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Introducción
El glaucoma es una enfermedad neurodegenerativa del nervio óptico, que representa un importante problema de salud pública a nivel mundial, ya que, es considerada como la segunda causa principal de ceguera en el mundo [1]. Actualmente, se encuentran alrededor de 78 millones de personas con esta patología y se estima que este número llegará a 111.8 millones para 2040 [1]. En Colombia, a través de algunos estudios se ha detectado que más de 2.300.000 de personas presentan dicha patología, en donde, alrededor de 50% de ellos no lo saben [2].
Su tratamiento principalmente es manejado con gotas oftálmicas de principios activos hidrófobos como lo son los análogos de prostaglandinas donde se encuentran el bimatoprost y latanoprost, los cuales son usados como fármacos de primera línea debido a que presentan una mayor capacidad en la reducción de la presión intraocular entre un 28--33% [3]. Sin embargo, estos fármacos presentan una gran limitación a nivel comercial, debido a que el 90% de las formulaciones oftálmicas comercializadas son formas farmacéuticas líquidas de liberación inmediata [4], y tan solo hay sistema de implante de bimatoprost aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA por sus siglas en inglés) en el 2020; no obstante, estas formas presentan un gran desafío en cuanto a la barrera fisiológica y al alto recambio del líquido lagrimal, lo que limita el tiempo de retención del fármaco, además de que el uso crónico requiere de sistemas multidosis con agentes conservantes, que se asocian con un aumento de la toxicidad y de los efectos adversos (irritación, fotofobia o ardor por su aplicación diaria) afectando la eficacia terapéutica y una baja adherencia del paciente al tratamiento [3].
En los últimos veinte años las publicaciones y citas sobre investigaciones relacionadas con la administración ocular de fármacos aumentaron un 746,15%, evidenciando las tendencias actuales, los patrones de colaboración global, los puntos críticos de investigación y las fronteras emergentes en este tema, donde la administración ocular de fármacos para el tratamiento de glaucoma se encuentra dentro de las principales líneas de investigación [5].
Por lo tanto, surge la necesidad de buscar nuevas estrategias para administrar principios activos con una liberación controlada, para reducir los intervalos de administración, reduciendo los costos del tratamiento y mejorando la adherencia de los pacientes al tratamiento. Los nanogeles son sistemas de administración, que ofrecen grandes ventajas como: una mayor biodisponibilidad, liberación controlada, mejor adherencia y una reducción de los efectos adversos al ser sistemas más amigables y biocompatibles [4].
De acuerdo con lo anterior, se propuso el diseño de un nanogel a base de polímeros naturales como la gelatina por su buena biocompatibilidad, biodegradabilidad y bajo costo, mediante el método de emulsión-gelación, en el cual, se variaron las condiciones que afectaron el tamaño de partícula como la cantidad de fase acuosa y tensoactivo, el porcentaje de amplitud de onda, el tiempo de homogenización por sonda ultrasónica, el tiempo y revoluciones de agitación.
Metodología
Materiales
Gelatina tipo B, glutaraldehído 25% (GTA), monooleato de sorbitan 80 y dimetilsulfóxido empleados fueron marca SIGMA-ALDRICH. Medio de cultivo Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), suero fetal bovino, antibióticos, vitaminas, MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 difenil tetrazoliun bromuro) y PBS para los ensayos de citotoxicidad fueron marca GIBCO. Otros reactivos empleados fueron de grado analítico.
Preparación de Nanogeles
Los nanogeles fueron preparados modificando la metodología emulsificación-gelación descrita por Jiménez et al.[6]. Se prepararon dispersiones de gelatina en agua purificada a una concentración final de 2,5% p/p con 0,1% p/p de glutaraldehído a 70 °C por 10 minutos con agitación magnética 500 rpm hasta la dispersión total de la gelatina. Posteriormente, 10 mL de cada dispersión fue adicionada lentamente sobre 40 mL de la fase oleosa compuesta de aceite mineral con un 10% de monooleato de sorbitán 80, esta mezcla fue homogenizada empleando una sonda ultrasónica (60 Hz con una amplitud del 50%) por 10 min, en un baño de hielo para favorecer la gelación de las partículas [6], seguido de agitación magnética constante por 1 hora a 1400 rpm. Finalmente, la emulsión formada fue almacenada a 4 °C por 24 horas hasta la gelación total de los nanogeles, que fueron purificados por centrifugación (1850 × g / 30 min) y lavados con mezclas etanol: agua 1:1. Se elaboraron tres lotes de nanopartículas.
