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Introdução
Dentro da cavidade oral são encontrados diversos microrganismos como bactérias, arqueas, fungos e protozoários, de modo que cada um exerce um papel específico e interagem entre si e com o hospedeiro, tanto na saúde como na doença [1]. A placa bacteriana, também chamada de biofilme é uma comunidade cooperativa, bem organizada, de bactérias aderidas a uma superfície úmida e aglomerada por matriz de polissacarídeos [2].
Os gêneros de bactérias de maior prevalência na boca são Streptococcus, Actinomyces, Veillonella, Fusobacterium, Porphyromonas, Prevotella, Treponema, Neisseria, Haemophilis, Lactobacillus, Staphylococcus, dentre outros. Quando há alteração na variedade, ou na proporção populacional dessa microbiota, ocorre uma disbiose, o que favorece a ocorrência de doenças [3]. Dentre as espécies do gênero Staphylococcus, a Staphylococcus aureus é bastante enfatizada por estar relacionada a infecções purulentas e suas disseminações aos espaços faciais. Entretanto, a espécie Staphylococcus saprophyticus vem demonstrando uma problemática em ensaios clínicos por estar associada a infecções hospitalares, com potencial risco em dispositivos invasivos e em grupos com baixa imunidade [4].
Atualmente, tem aumentado a conscientização sobre as infecções nosocomiais, o que tem voltado a atenção para os problemas dos sistemas de controle de infecção hospitalar, sendo cada vez mais importante a avaliação de indicadores de qualidade clínica. As doenças infecciosas que apresentam risco de infecção cruzada no consultório odontológico incluem hepatite C, tuberculose, herpes, infecções orais e do trato respiratório superior. Há necessidade de reforçar a conscientização dos profissionais de odontologia sobre o controle dessas infecções e o risco de contaminação no consultório é elevado. Além disso, pesquisas sobre contaminação bacteriana interna e investigação de bactérias causadoras de doenças infecciosas nos atendimentos odontológicos são escassas [5].
O ambiente e os equipamentos odontológicos se tornam contaminados em decorrência da possibilidade de exposição a secreções e/ou sangue. Dessa forma, o uso de equipamentos de proteção individual por parte dos profissionais de saúde é uma conduta eficiente para prevenção da contaminação, no entanto, a esterilização de instrumentais e a desinfecção de superfícies é imprescindível, uma vez que grande parte dos microrganismos presentes nos consultórios odontológicos vem do meio externo [6].
Genz et al.[6] realizou um estudo sobre a contaminação das superfícies de consultório odontológico nas instalações do curso de odontologia de uma universidade em Santa Cruz do Sul, Vale do Rio Pardo, RS, o qual identificou a contaminação majoritariamente por estafilococos coagulase-negativos (80%). O Staphylococcus saprophyticus é um dos membros desse grupo, que é comumente responsável por 5% a 10% das infecções do trato urinário, sendo a segunda causa mais frequente dessas infecções, especialmente em mulheres sexualmente ativas [7].
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), aproximadamente 80% da população mundial utilizam a medicina alternativa, destacando-se os medicamentos fitoterápicos, para suprir a ausência de atendimento médico primário, principalmente em países da África [8]. Na área odontológica, pesquisas com produtos naturais têm aumentado nos últimos anos devido à busca por produtos com maior atividade farmacológica [9]. Além disso, tem se observado a evolução da resistência bacteriana, o que está gerando um grave problema de saúde pública decorrente do uso indiscriminado de antibióticos, o que torna importante gerar estratégias que contribuam para diminuíla [10].
Os óleos essenciais são líquidos oleosos aromáticos retirados de extratos vegetais, cuja atividade antimicrobiana é devida a vários terpenoides e compostos fenólicos pequenos [11]. Esses compostos são produtos do metabolismo secundário das plantas. Vários óleos essenciais possuem diferentes propriedades biológicas, como atividades anti-inflamatórias, sedativas, digestivas, antimicrobianas, antivirais ou antioxidantes, sendo amplamente utilizados para fins inseticidas, medicinais e cosméticos [12].
