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INTRODUÇÃO
A Saúde Única (One Health) de forma mais ampla, busca discutir os aspectos inerentes da saúde humana, animal e ambiental, pois de acordo com essa abordagem, existem quatro áreas que influenciam na situação sanitária de um determinado território: o ambiente, as questões sociais, os aspectos econômicos e os comportamentais [1].
Dentro do contexto de Saúde Única (One Health), a disseminação da resistência bacteriana entre diferentes ecossistemas vem sendo estudada e ressalta-se como um conceito amplo que retrata a interação entre humanos, animais e meio ambiente, e que ganha destaque como uma estratégia para melhor compreensão e resolução de problemas contemporâneos de saúde que surgem como consequência da convergência humana, animal e ambiental [2].
Dessa forma, para ser realizada uma melhor identificação de um grupo bacteriano utiliza-se a técnica de coloração de Gram, está técnica foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista dinamarquês Hans Christian Gram, onde o estudo com as bactérias passou a ser mais específico, pois as mesmas puderam ser classificadas em Gram-positivas, aquelas que se coram em roxo e Gram-negativas, as que apresentam coloração vermelha. Esta técnica tem como fundamento nada mais que a capacidade das células coradas resistirem ou não à descoloração pelo álcool. Por meio dela, permitiu-se uma melhor visualização desses organismos, identificando sua forma e arranjo especial [3].
As bactérias Gram-negativas, como por exemplo, a Pseudomonas aeruginosa, estão envolvidas em doenças oportunistas, particularmente em pacientes imunocomprometidos, podendo causar dermatites, infecções urinárias e uma grande variedade de infecções sistêmicas, principalmente em ambientes hospitalares [4].
Estudos recentes apontam para um aumento da prevalência da pneumonia nosocomial causada pela infecção por Pseudomonas aeruginosa, oriunda da cavidade oral, provavelmente, devida à aspiração e/ou inalação de saliva contaminada por essa bactéria bucal, seus lipopolissacarídeos ou suas enzimas bacterianas [5, 6].
A patogenicidade da Pseudomonas aeruginosa e a produção de seus fatores de virulência, como: proteases, adesinas, flagelo, formação de biofilmes e fenótipo mucoide, associados à sua elevada taxa de resistência aos antimicrobianos, estão entre os principais fatores que dificultam a erradicação deste patógeno nos tecidos infectados, culminando em altos índices de mortalidade [7].
Desta forma, é devido ao surgimento destes microrganismos patogênicos, mutantes e resistentes aos compostos já utilizados na terapêutica atual, que as pesquisas de inovação tecnológica na área da farmacologia têm visado à descoberta de novos compostos antimicrobianos de origem natural ou sintética, como uma alternativa eficaz e econômica [8, 9].
Dentre os vários produtos naturais e/ou sintéticos bastante pesquisados na farmacologia pode-se citar os compostos terpênicos, que são divididos de acordo com o número de carbono (C) em suas moléculas, em isoprenos ou hemiterpenos (5 C), monoterpenos (10 C), sesquiterpenos (15 C); diterpenos (20 C); sesterpenos (25 C); triterpenos (30 C); tetraterpenos (40 C) e polisoprenóides (n C) [10, 11].
Os monoterpenos, que são os principais constituintes da maioria dos óleos essenciais, compreendem uma série ampla de substâncias naturais e/ou sintéticas que já apresentaram diversas atividades biológicas testadas e confirmadas tais como: fungicida [12] e bactericida [13].
Sendo assim, com base nas informações sobre o potencial terapêutico dos monoterpenos e a importância do combate às infecções causadas pelas bactérias multirresistentes, esse trabalho inovador procura avaliar a possível atividade antibacteriana do monoter-peno (R)-(+)-citronelal frente a cepas de P. aeruginosa.
METODOLOGIA
Substância-teste
O monoterpeno (R)-(+)-citronelal foi adquirido da Indústria Sigma-Aldrich" (São Paulo-SP). Para a realização dos ensaios farmacológicos, a substância foi solubilizada em DMSO e diluída em água destilada. A concentração de DMSO (dimetilsulfóxido) utilizada foi inferior a 0,1% v/v.
