CARLOS JARAMILLO¹, CAROLINA RAMÍREZ M.², PILAR DELGADO³, NÉSTOR PINTO⁴, GERMÁN AGUILERA⁵, FELIPE GUHL⁶

¹Autor para correspondencia: M. Se. Universidad de l.os Andes, Departamento de Ciencias Biológicas, Centro de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Tropical, CIMPAT. Carrera 1 No. 18 A - 10 Bloque A. Fax. 3324540, Tel. 3394949 Ext. 2774. E-mail: cjaramil@uniandes.edu.co

²Microbióloga. Universidad de Los Andes, Departamento de Ciencias Biológicas, CIMPAT. E-mail: carolin-@uniandes.edu.co

³M. Se. Universidad de Los Andes, Departamento de Ciencias Biológicas, CIMPAT. E-mail: mdelgado@uniandes.edu.co

⁴M. Se. Universidad de Los Andes, Departamento de Ciencias Biológicas, CIMPAT. E-mail: npinto@uniandes.edu.co

⁵M. Se. Universidad de Los Andes, Departamento de Ciencias Biológicas, CIMPAT. E-mail: geragui25@hotmail.com

⁶M. Se. Universidad de Los Andes, Departamento de Ciencias Biológicas, CIMPAT. E-mail: fguhl@uniandes.edu.co

La enfermedad de Chagas es exclusiva del continente americano, y se considera la enfermedad parasitaria más importante en América (Worl Bank 1993). Muestra una prevalencia de 16 millones de personas, una incidencia de 200.000 nuevos casos cada año (estadísticas de 1999) y una mortalidad de 50.000 personas por año (OMS). El rn/panosoma cruzí, agente causal de esta enfermedad, es transmitido principalmente por insectos vectores que han mostrado una fuerte estructuración geográfica que puede ser detectada por marcadores morfométricos, citogenéticos e isoenzimáticos (Guhl y Schofield 1996). Igualmente pueden emplearse marcadores moleculares generados por amplificación azarosa de polimorfismos de ADN que permiten determinar la estructura genética de las poblaciones de vectores (Williams et al. 1991; Black et al. 1992). En Colombia, se consideraba que Rhodnius prolixus (Stal) vector principal de esta enfermedad, presentaba dos poblaciones distribuidas en el domicilio y en las palmeras. Moreno et al. (1999), mediante métodos morfométricos y bioquímicos, demostró que no eran dos poblaciones de Rhodnius prolixus, sino dos especies diferentes similares morfológicamente, y definió a los insectos que se encuentran en el ambiente silvestre como una nueva especie, Rhodnius colombiensis. Paralelamente, usando técnicas moleculares (Jaramillo et al. 2001) estableció que no se presentaba flujo genético entre Rhodnius silvestres y domiciliados, corroborando lo hallado por Moreno et al. (1999).

Estudios como los realizados en Rhodnius, evidencian la necesidad de analizar otras especies vectoras a través del análisis de su estructura genética y por tanto del entendimiento del comportamiento de sus poblaciones, con el fin de controlar a mediano y largo plazo los vectores, focalizar los programas de control, y por tanto prevenir la transmisión de la enfermedad de Chagas.

En esta investigación se muestran resultados preliminares sobre la estructura genética de poblaciones de Triatoma dimidiata (Latreille), el segundo vector en importancia en Colombia de la transmisión de la enfermedad. A diferencia de otras especies estrictamente domiciliadas como T. infestans, este insecto se ha encontrado en tres hábitats o ambientes diferentes, uno silvestre (cuevas y rocas), uno peridoméstico (gallineros y camas de animales), y uno doméstico. Se. empleó la técnica de KAPD (Williams el al. 1991), con el fin de detectar variabilidad genética entre las poblaciones silvestre, peridoméstica y doméstica de esta especie y calcular el grado de flujo genético que se presenta entre ellas, para determinar el posible riesgo que representan las poblaciones no domiciliadas en la transmisión de la enfermedad. Este estudio se llevó a cabo en el Centro de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Tropical - CIMPAT. Universidad de Los Andes, Bogotá - Colombia, año 2001.

Recolección de insectos

Los insectos evaluados se capturaron en la vereda Río de Abajo, municipio Boavita del departamento de Boyacá, a 1.970 msnm, 6^o 19' 33.5" N; 72° 37' 10.61" W. Las capturas se realizaron en tres hábitats diferentes: en cuevas (habitat silvestre), en el peridomicilio (gallineros, cocinas, bodegas, camas de animales) y dentro de las viviendas.

