Introducción

La enzima Citocromo P-450 CYP2D6 es una monooxigenasa partícipe del metabolismo de una gran variedad de fármacos neurolépticos y antipsicóticos de prescripción frecuente en la enfermedad de Huntington como la tetrabenazepina y clozapina, entre otros [¹, ²]. El gen que codifica para CYP2D6 está situado en una región altamente polimórfica del cromosoma 22q13.1 [³]. Dentro de las principales causas de la variedad de respuestas interindividuales a fármacos que son metabolizados por el citocromo P450-CYP2D6 están las variantes alélicas, se han descrito alrededor de 70, las cuales, en su mayoría llevan a un cambio en la actividad enzimática (www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm).

El aumento, disminución o pérdida completa de la actividad enzimática resultado de la expresión génica permite definir cuatro fenotipos posibles: los metabolizadores rápidos (normales) (MR) poseen dos alelos con función normal, los metabolizadores intermedios (MI) poseen una copia del gen activo y una copia de un alelo no funcional o dos alelos con actividad enzimática reducida, mientras que los metabolizadores lentos (ML) son aquellos individuos que poseen ambos alelos no funcionales. Los metabolizadores ultrarrápidos (MU) son aquellos que tienen múltiples copias de alelos funcionales [⁴]. Existe una gran variabilidad étnica en la diversidad de los alelos y la incidencia en los fenotipos [⁵]. Entre un 5 a 10% de la población caucásica son ML para los sustratos de CYP2D6 y la deleción completa del gen CYP2D6 (alelo *5) representa el 4-6% de la población [⁶-⁸].

En este trabajo se establecieron las frecuencias alélicas y genotípicas de los alelos *3, *4, *5 y *6 del gen CYP2D6 de pacientes sintomáticos con enfermedad de Huntington residentes en el municipio de Juan de Acosta – Colombia. Para ello, se usó una combinación de métodos basados en RFLP-PCR y la técnica de qPCR múltiplex.

Metodología

Estudio descriptivo, transversal y de investigación aplicada a seres humanos con muestreo de conveniencia no probabilístico. La muestra estuvo constituida por 23 individuos voluntarios, oriundos y residentes de Juan de Acosta: 10 pacientes (4 mujeres y 6 hombres) con signos y síntomas de la condición, cinco familiares y ocho personas sin parentesco, quienes fueron convocados e informados sobre los objetivos y la importancia del estudio. Los participantes cumplieron con los criterios propuestos de inclusión: voluntarios, mayores de 18 años, firma del consentimiento y exclusión, no alcohólicos ni con enfermedad hepática actual. Los pacientes con enfermedad de Huntington reportaron que los fármacos prescritos con más frecuencia son tetrabenazina o clozapina; algunos, están tomando unos, amantadina y otros, ácido valproico.

Todas las actividades de este proyecto fueron previamente aprobadas por el comité científico y comité de Bioética de la Universidad Libre Seccional Barranquilla, las Secretarías de Salud Departamental y Municipal, y la Fundación de Enfermos de Huntington de Juan de Acosta.

Selección de Primers:

Se seleccionaron según las referencias a continuación mostradas y se confirmaron con el programa BLAST del NCBI (Tabla 1).

Para identificar los alelos CYP2D6 *3, *4 y *6, utilizando el método RFLP-PCR convencional con un juego de pares de primers confrontados, se procedió a la amplificación del segmento según protocolos publicados en la literatura científica consultada [⁸-¹¹] (Tabla 2):

La reacción se llevó a cabo en 35 ciclos. Precalentamiento a 95 °C por 5 min. Desnaturalización a 95 °C por 30 segundos. Anillamiento a 58,8 °C por 30 segundos. Extensión a 72 °C por 30 segundos, 72 °C por 5 min., 4 °C ∞. El Protocolo de electroforesis horizontal utilizado fue: Gel de agarosa 2%, buffer TBE 0,5X NANCY 520; los productos de PCR se separaron a 65 voltios por 1 hora y 20 minutos. Los amplificados se observaron en transiluminador de luz UV y luego, fotografiados. Se confirmó el segmento amplificado (Figura 1) por secuenciación realizada en Macro Gen.

Tabla 1 Primers usados en las pruebas de RFLP-PCR convencional y PCR-tiempo real. 

Fuente: tomado de Flores et al. (2015) [⁹], Saghafi et al. (2018) [¹⁰] y Dorado et al. (2018) [¹¹]

Tabla 2 Amplificación del segmento por PCR convencional para determinar los polimorfismos. 