A Melaleuca alternifolia, planta nativa da Austrália, popularmente conhecida como árvore do chá, tem como principal produto o óleo essencial (TTO – tea tree oil), sendo de grande importância medicinal, pois possui comprovada ação bactericida e antifúngica contra vários patógenos humanos [8]. Jesus, Ellensohn & Barin [13] relataram que o óleo de Melaleuca tem dentre muitas aplicações a de desinfecção de ambientes, destacando que o que o torna um excelente antisséptico é a dificuldade que os microrganismos encontram de modificar seu sistema enzimático para criar resistência a ele, devido a sua composição química complexa.
O óleo essencial de Melaleuca tem ação inibitória frente à propagação de bactérias, inclusive as que são resistentes a antibióticos, como a Pseudomonas aeruginosa, presente em infecções hospitalares. Ademais, também é eficaz contra bactérias isoladas encontradas na superfície da pele, como os estafilococos [14].
Desse modo, o objetivo do presente trabalho é avaliar a atividade antimicrobiana e antiaderente do óleo essencial de Melaleuca alternifolia contra a cepa clínica de Staphylococcus saprophyticus.
Metodologia
Material vegetal
O óleo essencial de Melaleuca alternifolia foi obtido através de via comercial da marca Via Aroma Tea Tree, frasco em vidro âmbar contendo 10 mL de óleo essencial 100% puro sem diluições. Na padronização dos testes antibacterianos foi realizado a diluição do óleo para alcançar os valores de concentração ideais à realização dos testes conforme metodologia.
Microrganismo
Foi utilizada a cepa de bactéria clínica Staphylococcus saprophyticus SA45, que foi mantida em Agar Muller-Hinton (MH) a 4 ºC. Os inóculos foram obtidos a partir de culturas overnight em MH a 37 ºC e diluídas em salina estéril para obter concentração final de aproximadamente 1,5 × 108 unidades formadoras de colônias por mL (UFC/mL), ajustado pela turvação comparando-se com o tubo 0,5 da escala McFarland [15].
Meios de Cultura
Os meios de cultura utilizados nos ensaios para avaliação da atividade antimicrobiana foram o meio líquido Muller Hinton e o meio sólido ágar Muller Hinton. O meio de cultura foi adquirido na Difco® e preparado de acordo com as instruções do fabricante.
Determinação da CIM (Concentração Inibitória Mínima)
A CIM foi determinada utilizando a técnica de microdiluição em placa de 96 poços com fundo em “U”. Em uma placa de 96 cavidades, foi adicionado 100 μL caldo Mueller Hinton, duplamente concentrado, e 100 μL do óleo essencial de melaleuca, nas concentrações de 1024 a 16 μg/mL. A determinação da CIM foi conduzida com 10 μL do microrganismo em cada cavidade, aproximadamente 1,5 × 108 UFC/mL. O penúltimo contendo 200 μL do caldo foi inoculado com a suspensão de microrganismo, sendo o controle do crescimento, e o último poço recebeu apenas 200 μL do caldo, sendo o controle negativo. O ensaio foi realizado em duplicata. As placas foram incubadas a 35 ºC durante 24 horas. Após o tempo de incubação adequado dos ensaios com as bactérias, foi realizada a primeira leitura dos resultados. Em seguida, foram adicionados 20 μL de solução de resazurina sódica (SIGMA), em água destilada esterilizada na concentração de 0,01 % (p/v), reconhecido como indicador colorimétrico de óxido-redução para bactérias. A leitura se procedeu, visualmente, pela ausência ou presença de crescimento do microrganismo pela formação de aglomerado de células (botão). E também pela observação da mudança da coloração da solução, de azul para rosa, indicando crescimento do mesmo. Foi feita uma nova incubação a 37 ºC. A CIM foi determinada como a menor concentração do óleo essencial que inibiu o crescimento visível do microrganismo e também pela observação da mudança da coloração da solução, de azul para rosa, indicando crescimento do microrganismo [16].
