade, cinzas, proteína, lipídeos, fibra bruta e carboidratos de acordo com a metodologia [¹²]. Além de caracterização de minerais e cor. A análise de umidade foi determinada por secagem em estufa (Fanem®, modelo 320-SE) a 105 °C. Para avaliar teor de cinzas as amostras foram pré-carbonizadas em chapa de aquecimento e levadas ao forno mufla a 550 °C por 6 h. A determinação das proteínas foi realizada segundo método de Kjeldahl. O conteúdo de proteína foi calculado multiplicando-se o resultado obtido de nitrogênio pelo fator de 6,25. A determinação de lipídeos foi realizada por extração com solvente em extrator Soxhlet. A determinação de fibra bruta foi elaborada pela metodologia gravimétrica enzimática. O teor de carboidratos totais foi determinado pela diferença dos demais constituintes da composição físico-química. Onde o valor de carboidratos foi obtido pela subtração do valor 100 a somatória dos teores de umidade, cinzas, proteína, fibra bruta e lipídeos.

A determinação dos componentes minerais (N, K, Mg, Ca, Na, Zn, Fe, Mn, e Cu) foi feita em espectrómetro de absorção atômica (Varían* modelo espectra 55), pela metodologia do Instituto Adolfo Lutz [¹²]. A determinação da cor foi realizada em colorímetro Hunter-Lab (modelo MiniScan EZ 4500L). Os resultados foram expressos como L*: luminosidade; a*: direção da cor do verde para o vermelho e b*: direção da cor do azul para o amarelo.

Obtenção dos extratos

Os extratos foram preparados por maceração em diferentes temperaturas (4, 25 e 60 °C) usando 80 mL (3 x) de n-hexano (Merck) e 80 mL (3 x) de etanol (99,8%, Merck) na sequência a partir de 20 g de farinha de sementes de abacate desidratada. Para evitar a saturação, os solventes foram trocados cada 12 h, totalizando tempo de extração em 36 h para cada solvente. Todas as extrações foram realizadas ao abrigo de luz em agitador orbital (Shaker) à 140 rpm. Os extratos foram concentrados em evaporador rotativo (modelo 802, Fisatom) até atingir peso constante para cálculo de rendimento (equação 1).

Atividade antioxidante

A determinação da atividade antioxidante foi realizada em triplicata, pelo método espectrofotométrico avaliando a extinção da absorbância do radical 2,2-difenil-1-picril hidrazil (DPPH) em 515 nm. Para isso 500 μL da amostra, contendo concentrações crescentes de extrato etanólico (0,00015 a 0,025 mg/mL) e de extrato hexanólico (0,0015 a 1,000 mg/mL) das sementes de abacate, foram incubados por 10 min com 500 μL de solução etanólica (0,1 mM) de DPPH. A preparação da solução "controle", procedeu-se da mesma forma substituindo 500 μL da solução dos extratos por 500 μL de etanol puro. As soluções denominadas "branco" foram preparadas usando as mesmas concentrações de extratos usadas para a análise em etanol, sem a adição da solução de DPPH. O percentual de captação do radical DPPH foi calculado em termos da porcentagem de atividade antioxidante (AA%), conforme a equação 2:

A determinação da atividade antioxidante das amostras foi realizada em espectrofotômetro UV-Visível (Agilent Technologies, 8453E) em 515 nm. Após a avaliação da faixa de concentração ideal, calculou-se a concentração de extrato necessária para capturar 50% do radical livre DPPH (IC₅₀) por análise de regressão linear.

Determinação da concentração inibitòria mínima

Para os testes da concentração inibitória mínima (CIM) foram selecionados 4 micro-organismos, duas bactérias Gram-positivas, Listeria monocytogenes (ATCC 7644) e Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e duas bactérias Gram-negativas, Escherichia coli (ATCC 25922) e Salmonela choleraesuis (ATCC 10708) obtidas da American Type Culture Collection. As cepas foram crescidas previamente em meio Lúria Bertani (LB) (10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura e 5 g/L de NaCl) durante 24 h a 36 ± 1 °C em estufa bacteriológica (J. Prolab, modelo JP 101). Após esse período a suspensão bacteriana correspondia a 108 células/mL.

Os testes foram realizados em microplacas de Elisa através de microdiluições seriadas dos extratos das sementes de abacate em caldo LB para um volume final de 300 μL. Após, 10 μL de bactérias selecionadas foram inoculadas, fazendo a leitura do tempo inicial (0 h) em leitor de microplaca de Elisa (BioTek Instruments, EL 800), no comprimento de onda de 490 nm. Em seguida, as placas foram incubadas por um período de 24 h a 36 ± 1 °C em estufa bacteriológica e as leituras das microplacas foram realizadas novamente, verificando o aumento da turbidez, causada pelo crescimento microbiano após 24 h de incubação. A CIM foi definida como a menor concentração do extrato em mg/mL, capaz de inibir o crescimento microbiano.