Micro-organismos
Foram utilizadas cepas clínicas de diferentes bactérias: Pseudomonas aeruginosa (Pa 101, Pa 102, Pa 103, Pa 104 e Pa 105) oriundas de infecções bacterianas ambulatoriais, todas mantidas em Agar Mueller-Hinton (MH) a 4 °C. Os inóculos foram obtidos a partir de culturas overnight em MH a 37 °C e diluídas em salina estéril para obter concentração final de aproximadamente 1,5 x 108 unidades formadoras de colônias por mL (UFC/mL), padronizado de acordo com a turbidez do tubo 0,5 da escala de McFarland [14].
Meios de cultura
O meio de cultura utilizado no ensaio para avaliação da atividade antimicrobiana foi o meio líquido Mueller Hinton, o mesmo adquirido na Difco" e preparado de acordo com as instruções do fabricante.
Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)
A CIM foi determinada utilizando a técnica de microdiluição em placa de 96 poços com fundo em "U", em cada poço da placa foi adicionado 100 µL caldo Mueller Hinton, duplamente concentrado. Em seguida, 100 µL da emulsão do monoterpeno na concentração inicial de 2048 µg/mL (duplamente concentrado), foram dispensados nas cavidades da primeira linha da placa e por meio de uma diluição seriada em razão de dois, foram obtidas as concentrações de 1024, 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8 e 4 µg/mL. A determinação da CIM foi conduzida com 10 µL do micro-organismo em cada cavidade, aproximadamente 1,5 x 108 UFC/mL. Foi preparado também o controle de crescimento no penúltimo poço, contendo 100 µL do mesmo caldo Muller Hinton duplamente concentrado e a suspensão de micro-organismo e no último poço foi feito o controle negativo com apenas 200 µL do caldo, sendo realizado todo o ensaio em duplicata. As placas foram incubadas a 35 °C durante 24 horas, após o tempo de incubação adequado dos ensaios com as bactérias, foi realizada a primeira leitura dos resultados. Em seguida, foram adicionados 20 µL de solução de resazurina sódica (SIGMA), em água destilada esterilizada na concentração de 0,01 % (p/v), reconhecido como indicador colorimétrico de óxido-redução para bactérias e feito nova incubação a 37 °C. A leitura procedeu-se, visualmente, pela ausência ou presença de crescimento do microrganismo pela formação de aglomerado de células (botão) e também pela observação da mudança da coloração da solução, de azul para rosa, indicando crescimento do mesmo. A CIM foi determinada como a menor concentração do produto que inibiu o crescimento visível do microrganismo e também pela observação da mudança da coloração da solução, de azul para rosa, indicando crescimento do micro-organismo. Portanto, foi determinada como CIM, a menor concentração do produto capaz de inibir o crescimento do micro-organismo ensaiado, verificado por uma não mudança da coloração do corante indicador [14-17].
Determinação da concentração bactericida mínima (CBM)
A concentração bactericida mínima (CBM) do monoterpeno também foi determinada para as cepas de bactérias. Após a leitura da CIM, foram feitos inóculos (10 µL) de três diluições anteriores ao valor da CIM, para o meio de caldo Mueller-Hinton (100 µL/ cavidade) em placa de microdiluição esterilizada, em seguida seguiram para incubação a 37 °C por 24 horas, após esse tempo foi adicionado 20 µL de resarzurina. Os ensaios foram incubados a temperatura de 37 °C por mais 24 horas para confirmação da concentração capaz de inibir o crescimento total das espécies bacterianas, verificado por uma não mudança da coloração do corante indicador [18, 19].
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A concentração inibitória mínima (CIM) em meio líquido foi determinada para o monoterpeno (R)-(+)-citronelal nas diferentes concentrações sugeridas na metodologia e determinada pela menor concentração capaz de inibir visualmente o crescimento bacteriano, conforme apresentado na tabela 1. Observou-se que os resultados para o monoterpeno testado foi de 512 µg/mL.
Tabela 1 Concentração inibitória mínima (CIM) do monoterpeno (R)-(+)-citronelal contra diferentes cepas de Pseudomonas aeruginosa.
(+) com crescimento (-) sem crescimento.
Fonte: autoria própria.