Incorporación de latanoprost en los Nanogeles
La incorporación del latanoprost en los nanogeles se realizó mediante sorción [6] de una solución saturada del principio activo (0,0129 mg/mL) sobre los nanogeles por 12 horas. Posteriormente, se retiró el exceso de solución de latanoprost y los nanogeles cargados fueron almacenados a 4 °C. Fueron cargados tres lotes independientes de nanopartículas. Los pesos iniciales y finales de los nanogeles fueron tomados para determinar la capacidad de sorción de los nanogeles.
Liberación In vitro de latanoprost
Para el estudio de liberación in vitro de latanoprost se tomaron 100 mg de nanogeles cargados en tubos eppendorf con 1 mL del medio de liberación (buffer de fosfatos con pH 7,4). Se colocaron las muestras en un agitador orbital a 100 rpm a 37 °C. A diferentes tiempos (1, 24, 48, 72, 96, 168 h) se tomaron los sobrenadantes y el latanoprost fue cuantificado por UV-Vis.
Cuantificación de latanoprost
El porcentaje de latanoprost liberado, se determinó empleando un Espectrofotómetro GENESYS 10S UV-Vis a una longitud de 210 nm [7]. Se construyó una curva de calibración con concentraciones de 0, 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 y 10,0 µg/mL de latanoprost.
Eficiencia de carga
La eficiencia de carga de las nanogeles se determinó mediante la siguiente ecuación:
Cinética de liberación de fármacos
La cinética de liberación de latanoprost, los datos obtenidos en la liberación in vitro se ajustaron a diferentes modelos cinéticos: Orden Cero (m0 - m = Kt), primer orden (log m = log m0 - Kt /2,303), modelo Korsmeyer-Peppas (m0 - (m / m0) = Ktn) y modelo Higuchi (m0 - m = Kt1/2) donde m es la cantidad de fármaco restante en la formulación en el momento t y m0 es la cantidad inicial del fármaco en la formulación. Con los valores del coeficiente de correlación (R)2 se encontró el modelo que más se ajusta a la liberación obtenida.
Análisis de espectrometría infrarroja con transformada de Fourier con reflectancia total atenuada (ATR-FTIR)
Se realizó ATR-FTIR en un espectrómetro ALPHA II BRUKER en un rango de 4000-650 cm-1 con 25 escáneres por muestra.
Microscopía óptica
El tamaño de los nanogeles obtenidos cargados y sin cargar se estudió mediante microscopía óptica usando un microscopio invertido Primo Vert en 40x acoplado a un Software ZEN lite. Para cada réplica se analizaron 200 diámetros de partículas diferentes con ayuda del programa ImageJ. Para cada lote se determinó la distribución de tamaño de partícula y el índice de polidispersión (PdI), empleando la siguiente ecuación:
donde, σ corresponde a la desviación estándar y a corresponde a la media del diámetro de las nanopartículas.
Pruebas reológicas
El comportamiento viscoelástico se estudió empleando hidrogeles de gelatina. Dispersiones de gelatina en agua purificada a diferentes concentraciones (2,5% y 5% p/p) con 0,1% p/p de glutaraldehído a 70 °C con agitación magnética (400 rpm / 10 min) fueron preparadas. Posteriormente, cada dispersión fue servida en moldes de plástico que fueron almacenados a 4 °C por 24 horas hasta la gelación del hidrogel. Las propiedades viscoelásticas se evaluaron en un reómetro oscilatorio Anton Paar equipado con una geometría placa / placa bajo condiciones de frecuencia constante (1Hz), un rango de deformación entre 0,01 a 100% y un rango de tasa de corte entre 0 a 100 s-1 a temperatura ambiente [8]. Para el registro y análisis de los datos se utilizó el software RheoCompass.