Determinação do teor de fenóis totais

A determinação do teor de fenóis totais presente nos extratos das sementes de abacate foi realizada segundo a metodologia descrita por Singleton [¹³], por meio do método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau, sendo utilizado como padrão de referência o ácido gálico.

Para os testes, 0,5 mL das amostras de extratos nas concentrações de 1 mg/mL para os extratos hexanólicos e 0,1 mg/mL para os etanólicos foram misturadas com 2,5 mL do reagente de Folin-Ciocalteau diluído com água destilada na proporção de 1:10 v/v e 2,0 mL de carbonato de sódio 4% (m/v), agitadas em vórtexpor 1 min. e mantidas ao abrigo de luz por 2 h a temperatura ambiente. A água destilada foi usada para a solução denominada "branco".

A determinação do teor de fenóis totais foi realizada em espectrofotômetro UV-Visível (Agilent Technologies, 8453E) em 760 nm, sendo os resultados expressos como equivalentes de ácido gálico (mg EAG/g) e calculados segundo a equação (3), a partir da curva padrão, construída com diferentes concentrações de ácido gálico que variaram entre 1 e 100 μg/mL.

Onde: Abs. é a absorbância da amostra e Dfé o fator de diluição.

Análise estatística

As determinações analíticas foram realizadas em triplicata e os resultados foram avaliados estatisticamente pela análise Anova seguida do teste de T Student e Tukey com auxílio do software Statistic 5.0, ao nível de 95% de confiança.

Composição centesimal da farinha de semente de abacate

Os resultados das análises físico-químicas da farinha do caroço de abacate em relação a umidade, proteína bruta, lipídeos, cinzas, fibra bruta, carboidratos totais e cor (L*, a*, e b*) são apresentados na tabela 1.

Tabela 1 Resultados das análises físico-químicas da farinha da semente de abacate. 

L*: luminosidade; a*: direção da cor do verde para o vermelho e b*: direção da cor do azul para o amarelo.

O teor de umidade de farinha de semente de abacate foi de 4,52% atendendo o parâmetro preconizado pela RDC n° 263, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa), que estabelece um percentual máximo de umidade de até 15% para armazenamento e conservação de farinhas [¹⁴]. O teor de umidade de um pó seco por pulverização deve ser inferior a 5% para ser classificado como microbiologicamente seguro e estável durante o armazenamento (para evitar aglomeração) [¹⁵], dessa forma farinha de semente de abacate se enquadra neste quesito, sendo que a mesma foi desidratada por liofilização.

Verificou-se que na farinha de semente do abacate o constituinte que se destaca em maior quantidade é o carboidrato (83%), sendo uma excelente fonte energética. O alto conteúdo de carboidratos é uma indicação de elevado teor de amido.

Quanto ao teor de proteína, pode se considerar a farinha de sementes de abacate como fonte de aminoácidos essenciais de acordo com a FAO [¹⁶], tais como a leucina, treonina, lisina e valina. Os resultados de proteína corroboram com os encontrados por Medeiros [¹⁷] onde obtiveram 3,78% de proteína em farinha de semente de abacate (Persea americana Mill., cultivar manteiga).

Os valores de lipídeos encontrados no presente trabalho (2,20%) também são semelhantes aos encontrados na literatura de 2,48% [¹⁷] e 3,32% [¹⁸] em farinha de caroço de abacate. As fibras desempenham um importante papel na alimentação, pois auxiliam no bom funcionamento do intestino. A farinha da semente de abacate indica a presença delas, com um percentual de 4,25%. De acordo com a Portaria N.° 33 de 1998 [¹⁹] referente à informação nutricional complementar, que um alimento pode ser considerado fonte de fibra alimentar quando no produto acabado apresentar 3 g/100g (3%) de fibras. Considerando assim, a farinha da semente do abacate como um alimento rico em fibras.

Verifica-se que os teores de proteínas e lipídeos do presente estudo são menores que aos reportados na literatura em farinha de semente de abacate (Persea americana V. Hass) com rendimento de 46,3%; e teores de 6,7% de proteína; 3,4% de lipídeos e 2,7% de cinzas [²⁰]. Em farinha de semente de abacate da Ásia foram encontrados teores de 7,75% de proteína; 4,91% fibras; 0,71% lipídeos, 74,65% carboidratos; 2,83% cinzas e 14,05% umidade [²¹]. As diferenças obtidas em relação aos constituintes da farinha são devido ao tipo de variedade do fruto, a região de produção de abacate, clima, altitude, precipitação, genética e outros, fazendo com que a qualidade nutricional de cada variedade possua diferenças.