Determinação da CBM (Concentração Bactericida Mínima)
Após a leitura dos resultados, foram feitos inóculos (10 μL) de três diluições a partir da CIM para o meio de caldo Mueller-Hinton (100 μL/cavidade) em placa de microdiluição esterilizada para a determinação da CBM. Após a incubação a 37 ºC por 24 horas foi adicionado 20 μL de resazurina. Os ensaios foram incubados a temperatura de 37 ºC por mais 24 horas para confirmação da concentração capaz de inibir o crescimento total das espécies bacterianas, verificado por uma não mudança da coloração do corante indicador [17].
Determinação da CIMA
A Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) do óleo essencial de melaleuca foi determinada na presença de sacarose a 5%, de acordo com Albuquerque et al.[18] com modificações, usando-se concentrações correspondentes ao composto até a diluição 1:1024. A partir do crescimento bacteriano, a cepa de Staphylococcus saprophyticus foi cultivada a 37 ºC em caldo Mueller Hinton (DIFCO, Michigan, Estados Unidos), depois foram distribuídos 0,9 mL do subcultivo em tubos de ensaio e, em seguida, adicionado 0,1 mL da solução correspondente às diluições do óleo essencial. A incubação foi feita a 37 ºC por 24 horas com tubos inclinados a 30º. A leitura foi realizada através da observação visual da aderência da bactéria às paredes do tubo, após a agitação do mesmo. O ensaio foi realizado em duplicata. O mesmo procedimento foi realizado para o controle positivo, o digluconato de clorexidina a 0,12% (Periogard®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA). Foi considerada a CIMA a menor concentração do agente em contato com sacarose que impediu a aderência ao tubo de vidro.
Resultados e Discussão
Os resultados encontrados acerca da atividade antibacteriana do óleo essencial de Melaleuca alternifolia contra as cepas Staphylococcus saprophyticus encontram-se descritos nas tabelas 1 e 2. Analisando esse resultado, observa-se que o óleo essencial foi capaz de inibir o crescimento da cepa SA45, com valor de CIM de 512 μg/mL e valor e CBM também de 512 μg/mL.
Tabela 1. Concentração inibitória mínima (CIM) em μg/mL do óleo essencial de Melaleuca alternifolia
(-): Não houve crescimento bacteriano (+): Crescimento bacteriano
Tabela 2. Concentração Bactericida Mínima (CBM) em μg/mL do óleo essencial de Melaleuca alternifolia
(-): Não houve crescimento bacteriano (+): Crescimento bacteriano
A atividade antimicrobiana considerada forte para óleos essenciais apresenta valor da CIM de até 500 μg/mL, moderada para valores da CIM de 600 a 1500 μg/mL e fraca para CIM acima de 1500 μg/mL [19]. Sendo assim, os resultados desse estudo mostram que a atividade antimicrobiana do óleo essencial de Melaleuca alternifolia apresentou uma forte inibição contra a cepa testada, apresentando uma CIM de 512 μg/mL.
Para ser considerado bactericida ou bacteriostático, o composto deve possuir CBM, respectivamente, igual ou duas vezes maior que a CIM ou a CBM ser maior que duas vezes a CIM [20]. De acordo com os resultados obtidos, a Melaleuca alternifolia apresenta um potencial bactericida frente à cepa de S. saprophyticus, sendo encontrada uma CBM de 512 μg/mL.
O trabalho de Silva e Mejia [14] se propôs a realizar uma revisão sobre a busca crescente por compostos antissépticos naturais devido às constantes adaptações dos microrganismos aos produtos comumente empregados no seu combate, tanto na superfície da pele como em ambientes contaminados. Desse modo, foram expostos estudos que comprovaram o potencial antimicrobiano do óleo essencial de Melaleuca alternifolia, contra diversos microrganismos patógenos humanos, apontando que este óleo é um potente agente antisséptico, frente aos resultados positivos em inibir parcial ou totalmente microrganismos gram-positivos como Pseudomonas aeruginosa e os estafilococos, incluindo S. saprophyticus, espécie analisada no presente estudo.