Ensayo de Citotoxicidad
La evaluación de la reactividad biológica in vitro de los nanogeles fue realizada de acuerdo con la norma ISO-10993-5 [9]. Fibroblastos L929 fueron cultivados en medio DMEM, suplementado con suero fetal bovino al 10%, antibióticos y vitaminas, en cajas de cultivo de 96 pozos, a una densidad de 105 células por pozo, durante 24 horas, a 37 °C y 5% CO2. Extractos de los nanogeles en solución salina estéril 0,9% a una concentración de 0,2 g/mL fueron incubados por 24 horas. Después de la incubación, 100 µL del sobrenadante fueron colocados sobre los fibroblastos y cultivados durante 24 horas, a 37 °C y 5% CO2. La viabilidad celular fue determinada empleando MTT y cuantificado por UV-Vis a 560 nm.
Resultados y discusión
La administración ocular de fármacos para el tratamiento de enfermedades crónicas degenerativas presenta una serie de desafíos desde el punto de vista del diseño de sistemas de entrega. Para el caso de enfermedades del globo ocular, estos deben ser biocompatibles con la conjuntiva y tejidos circundantes, permitir la liberación controlada para reducir los efectos secundarios indeseados y ser económicos para favorecer el acceso a este tipo de tratamientos. Los geles a escala micro y nano son una alternativa para desarrollar sistemas de entrega compatibles debido a su alto contenido de agua [10] y facilidad de escalamiento. Nosotros, propusimos el desarrollo de un sistema de entrega ocular para la liberación de latanoprost biocompatible, de bajo costo y de fácil transferencia tecnología a la aplicación clínica, a partir de un polímero derivado del colágeno, principal componente de la matriz extracelular de tejidos blandos, económico y biocompatible.
Preparación de nanogeles
El método de preparación emulsificación-gelación es ampliamente utilizado para la obtención de tamaños micro y nanométricos, debido a su fácil manejo y altos rendimientos [6]. Sin embargo, existen diferentes factores que afectan el tamaño y eficiencia tanto de la estructura como la encapsulación de los fármacos en los nanogeles, como el polímero seleccionado, su viscosidad, relación de fases (acuosa-oleosa) y método de homogeneización [6]. La Tabla 1 muestra las condiciones utilizadas para la estandarización del tamaño de partículas para la obtención de los nanogeles con mejores propiedades y tamaño.
Los parámetros de proceso que más influyeron en la obtención de tamaños nanométricos fueron las concentraciones de gelatina y de tensoactivo, la amplitud de sonicación (energía) y agitación.
Una mayor concentración de polímero favorece un mayor tamaño de partícula y eficiencia de encapsulación, debido a la rápida solidificación de las partículas, además de un aumento en la viscosidad, lo cual, reduce la porosidad de estos sistemas [11]. Al disminuir la concentración de gelatina al 2,5 % se logró un menor tamaño de partícula, sin embargo, así mismo se obtuvieron bajas eficiencias como se observa en el anexo 4 del material suplementario. La mayor concentración de tensoactivo favorece a reducir el crecimiento de gota de la fase interna -fenómeno de Oswald- presente en estos sistemas heterodispersos, y reducir de esta forma el tamaño de la partícula [12].
Por otra parte, la homogeneización por sonda ultrasónica -es un método de alta energía- permite superar las limitaciones de viscosidad para dispersar la fase interna de la emulsión en pequeñas gotas de tamaño nanométrico que forman los nanogeles tras la reticulación con el GTA a bajas temperaturas [13], razón por la cual se seleccionó una amplitud de 50% en 10 min [14].
Estudio del tamaño de nanogel mediante Microscopía óptica
El tamaño nanométrico de las partículas obtenidas es un parámetro de suma importancia, ya que, favorece la administración de fármacos a nivel oculares debido a que ayudan a minimizar la irritación en el tejido ocular, disminuyen la visión borrosa y mejoran la permeación ocular [15].