Em relação a cor, o valor L * indica uma baixa luminosidade. A cromaticidade a * indica uma cor verde e está relacionada com a quantidade de pigmentos presentes na farinha de abacate. O valor da cor b * demostra uma farinha com menor intensidade de cor amarela. Desta forma a farinha obtida é caracterizada como tons leves de marrom. Como a farinha foi obtida de sementes desidratadas a baixa temperatura isso favoreceu a preservação de cor, indicando que o produto não sofreu oxidação (escurecimento enzimático). Os estudos mostram que quando a semente é submetida a moagem a temperatura ambiente (25°C) ocorre oxidação formando uma cor laranja estável [²²]. Alissa et al. [³] obtiveram valores L *, a * e b * do pó seco por liofilização de semente de abacate (Persea Americana Mill.) de 41,05; 7,25 e 15,17, respectivamente. Esses valores foram inferiores para L* e superiores para a* e b* aos encontrados no presente estudo, pois as amostras já estavam com coloração laranjada antes da secagem.

A farinha da semente de abacate desidratada em liofilização teve um rendimento médio de 89%. Esse valor é considerado alto, uma vez que uma operação é considerada bem--sucedida quando tem pelo menos 50% de rendimento [¹⁵].

O conteúdo de minerais em base seca, da farinha de semente de abacate está apresentado na tabela 2.

Tabela 2 Resultados do conteúdo de minerais da farinha da semente de abacate. 

O elemento que apresentou maior teor (tabela 2) foi o nitrogênio (~11937 mg/100 g), o que pode ser atribuído ao fato da adubação do solo rico neste elemento, contribuindo com maior concentração desse elemento nos tecidos da planta, já que o nitrogênio é responsável pela formação dos tecidos do fruto e semente. Potássio foi o segundo macromineral com maior quantidade (1960 mg/100 g) encontrada na farinha. Este mineral desempenha um papel vital na manutenção do equilíbrio ácido-básico e na estimulação e função nervosas normais do corpo humano, em conjunto com o sódio, é fundamental para a bomba sódio-potássio. O magnésio, microelemento encontrado em maior quantidade (40,6 mg/100 g), desempenha um papel fundamental em várias reações biológicas, sendo ativador de sistemas enzimáticos que controlam o metabolismo de carboidratos, lipídeos, proteínas e eletrólitos [²³].

Os demais microelementos encontrados na farinha das sementes de abacate tais como cobre, ferro e zinco são considerados minerais essenciais pois participam de diversas reações metabólicas diretamente ou como cofatores de enzimas [¹⁸].

Dessa forma, por apresentar altos teores de proteínas, carboidratos, fibras e minerais o produto gerado a partir da farinha da semente de abacate poderia ser usado como uma excelente fonte de nutrientes ou suplementos com potencial de uso em alimentação humana e animal.

Rendimento da extração

Os resultados de rendimentos das extrações obtidos por maceração em diferentes temperaturas (4, 25 e 60 °C) usando a sequência dos solventes n-hexano e etanol estão apresentados na tabela 3.

Tabela 3 Rendimento dos extratos da farinha da semente de abacate usando os solventes n-hexano e etanol com diferentes temperaturas de extração. 

Média ± desvio padrão. Letras minúsculas diferentes na mesma coluna e letras maiúsculas diferentes na mesma linha correspondem a diferença estatística ao nível de 5% pelo teste de Tukey e t student, respectivamente.

Como pode ser observado (tabela 3) os extratos hexanóicos apresentaram maior rendimento nas temperaturas mais baixas (4 °C e 25 °C), já o rendimento do extrato eta-noico foi maior a temperatura mais elevada. Esse fato pode ser explicado pelo fato que a extração a 60 °C foi realizada em sistema aberto, usando condensador de bolas e em virtude de alta volatilidade do hexano, uma parte do extrato acabou sendo volatilizada, o que não aconteceu com extrato etanoico mais polar, tendo rendimentos 8,2% e 18,4% respectivamente. O maior rendimento total obtido a 60 °C, se deve ao aumento da solubilidade do soluto no solvente, aumentando a taxa de difusão e promovendo um aumento na taxa de transferência de massa.

Verifica-se também que as extrações a 4 e 25 °C com ambos solventes não apresentaram diferenças significativas (p>0,05), contudo as mesmas diferiram da extração a temperatura mais elevada (60 °C) (p<0,05).

Teor de fenóis totais

A tabela 4 apresenta os resultados referentes ao teor de compostos fenólicos totais encontrados nos extratos preparados a partir de semente de abacate com hexano e eta-nol à 4 °C, 25 °C e 60 °C.