Fuente: elaborado por los investigadores (Tomado y modificado de [⁸-¹¹]). µM: Micromoles; µL: microlitros; ng: nanogramos; H₂O TI: agua ultrapura tipo I.

La Tabla 3 muestra los segmentos generados de la digestión con enzimas de restricción correspondientes a los alelos de CYP2D6 *3, *4 y *6 (Figura 1).

Tabla 3 Productos de la digestión obtenidos con enzimas de restricción. 

Fuente: tomado de Saghafi et al. (2018) [¹⁰].

Aplicación del método qPCR – múltiplex para determinar la Deleción*5 y Duplicación del CYP2D6.

Se utilizó el termociclador en tiempo real CFX96 (BIO-RAD), junto con el programa CFX manager para la realización del experimento y la visualización de los resultados y la supermix EvaGreen SSOFAST (BIORAD). Como control positivo se utilizó una muestra de ADN extra pura con número de referencia: NA1727 Coriell Institute for medical research [¹²]. Las concentraciones de las muestras se ajustaron a 15 µg/µL y el volumen a 20 µL [¹³], (Tabla 4).

Deleción *5: La desnaturalización se realizó a 95 °C por 2 min durante un ciclo y 94 °C, 1 minuto por 35 ciclos; la hibridación a 65 °C por 1 min.; la extensión a 68 °C por 5 minutos y la extensión final a 68 °C por 7 min.

Duplicación de CYP2D6: La desnaturalización se realizó a 95 °C por 2 min durante un ciclo y 94 °C, 2 minuto por 35 ciclos; la hibridación a 52 °C por 1 min.; la extensión a 68 °C por 3 minutos y la extensión final a 68 °C por 8 min.

Tabla 4 Mezclas de reacción para: qPCR del alelo *5 + DPK y detectar Duplicación del CYP2D6. 

Fuente: elaboración por los investigadores. µM: micromoles; µL: microlitros; ng: nanogramos.

Los resultados consisten en la interpretación de las curvas generadas por el equipo.

RESULTADOS

Las edades de los individuos vinculados al estudio estaban comprendidas entre 35 y 65 años (promedio: 45,5 años); el 65,21% (n=15) mujeres y 34,79% (n=8) hombres. El vínculo de parentesco entre los pacientes con enfermedad de Huntington y los familiares se encontraba desde, el primer grado hasta el cuarto grado de consanguinidad. El 37,5% toma medicamentos que no están asociados con la prescripción médica específica para su enfermedad, pero, les ayuda con los diferentes síntomas que se les presente como dolor de cabeza, oído y de las articulaciones. En contraste, los pacientes reportaron que los fármacos de prescripción para los síntomas de la patología, no los tomaban con la regularidad recomendada por los efectos secundarios como somnolencia, mareos y dificultad para realizar las labores cotidianas.

En la Figura 1 se observan los segmentos generados durante la digestión con enzimas de restricción correspondientes a los alelos de CYP2D6 *3, *4 y *6 de esta muestra poblacional.

Fuente: Elaboración por los investigadores.

Figura 1 Patrones de corte con enzimas de restricción, electroforesis en agarosa al 3%.a. Control negativo (línea 1), MP (línea 2), segmento sin tratamiento enzimático (línea 3, 5 y 7), segmentos digeridos (línea 4, 6, 8). b. Segmento sin tratamiento enzimático (línea 1, 3, 5, 7, 9), Control negativo (línea 11), MP (línea 13). En a. y b en todas las líneas se observan muestras homocigotas para tipo salvaje (wt). c. segmentos digeridos del CYP2D6. En líneas 1, 2, 3, 4, 6, 7, 9 se observan muestras homocigotas para tipo salvaje (wt); líneas 5, 8, muestras heterocigotos, línea 10 homocigoto mutante, línea 11 control negativo y MP (marcador de peso molecular). 

Frecuencias alélicas y genotípicas de la muestra poblacional.

En la tabla 5 se muestran las frecuencias alélicas y genotípicas de los alelos *3, *4 y *6 del CYP2D6 de la muestra poblacional.

Tabla 5 Frecuencias alélicas y genotípicas de polimorfismos CYP2D6*. 

Fuente: elaboración por los investigadores. *fal: frecuencias alélicas.