En la Figura 1A se puede observar las nanopartículas vistas por microscopio y la distribución de tamaño de los nanogeles (Figura 1B). Se obtuvieron nanogeles con una baja dispersión en la distribución de tamaño, con índices de Polidispersión (PdI) de 0,025, 0,010 y 0,011 respectivamente, con una media de 0,015. Estos resultados son adecuados para la administración de estos sistemas en el ojo, ya que, se reporta que el tamaño adecuado para no generar molestias en los ojos son partículas hasta 10 μm [16].
Rendimiento de los nanogeles
Se obtuvieron rendimientos del 30, 21 y 16 % del proceso de obtención de nanogeles. Estos porcentajes son bajos para los nanogeles desarrollados por un método de alta energía como la Sonicación, el cual es favorable para la obtención de nanopartículas con mayores rendimientos [13]. Sin embargo, estos resultados se atribuyen al complejo proceso de purificación, en donde se requieren largos tiempos de centrifugación y extensivos lavados para lograr una buena separación de las fases y así lograr la eliminación total de la fase oleosa sin presentar pérdida de la fase acuosa [17].
Estudio de liberación in vitro de latanoprost
La figura 2 muestra el perfil de liberación in vitro de latanoprost. Se observó una liberación sostenida del activo durante los primeros ochos días. Siendo, más rápida las primeras 48 horas (mayor pendiente de la gráfica) y luego se observó una liberación más lenta hasta el octavo día del ensayo. Tan solo el 15% de la cantidad total de latanoprost cargado en los nanogeles fue liberado. El fármaco remanente puede ser liberado a medida que los nanogeles se degraden [18].
Cinética de liberación
Las diferentes cinéticas de liberación in vitro de latanoprost se observan en el anexo 2 del material suplementario. El modelo con mejor R2 fue el modelo Korsmeyer Peppas (Tabla 2). Este modelo describe el mecanismo de liberación controlada en sistemas poliméricos que presentan hinchamiento [19]. Por lo cual, se puede inferir que los nanogeles funcionan como sistemas de liberación controlada por la relajación de las cadenas poliméricas que permite generar la penetración del medio de disolución en la matriz, formando poros y erosionándola, la cual, mediante el proceso de difusión hace que el fármaco se liberé constantemente [20].
Eficiencia de Carga
El método de sorción del principio activo permitió obtener una eficiencia de carga entre 46- 58%, la cual, es representativa teniendo en cuenta los bajos rendimientos y capacidad de carga que se obtuvieron en los nanogeles, debido a la concentración de gelatina y su efecto en las propiedades viscoelásticas. Además, se ha encontrado en la literatura que la eficiencia de carga para estos sistemas puede ser baja, dependiendo del material, concentración o agente reticulante empleado [16]. Por ejemplo, se ha reportado en la literatura que un sistema híbrido de nanopartículas de gelatina-HPMC para administrar fármacos agentes reductores de la PIO (Presión intraocular) tuvieron una eficiencia de carga del 58,7 ± 3,8 % [21]. Por otra parte, Cheng y su equipo realizaron un hidrogel de quitosano/gelatina/fosfato de glicerol para la liberación sostenida de latanoprost, obteniendo como resultado una eficiencia de carga del 67,72 ± 4,25% [22].
Espectros FT-IR
La Figura 3 muestra el espectro FT-IR de los nanogeles, se observan señales representativas como la señal en 3278 cm-1, el cual se asocia al enlace N-H de los grupos amina libres en los terminales de la estructura de gelatina libres que no reaccionaron con el glutaraldehído. Las señales en 2925 cm-1 y 2863 cm-1, corresponden a vibraciones del enlace C-H que está presente a lo largo de la cadena de gelatina. La tensión en 1627 cm-1 corresponde a las vibraciones del enlace C=O que se asocia a residuos de glutaraldehído que quedaron sin reaccionar, así como la señal en 1526 cm-1 correspondiente a vibraciones del enlace C=N que está directamente relacionado con la reacción de entrecruzamiento formando el grupo imina [23].