Extracción y purificación de ADN

Se retiraron las 6 patas de cada insecto y se sometieron a un proceso de ruptura mecánica en un volumen de 300 ul de "Genomic DNA lysis solution" del kit AquaPure Genomic DNA de BIORAD. Se continuó con el procedimiento recomendado por el fabricante para aislamiento de ADN a partir de tejidos.

Amplificación azarosa de polimorfismos de ADH (RAFD)

Se empleó el kit Ready To Qo RAPD de Pharmacia, rehidratando cada perla con 19 ul de agua destilada y agregando 25 pmol de iniciador. Se dividió el contenido en cuatro tubos, a cada uno de los cuales se le agregó 2 ul de ADN templado, para un volumen final de reacción de 8 ul. Se analizaron 14 individuos silvestres, 10 peridomésticos y 15 domésticos con los iniciadores RTG de Pharmacia 2 y 3 (Tabla 1), con el siguiente perfil térmico: un paso inicial de denaturación a 95.5"C por 5 minutos, seguido de 44 ciclos de 95°C por 1 min, 36°C por 1 min, 72°C por 2 min y un paso final de elongación a 72°C por 7 min.

Visualización de los productos de RAPD

Los productos de amplificación se visualizaron en geles de poliacrilamida al 6%. Posteriormente, se tiñeron con el kit Silver Stain Plus de Pharmacia siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante, empleando la mitad del volumen indicado para la tinción de cada gel.

Análisis de resultados de los RAPD

Se construyeron matrices binarias comparando las bandas más intensas de cada gel e indicando la presencia de una banda como 1 y la ausencia de la misma como 0. Las matrices se construyeron de acuerdo con Welsh eí al. (1992) y se analizaron con los programas SYNTAX (Podani 1993), POPGENE (Yeh eí al. 1999) y RAPDPLOT (Kambhampati eí al. 1992).

Para el análisis, se partió del supuesto de que las tasas de evolución o sustitución son constantes para las poblaciones; es decir, que se encuentran en un equilibrio de Hardy-Weinberg y que por tanto no hay presiones de selección que favorezcan una u otra población o algún genotipo particular.

Los programas RAPDPLOT y POPGENE producen una matriz que contiene las distancias genéticas calculadas usando el índice de similitud de Nei y Li (1985) que se define de la siguiente manera: S= 2NAB / (NA+NB). donde NAB es el número de bandas que comparten los individuos A y B, NA es el número de bandas de A y NB el número de bandas de B.

Dado que los RAPD segregan independientemente y más del 95% de los alelos son dominantes (Williams eí al. 1991), RAPDPLOT emplea una segunda medida que involucra tanto la presencia compartida de una banda como la ausencia compartida. lo que permite tomar ventaja del fenotipo recesivo (o ausencia compartida de una banda). Se estima el número de concordancias M que permite determinar relaciones genéticas entre individuos mediante el cálculo M = NAB/ NT, donde NAB es el número total de bandas compartidas (presentes y ausentes) entre los individuos A y B. y NT es el número total de loci en estudio.

Los programas RAPDPLOT y SYNTAX permiten utilizar el algoritmo UPGMA, introducido por Sneath y Sokal (1973), el cual toma la distancia más pequeña de la matriz de distancias y elabora un cluster con los individuos que tengan esa distancia. Luego calcula la similitud promedio entre las poblaciones y el cluster ya evaluado, generando así una nueva matriz de distancias, repitiéndose el proceso hasta analizar todos los individuos.

Con los 14 individuos silvestres, 10 peridomésticos y 15 domésticos de Triatoma dimidiata evaluados, se observa que no hay un patrón de bandeo definido para cada población (Fig. 1). Se aprecia una homogeneidad en los patrones de amplificación que sugiere una diferenciación genética baja entre las poblaciones de este insecto.

Al realizar un análisis mediante los programas RAPDPLOT, POPGENE y SYNTAX, se obtuvo un dendrograma donde no se define un cluster para cada población, sino que se ve una distribución heterogénea de los individuos de las diferentes poblaciones (Fig. 2).

Al realizar el análisis con POPGENE se obtuvo el valor de Gst (Nei 1973), el cual combina información de múltiples loci en una sola medida de la subestructura poblacional y es un estimativo del Fst o índice de fijación. También se obtuvo el Mm y el porcentaje de loci polimórficos (Tabla 2).