Equilibrio de Hardy-Weinberg (EHW): se encontró que en la muestra poblacional el polimorfismo Cyp2D6*3 es Monomórfico para el alelo silvestre. Los marcadores CYP2D6*4 y CYP2D6*6 no exhiben desviaciones de los preceptos de Hardy-Weinberg (EHW), dado los valores de p>0,05, siendo este último marcador el que más aporta a la diversidad genética en términos de heterocigosidad esperada en la muestra poblacional (tabla 5). Todas las frecuencias esperadas se encontraron en equilibrio de Hardy-Weinberg.

Duplicación

La proporción genotípica de individuos con la duplicación del gen CYP2D6 corresponde a 26,1% mientras que la misma en los individuos con el fenotipo silvestre es 73,9%. Asumiendo EHW, la frecuencia del alelo mutado es f=0,511 y la del alelo silvestre es f=0,489.

Tabla 6 Tipo y frecuencia de haplotipos CYP2D6*. 

Fuente: elaboración por los investigadores. *de: desviación estándar.

DISCUSSION

Es reconocido que determinar la prevalencia de los polimorfismos de CYP2D6 en pacientes que reciben tratamiento con fármacos neurolépticos y antipsicóticos es de gran importancia en la farmacogenética. La enzima CYP2D6 participa en la fase I del metabolismo de casi el 25% de los fármacos clínicos y sus polimorfismos pueden afectar el proceso metabólico de aproximadamente el 50% de estos. Las variantes alélicas CYP2D6 pueden clasificarse en categorías, las cuales, generan una proteína con actividad catalítica nula, disminuida, normal, aumentada o cualitativamente alterada [¹⁵, ¹⁶]. Entre las variantes más importantes se encuentran CYP2D6 * 2, CYP2D6 * 4, CYP2D6 * 5, CYP2D6 * 10, CYP2D6 * 17 y CYP2D6 * 41 [²]. Las frecuencias de los alelos más frecuentes en una población son diferentes en cada grupo étnico [¹⁷]. De acuerdo con los antecedentes históricos, en Colombia y otros países latinoamericanos relacionados con el descubrimiento de América, se pueden diferenciar tres grupos étnicos importantes: los pueblos indígenas, los afrodescendientes y los mestizos; así, la población mayoritaria mestiza del caribe colombiano, es el producto del cruce entre el blanco español, el indígena nativo y el negro africano [¹⁸, ¹⁹].

En el presente estudio se analizó una muestra poblacional de Juan de Acosta, que incluyó pacientes sintomáticos de enfermedad de Huntington, algunos familiares y un grupo de individuos sin parentesco. Se utilizó la técnica molecular RFLP-PCR convencional, la cual, fue seleccionada porque a través del tamaño de los fragmentos de restricción, es posible determinar la presencia o no de la mutación, por tanto, el genotipo del paciente de forma rápida, reproducible y confiable. Sin embargo, estas pruebas dirigidas por sí solas no detectan variantes del número de copias, lo que puede cambiar el fenotipo asignado [¹⁶]. Por otro lado, se aplicó también, qPCR- Múltiple para identificar la Deleción*5 y la Multiplicación por su alta sensibilidad, especificidad, y se obtuvo una eficiencia de amplificación del 100% en todas las muestras, además de, permitir la cuantificación del número de copias del gen CYP2D6, con resultados reproducibles.

Asumiendo que, las distribuciones de las frecuencias genotípicas observadas se corresponden con las esperadas para los alelos *3, *4 y *6 identificados mediante ensayo de RFLP-PCR convencional, según la Ley de Hardy Weinberg, en la tabla 5, se encontró que:

En la muestra poblacional "costera" el genotipo más representado fue el homocigótico para el alelo silvestre *1/*1 de CYP2D6*3, igual resultado se obtuvo en la población de la región centroccidental de Venezuela [²⁰]; la frecuencia esperada del alelo inactivo *3 fue de (0,0) en la muestra de la población "costera" presentándose monomórfico. El CYP2D6*3 presenta una deleción de la adenina en la posición 2549 expresándose en una proteína no funcional, sin actividad catalítica [²¹]. En el 2020, un estudio publicado por ^{Sarmiento et al.}, realizado en Bogotá, con 212 sujetos voluntarios sanos no emparentados, de 18 a 58 años; 75% de ellos, hombres, reporta una frecuencia de 0,47% para este alelo CYP2D6*3 en población mestiza (una mezcla de poblaciones: españolas, amerindias y africanas) de Bogotá, haciendo la observación para el análisis de los resultados, que a esta ciudad han llegado personas de diferentes regiones del país que contribuyen con el incremento en los porcentajes de mezcla [²²]. ^{Isaza et al.}, también, en población mestiza colombiana, reportó el CYP2D6*3 como alelo no funcional con una frecuencia de 1,2% [²³].