Segundo Sartoratto et al. [20], a atividade antimicrobiana é classificada como forte quando possuem CIM de até 500 µg/mL, moderada para CIM de 600 a 1500 µg/mL e fraca para CIM acima de 1500 µg/mL. De acordo com os resultados o monoterpeno (R)-(+)-citronelal demonstrou forte atividade antibacteriana sobre as cepas de Pseudomonas aeruginosa, visto que obteve CIM100 (Concentração Inibitória Mínima capaz de inibir o crescimento de 100 % das cepas) de 512 mg/mL.
A concentração bactericida mínima (CBM) foi determinada a partir da menor concentração do monoterpeno que resultou em inibição visível do crescimento do microorganismo. De acordo com a tabela 2, observa-se para o (R)-(+)-citronelal, uma variação de 512 a 1024 µg/mL para as cepas Pseudomonas aeruginosa Pa 101, Pa 104 e Pa 105.
Tabela 2 Concentração bactericida mínima (CBM) do monoterpeno (R)-(+)-citronelal contra diferentes cepas de Pseudomonas aeruginosa.
(+) com crescimento (-) sem crescimento.
Fonte: autoria própria.
Por sua vez, para um composto ser considerado bactericida ou bacteriostático a razão da CBM e CIM deve está entre 1: 1 a 2: 1, e para ser considerado como bacteriostático a relação deve ser maior que 2:1 [21]. Analisando os resultados da CBM sugere que o monoterpeno (R)-(+)-citronelal possui atividade bactericida para as cepas Pseudo monas aeruginosa Pa 101, Pa 104 e Pa 105, já para as demais foi observada uma ação bacteriostática.
Corroborando com o estudo, de acordo com Esteves e Da Silva Ecker [22], o óleo essencial Eucalyptus urograndis rico em citronelal, registrou atividade antibacteriana contra P.aeruginosa na concentração de 16 µg/mL no teste da CIM, evidenciando maior desempenho comparado com os antimicrobianos amplamente utilizados o cef-tazidima e o ceftriaxona, que apresentaram eficiência em concentrações maiores ou nenhuma eficiência, respectivamente.
Segundo Da Silva Santos, Piccoli e Tebaldi [23], o óleo essencial de citronela que apresenta como um dos seus compostos o citronelal, apontou atividade antimicrobiana contra P. aeruginosa, com CIM e CBM de 2,5 %, corroborando com os achados do presente estudo.
Nesse contexto, o conhecimento sobre plantas medicinais simboliza muitas vezes o único recurso terapêutico de muitas comunidades e grupos étnicos. O uso de plantas no tratamento e na cura de enfermidades é tão antigo quanto à espécie humana [24]. A necessidade por parte do ramo farmacêutico na descoberta de novos fármacos eficazes para diversas doenças aumenta dia após dia, o reino vegetal nesse ponto torna-se "fonte" por conter plantas com atividades farmacológicas variadas, potentes e eficazes ressaltando dessa forma a importância do estudo das plantas medicinais [25].
O avanço na comprovação científica da eficácia e da segurança das plantas medicinais, e também a constatação que a utilização da terapêutica centrada no uso de medicamentos sintéticos não cumpriu a promessa implícita e explícita no tratamento das doenças, em decorrências dos seus altos custos, pelos significativos efeitos adversos que têm os medicamentos sintéticos, pelos resultados nem sempre satisfatórios, tem levado a busca por formas alternativas de tratamento menos agressivas [26].
Dessa forma, pode destacar o monoterpeno citronelal que é um composto de modelo linear naturalmente presente em plantas cítricas, sendo ele o responsável pela característica flavorizante de algumas frutas, é encontrado em grandes concentrações em plantas como a citronela, que se destaca pelas diversas atividades farmacológicas comprovadas, dentre elas, antibacteriana [13, 27].
Desse modo, dentre as bactérias patogênicas ressalta-se a Pseudomonas aeruginosa, que pode ser encontrada em diversos ambientes, como plantas, solo, água e, inclusive, em seres humanos, e se comporta como patógeno oportunista ou como sendo parte da microbiota normal de indivíduos sadios [28]. Contudo é considerada de grande relevância clínica, uma vez que é dos principais agentes envolvidos em infecções noso-comiais, particularmente em pacientes imunocomprometidos, tendo como sítios de infecção o trato respiratório e o urinário, podendo inclusive causar bacteremias [29].