Los espectros infrarrojos de las nanopartículas cargadas con latanoprost (material suplementario anexo 3) no mostraron señales nuevos o eliminación de alguno de los anteriormente descritos. Indicando que los nanogeles son sistemas prometedores para la incorporación de latanoprost al no presentar problemas de interacción o inestabilidad química con la composición del sistema (Gelatina).
Pruebas Reológicas
Las propiedades reológicas de estos sistemas son importantes, pues brindan información sobre el comportamiento del material, su estabilidad en el tiempo y por tanto su vida útil [24]. Se encontró que estos sistemas presentan una viscosidad tipo viscoelástico, en la cual a medida que aumenta la tasa de corte va disminuyendo la viscosidad [25], como se observa en la Figura 4, lo cual, es favorable para la administración y estabilidad de estos sistemas en el ojo.
La figura 4, muestra que la viscosidad es mayor en los hidrogeles con GTA en comparación con el hidrogel sin GTA (color rojo en 2,5% y verde en 5%), lo cual, indica que la reticulación favorece el aumento de la viscosidad haciendo más estables estos sistemas [26]. Por otra parte, se obtuvo con las gráficas una viscosidad general para cada hidrogel de 1879, 6 mPa·s para los hidrogeles de 2,5% y 2110,3 mPa·s para los de 5%.
Figura 4 Propiedades viscoelásticas de los hidrogeles. A. Viscosidad (mPa·s) en función de la tasa de corte de los hidrogeles al 2,5 %. B. Viscosidad en función de la tasa de corte de los hidrogeles al 5 %.
Los módulos de pérdida y almacenamiento de energía de los hidrogeles se observan en la figura 5. Se observó un comportamiento similar en cada réplica iniciando con un módulo de almacenamiento G´ (componente elástico) mayor hasta cierto punto donde hay un cambio y el gel empieza su tendencia a ser un material viscoelástico al aumentar el módulo de perdida (comportamiento viscoso). De igual manera, se observa como al incrementar la concentración de gelatina hay un aumento (hasta 715 Pa) en el módulo de almacenamiento en comparación con los hidrogeles al 2,5% que presenta un máximo de 200 Pa. Mientras que ocurre lo contrario para el módulo de perdida [6].
Por otra parte, se evidencia un punto de cruce definido en cada una, indicando el punto donde G´ y G" asumen el mismo valor, el cual, es representativo de un gel con propiedades viscoelásticas. De esta manera, se analiza de la figura 5A que los hidrogeles cargados con el principio aumentaron el porcentaje de deformación en que se encontraba el punto de gel viscoelástico, mientras que en la Figura 5B se observa como los hidrogeles al 2,5% de gelatina mostraron una disminución en el porcentaje de deformación en un con respecto a los hidrogeles sin principio, concluyendo que la incorporación de latanoprost tiene un mayor impacto sobre las propiedades viscoelásticas en hidrogeles con concentraciones menores, ya que, se va a requerir una menor deformación para lograr esta propiedad viscoelástica que favorece la administración de fármacos oculares [27].
Osmolaridad
Las dispersiones nanogeles cargados a las diferentes concentraciones presentaron una osmolaridad de 262,4 a 285,0 mEq/g. Estos resultados se encuentran en los rangos permitidos para sistemas de administración ocular, reduciendo el riesgo de lisis celular e irritabilidad tisular [28].
Conclusión
En este estudió se logró la optimización de las condiciones de elaboración para un prototipo de nanogel mediante el método emulsificación-gelación, evidenciando que las variables más significativas en la obtención de tamaños nanométricos son las concentraciones de gelatina y tensoactivos empleados, igualmente la amplitud y tiempo de agitación por sonda ultrasónica. Con estas variables de procesos definidas, se pudieron obtener nanogeles cargados con latanoprost, un tamaño y distribución de tamaño, viscoelasticidad y reactividad biológica in vitro (citotoxicidad y osmolaridad) para ser administrados por vía ocular.