Tabela 4 Teor de fenóis totais de extrato usando os solventes n-hexano e etanol para a farinha de semente de abacate. 

Média ± desvio padrão. Letras minúsculas diferentes na mesma coluna e letras maiúsculas diferentes na mesma linha correspondem a diferença estatística ao nível de 5% pelo teste de Tukey e t student, respectivamente.

*Estes resultados foram estimados pela extrapolação da curva padrão de ácido gálico para a determinação do teor de compostos fenólicos.

Devido à alta polaridade dos polifenóis e seus derivados, os extratos etanoicos apresentaram alto teor de fenóis totais quando comparados com extratos hexanóicos, a maior concentração foi encontrada em extratos obtidos a 60 °C, para os dois solventes testados com valor total 925 mg EAG/g (tabela 4). O conteúdo de fenóis totais encontrado no presente estudo foi três vezes superior ao encontrado por Pahua-Ramos et al. [²⁴] e 18 vezes maior ao encontrado por Wang et al. [²⁵]. O local da coleta, época do ano e a variedade da fruta podem influenciar no teor de compostos bioativos. Além disso em pesquisa realizada por Pahua-Ramos et al. [²⁴] foram usadas as sementes de abacate secas em estufa à 40 °C por 48 h, já no presente trabalho a desidratação das sementes foi realizada por liofilização. De acordo com Chan et al. [²⁶] as temperaturas da secagem e da extração podem influenciar diretamente na concentração de compostos fenólicos totais. Por outro lado, até um certo ponto, o aumento da temperatura da extração favorece a liberação de metabólitos secundários graças a danificação das paredes celulares que levam ao aumento da permeabilidade da membrana celular além de aumentar a transferência de massa, da solubilidade e da difusão do soluto e solvente [²⁷].

A literatura traz informações sobre altos teores de ácido protocatéquico, caempferida, ácido vanílico, ácido clorogênico, ácido seringico e rutina, considerados excelentes agentes antioxidantes além de apresentar atividade hipocolesterolémica [²⁴]. Assim, as suas propriedades como os compostos fenólicos e seus derivados são tem alto potencial e já são amplamente usados nas áreas farmacêutica, nutricional e em aplicações veterinárias.

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

Os resultados de atividade antioxidante dos extratos hexanóico e etanoico obtidos nas diferentes temperaturas de extração (4, 25 e 60 °C) estão apresentados na tabela 5.

Tabela 5 Atividade antioxidante dos extratos hexanólico e etanoico obtidos da farinha de semente de abacate em diferentes temperaturas, expressa em valores de IC₅₀. 

*Estes resultados foram estimados pela extrapolação da curva de atividade antioxidante.

Média ± desvio padrão; letras minúsculas diferentes na mesma coluna e letras maiúsculas diferentes na mesma linha correspondem a diferença estatística ao nível de 5% pelo teste de Tukey e t student, respectivamente.

Como todos os extratos etanoicos apresentaram maiores teores de compostos fenólicos totais, a maior atividade antioxidante também foi encontrada para os mesmos extratos (tabela 5). Pode-se verificar também que os extratos obtidos com etanol a 4 °C e 25°C apresentaram a melhor atividade antioxidante (IC₅₀ de 0,013 mg/mL e 0,018 mg/mL respectivamente) diferindo estatisticamente (p<0,05) do extrato obtidos e 60 °C. Quanto ao aumento da atividade antioxidante do extrato hexanoico obtido à 60 °C podemos supor que alguns compostos fenólicos de polaridade intermediária se solubilizaram em hexano por causa de aumento da temperatura e dessa forma contribuíram para o aumento de atividade antioxidante desse extrato, o que corrobora com os resultados obtidos para fenóis totais apresentados na tabela 4.

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

A concentração inibitória mínima (CIM) foi definida como a menor concentração do extrato em mg/mL, capaz de inibir o crescimento microbiano mostrada na tabela 6.

Tabela 6 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) dos extratos usando os solventes n-hexano e etanol para a farinha de semente de abacate em bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. 

Todos os extratos obtidos em temperaturas mais baixas apresentaram melhor atividade antimicrobiana, sendo os extratos hexanóicos mais biologicamente ativos quando comparados com os extratos etanoicos (tabela 6). O extrato hexanóico obtido a 4 °C apresentou maior atividade antimicrobiana para todas as bactérias testadas.

Muitos estudos têm sido realizados para verificar a atividade antimicrobiana de extratos de abacate. Chia et al. [²⁸] demonstraram que a atividade antimicrobiana em extratos de etanol de sementes de abacate (125-250 mg/mL) foram efetivas para as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (Salmonella enteritidis, Citrobacter freudii, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter aerogenes).