Se calculó el valor de identidad genética y el de distancia genética de Nei entre las poblaciones, tanto para la distancia original de 1973 (Tabla 3), como para la distancia de nei corregida con el algoritmo UPGMA (1978) (Tabla 4). Con ambas medidas se observa que hay una identidad genética alta entre las poblaciones, siendo mayor para las poblaciones silvestre y peridoméstica.

El valor de distancia genética es mayor entre las poblaciones peridoméstica- doméstica y Silvestre-doméstica.

Se obtuvo un dendrograma de las tres poblaciones evaluadas donde se evidencia una diferenciación genética menor entre la población silvestre y la peridoméstica con respecto a la doméstica (Fig. 4), dado que el cluster que agrupa a las dos primeras agrupa a una menor distancia genética.

Con el programa RAPDPLOT se calculó el Fst de Wright (1951), de Weir y Cockerham (1984), y de Lynch y Milligan (1994) (Tabla 5), tanto para las tres poblaciones en conjunto, como para los pares de poblaciones. Para todos los casos, el Nm fue suficiente para mantener homogeneidad genética, y el Fst indicó moderada diferenciación genética.

Los valores de Gst y Fst obtenidos indican que hay una diferenciación genética moderada entre las poblaciones de T. dimidiata; es decir, que hay un intercambio genético entre las poblaciones que permite mantener una heterocigocidad importante. Por otro lado, los valores de Nm (Tabla 5) denotan una migración representativa de individuos por generación suficiente para mantener homogeneidad genética y se muestran como cifras significativamente elevadas si se comparan con valores de Nm descritos para insectos (Slatkin 1985).

Se obtuvo un porcentaje de loci polimórFicos de 94,87%, es decir 37 de 39 loci estudiados (Tabla 2). Esto concuerda con un modelo de efecto Wahlund (Wahlund 1928), en donde la homocigocidad promedio decrece cuando las subpoblaciones se mezclan, es decir, que hay un aumento de heterocigotos y por tanto de loci polimórficos, generando así más alelos en una población.

Puede plantearse que las poblaciones de T. dimidiata estarían encaminándose hacia un proceso lento de domesticación, como ya está establecido para otras especies como T. infestans en países del cono sur o R. prolixus en los Andes o en Centro América. En años recientes, ya se han señalado establecimientos de colonias de T. dimidiata en viviendas urbanas y periurbanas (Schofield et al. 1999). La mayor diferenciación genética de la población domiciliada con respecto a la peridomiciliada y a la silvestre, podría ser consecuencia de una permanencia de los insectos dentro de las viviendas, en donde encuentran nuevas fuentes de alimento, resguardo y mejores condiciones climáticas (Schofield et al. 1999).

- Mediante la técnica de RAPD se obtuvieron patrones de bandeo homogéneos para las poblaciones silvestre, doméstica y peridoméstica de Triatoma dimidiata, sin poder discriminar con los 39 marcadores obtenidos, una u otra población. Esto deja establecer que hay un flujo genético elevado entre las poblaciones, que no permite que se diferencien.

-El Fst y el Nm obtenidos mediante las metodologías de Wright (1978), Lynch y Milligan (1994) y Weir y Cockerhan (1984), son suficientes para mantener una homogeneidad genética entre las poblaciones.

-Las poblaciones no domiciliadas de 7". dimidiata estarían representando un riesgo epidemiológico en la transmisión de la enfermedad de Chagas dada la elevada movilidad de los individuos de las poblaciones no domiciliadas. Sería necesario un monitoreo periódico de la tasa efectiva de migración hacia el domicilio, al igual que una vigilancia y control del peridomicilio, y mejores programas educativos frente a las personas en riesgo de adquirir la enfermedad.

- Se evidencia la importancia de estudiar especies vectoras secundarias en la transmisión de esta enfermedad ya que pueden contribuir significativamente en su transmisión o en la reinfestación de casas tratadas con los insecticidas de acción residual.

- Estudios como éste brindan un beneficio social, económico y científico a la comunidad, ya que permiten conocer el comportamiento de poblaciones de vectores importantes en el país y así mismo, implementar programas de control mejores y más efectivos.

Este proyecto se llevó a cabo gracias al apoyo financiero de Colciencias y el B1D, proyecto Do. 276-2000.

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Recibido: Jun. 30 / 2002 Aceptado: Ago. 16 / 2002