En cuanto al genotipo *4/*4 en la muestra poblacional "costera", la frecuencia esperada es de 9,3% y representa el 30,4% con el alelo mutado, en contraste con otros estudios realizados con mestizos en Colombia: el primero, realizado en Bogotá informa 4,25% para el genotipo y una frecuencia de 14,15% para el alelo mutado *4 [²²] y la otra investigación, reportada en población colombiana, 19,4% para CYP2D6*4 [²³]. Los amerindios, mestizos y eurodescendiente en América Latina presentan una prevalencia de este alelo de 0 a 21 [²⁴]. En población venezolana de la región centroccidental la proporción del genotipo fue 2% y la respectiva variante *4, fue la que estuvo representada con mayor frecuencia (16,5%); en mestizos cubanos, la frecuencia para esta variante *4 fue 14,6% [¹⁰, ¹⁷]; en poblaciones nativas de Argentina y Paraguay, identificadas como amerindios 51,2% [²⁵] y en México 11,2% [²⁶]. Todos los anteriores estudios informan frecuencias semejantes a aquellas reportadas para diferentes poblaciones europeas [⁶, ²⁷-³¹], excepto, en Chile donde la frecuencia para el alelo *4 fue menor 3.6% [³²]. La variante CYP2D6*4 presenta un cambio de guanina por adenina en la posición 1846, generando un codón de terminación que produce la síntesis de una proteína inactiva que contiene 181 aminoácidos en lugar de los 457 que codifica el alelo salvaje. Todas las variantes CYP2D6*4 presentan el mismo defecto del acortamiento de la proteína, pero, cada subtipo tendrá sus características propias [²¹, ³³].

Con relación al genotipo *6/*6 se estimó la proporción genotípica esperada en la muestra poblacional de 18,9% y la alélica de 43,5%, evidenciando mayor presencia del alelo, comparado con las frecuencias reportadas para otras poblaciones mestizas en Colombia: 0,47% para un genotipo heterocigoto (*1/*6) y la respectiva del alelo mutado *6, de 0,47%, en Bogotá [²²]; en población colombiana [²³], se reportó 0.0 para el mutante *6, lo que indica 100% silvestre (wt), y en otras poblaciones mestizas americanas [⁴-⁶, ²⁰, ²⁵, ³², ³⁴-³⁶]. Este alelo se encuentra principalmente en poblaciones Caucásicas, sus descendientes americanos presentan una frecuencia menor de 1% [⁹, ³⁷]. El CYP2D6*6 presenta una deleción en el exón 3, de la timina en la posición 1707, expresando una proteína truncada, no funcional sin actividad catalítica (www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm).

Las altas frecuencias de las variantes CYP2D6*4 y CYP2D6*6 obtenidas en el presente trabajo no son comparables con otros estudios de poblaciones étnicas semejantes, debido a las limitaciones para su realización como son: a) la muestra es pequeña; b) el muestreo es no convencional, pues, se trata de un grupo familiar de 10 pacientes sintomáticos con enfermedad de Huntington, otros 5 con relaciones de consanguinidad, pero, sin diagnóstico de la patología y 8 individuos sin parentesco; c) la falta de estudios previos de investigación sobre el CYP2D6 en la Región Caribe colombiana.

En la muestra poblacional en estudio, el 8,7% de los individuos portan la deleción CYP2D6 *5, el método utilizado PCR – tiempo real múltiple permitió la identificación (ausencia y/o presencia) sin discriminar si son homocigotos o heterocigotos. Se encontró una alta frecuencia (26,1%) de individuos con la duplicación/multiplicación de alelos CYP2D6 activos, valor mayor a los reportados en poblaciones mestizas hispanoamericanas, y bastante superior a la obtenida dentro de la población colombiana (1,2%) [²², ²³].

Atendiendo a la revisión de la literatura científica sobre el tema, según la actividad metabólica, los genotipos pueden categorizarse [³⁸], en:

De acuerdo con las anteriores categorías, en la muestra poblacional estudiada, en los 23 individuos, se encontraron algunos hallazgos significativos: mutación del alelo 4* (3 metabolizadores lentos, 8 metabolizadores intermedios); mutación del alelo 6* (4 metabolizadores lentos, 12 metabolizadores intermedios); deleción del alelo 5* (2 metabolizadores lentos y/o perdida de la función de la enzima) y duplicación del gen CYP2D6 (6 metabolizadores ultrarrápidos), lo cual, genera una variabilidad interindividual en la biotransformación (Reacciones de Fase I) y como consecuencia, concentraciones plasmáticas diferentes durante el tratamiento a dosis terapéuticas, lo cual afecta de manera significativa la terapia farmacológica recibida por los pacientes, entre las que se destacan incrementos de las reacciones adversas, toxicidad medicamentosa y disminución de la efectividad [³⁹].