Ao analisar os resultados apresentados no estudo de Prestes et al.[21], o qual avaliou a utilização do óleo essencial de Melaleuca como coadjuvante no tratamento endodôntico, empregando-o em associação ao hidróxido de cálcio, se percebeu que o óleo essencial apresentou inibição satisfatória frente à Cândida albicans e também ao Enterecoccus faecalis, principais microrganismos envolvidos em infecções secundárias do sistema de canais radiculares e lesões perirradiculares.
O trabalho de Gioppo et al.[22] analisou o potencial antibacteriano do óleo essencial de Melaleuca frente a isolados multirresistentes causadores de infecções hospitalares, sendo eles as bactérias Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae. Como resultado, as emulsões do óleo essencial de Melaleuca alternifolia inibiram o crescimento dessas bactérias, sendo que a cepa hospitalar de Escherichia coli produtora de ESBL mostrou-se a cepa mais sensível, o que permite descrever o potencial antibacteriano do óleo. Dessa forma, percebe-se que todos esses trabalhos corroboram com o presente estudo comprovando o potencial antibacteriano do óleo essencial de Melaleuca.
A atividade antiaderente é observada nos valores da tabela 3, em que tanto o óleo essencial de Melaleuca alternifolia, quanto o Digluconato de clorexidina obtiveram um valor de CIMA igual a 1:4.
Considerada como padrão-ouro para o tratamento de doenças bucais, a clorexidina geralmente é mais eficaz contra microrganismos gram-positivos, incluindo os estreptococos do gênero Mutans. Porém, a frequente utilização deste antimicrobiano não é aconselhável devido aos efeitos colaterais locais, como a descoloração de dentes, restaurações e próteses, ulceração da mucosa oral e alteração da percepção gustativa [8]. Em concordância com esse estudo, o óleo essencial de Melaleuca pode se mostrar uma alternativa a este agente, uma vez que apresentou a mesma capacidade antiaderente frente à cepa de Staphylococcus saprophyticus.
Tabela 3. Concentração Inibitória Mínima de Aderência em μg/mL do óleo essencial de Melaleuca alternifolia e do digluconato de Clorexidina 0,12%
Legenda: (+) Inibiu a aderência ao tudo (-) Não inibiu a aderência ao tubo.
O estudo realizado por Ramalho et al.[23] analisou a atividade antiaderente dos óleos essenciais de Eucalyptus globulus e Eucalyptus citriodora contra cepas de Klebsiella pneumoniae, ficando evidente que o óleo essencial de Eucalyptus globulus apresenta boa eficiência contra a formação do biofilme por esta espécie bacteriana, demonstrando resultado equivalente ao controle digluconato de clorexidina 0,12%, inibindo a formação do biofilme na concentração 1:8. Ou seja, a menor concentração do óleo essencial de Eucalyptus globulus capaz de inibir a adesão da bactéria à parede do tubo foi de 1:8.
Conclusão
Ao realizar esse trabalho observou-se que o óleo essencial de Melaleuca alternifolia apresentou atividade antimicrobiana satisfatória, sendo considerado bactericida e bacteriostático para cepa de Staphylococcus saprophyticus, além de uma atividade inibitória mínima de aderência in vitro satisfatória sobre esse patógeno comum em infecções nasocomiais, apresentando-se como alternativa terapêutica para as infecções decorrentes de contaminação no ambiente e instrumentais odontológicos. Entretanto, os trabalhos que relacionam esse potencial antimicrobiano e antiaderente da Melaleuca alternifolia com Staphylococcus saprophyticus são escassos, necessitando de mais estudos para destacar sua eficácia.