Dentro del grupo de fármacos recibidos por los pacientes del estudio encontramos: Tetrabenazina (Inhibidor de la recaptación de monoaminas), el cual, es un inhibidor potente de la Isoforma CYP2D6, cuya consecuencia son las interacciones medicamentosas fármaco-fármaco, en el metabolismo con los otros fármacos suministrados (Clonazepam, Ácido Valproico y Amantadina) produciendo en algunas ocasiones aumento de su concentración, reacciones adversas y posible toxicidad; el Ácido Valproico (Neuromoduladores) es también, un potente inhibidor del sistema microsomal P-450, especialmente, de las Isoformas CYP3A4 y CYP2D6 ocasionando iguales consecuencias a las descritas con Tetrabenazina, además, es un medicamento de margen terapéutico estrecho, y con el Clonazepam (Benzodiacepinas), son medicamentos catalogados según la legislación colombiana como de control especial, con alto potencial de generar adicción y dependencia, la interacción medicamentosa Ácido Valproico-Clonazepam se asocia a potencialización de los efectos del Clonazepam, relacionándose además con status convulsivo [⁴⁰].

Es de anotar que los 3 medicamentos utilizados por los pacientes del estudio, en sus respectivas fichas técnicas publicadas por los laboratorios fabricantes, se reportan como reacciones adversas frecuentes clasificadas como Tipo A -Efecto Colateral según Rawlins y Thompson- las reportadas por los pacientes y/o cuidadores en la encuesta: somnolencia, astenia y sensación de mareo [⁴¹].

Es fundamental realizar un seguimiento farmacoterapéutico de los pacientes estudiados, teniendo en cuenta los hallazgos obtenidos en el estudio genético, para realizar una terapia farmacológica individualizada basada en el ajuste de la dosificación, y lograr de esta manera, aumentar la efectividad de la terapia farmacológica e incrementar la seguridad de la misma disminuyendo los potenciales efectos tóxicos y/o reacciones adversas [⁴²].

En los pacientes metabolizadores intermedios y lentos, es necesario realizar una disminución en la dosis para reducir la incidencia de las reacciones adversas sobre todo los efectos colaterales que son dependientes de la dosis y consecuencia del mecanismo de acción del principio activo y así, evitar los efectos tóxicos generados por la acumulación del fármaco o sus metabolitos; se debe ser muy cuidadoso con los medicamentos del grupo de las benzodiacepinas y neuromoduladores, ya que, su suspensión brusca puede generar efectos de rebote con exacerbación de la sintomatología del paciente [⁴³].

En los pacientes metabolizadores rápidos debe efectuarse un incremento en la dosificación, previa medición de las concentraciones séricas de los fármacos utilizados, para lograr una adecuada biodisponibilidad del principio activo, reflejada en efectividad terapéutica y control clínico de los pacientes [⁴³].

Los resultados obtenidos en este trabajo son importantes, puesto que, aporta conocimiento por ser el primer estudio centrado en pacientes con enfermedad de Huntington de la población mestiza de Juan de Acosta-Atlántico para establecer sus fenotipos metabólicos extrapolados del genotipo del CYP2D6 que interviene en el metabolismo de los fármacos neurolépticos y antipsicóticos prescritos como la tetrabenazepina y la clozapina [⁴⁴, ⁴⁵].

CONCLUSIONES

En la muestra poblacional del municipio de Juan de Acosta, el genotipo más representado fue el homocigótico para el alelo silvestre *1/*1 de CYP2D6*3, la frecuencia esperada del genotipo *4/*4 fue de 9,3%, representando el 30,4% con el alelo mutado y por último, se encontró una alta frecuencia (26,1%) de individuos con la duplicación/multiplicación de alelos CYP2D6 activos, valor mayor a los reportados en poblaciones mestizas hispanoamericanas y muy superior a la obtenida dentro de la población colombiana. Esta información tiene aplicación potencial en la práctica médica porque CYP2D6 es crucial en el metabolismo de fármacos comúnmente prescritos en pacientes con enfermedad de Huntington, con la finalidad de reducir la incidencia de efectos adversos y aumentar el efecto terapéutico deseado.