Deteccion de beauvericina en el hongoentomopatogeno Beauveria bassiana mediante el uso de anticuerpos policlonales

Detection of Beauvericin in the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana by using polyclonal antibodies

JORGE W. ARBOLEDA V. ¹, FERNANDO DELGADO B. ², ARNUBIO VALENCIA J. ³

¹ Disciplina de Entomologia, Centro Nacional de Investigaciones de cafe, CENICAFE. Colombia. A. A. 2427 Manizales. E-mail: JorgeWilliam. Arboleda@cafedecolombia.com

² Profesor Titular. Universidad Catolica de Manizales. Manizales, Colombia. A. A. 357 Manizales. E-mail: fdelgado@ucatolicamz.edu.co

³ Autor para correspondencia: Profesor Asociado. Dpto. de Quimica. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.Universidad de Caldas. A. A. 275, Manizales-Colombia. Fax: (68) 8862520. E-mail: arnubio@laciudad.com

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Resumen. El hongo entomopatògeno Beauveria bassiana (Bals.) Vuillemin es una buena herramienta para el control biologico de insectos que atacan cultivos de importancia economica. Este hongo produce una toxina ciclo hexadepsipeptida que muestra actividad biologica como insecticida. El objetivo de este estudio fue producir anticuerpos policlonales que pueden ser utilizados para cuantificacion inmunologica de la produccion de beauvericina en siete (7) aislamientos de B. bassiana (Bb) provenientes de la micoteca de Cenicafe-Colombia. Cultivos liquidos Sabouraud se inocularon con 3,0 X 10⁵ conidios/ml de cada aislamiento de B. bassiana y los extractos se filtraron y se evaluaron a los 7, 9 y 11 dias de crecimiento. Los anticuerpos se obtuvieron a traves de dos aplicaciones intramusculares a conejos de la raza Mueva Zelanda. Las inyecciones contenian 2,5 mg del inmunogeno emulsificado en adjuvante completo de Freund's para la primera y adjuvante incompleto de Freund's para la segunda aplicacion, respectivamente. Las pruebas serologicas utilizadas en este experimento fueron ELISA y Dot - blot. Los resultados mostraron diferencias en la produccion de la toxina entre los siete aislamientos del hongo B. bassiana. Se presentaron picos de produccion de la toxina entre los 9 y 11 dias de cultivo. Los niveles detectados de beauvericina fluctuaron entre 1,16 ug / ul para el aislamiento B. bassiana 9610 y 1.57 ug/ul para el aislamiento B. bassiana 9205. Con esta metodologia se podran seleccionar aislamientos mas eficientes para producir la toxina, los cuales pueden ser incorporados en los programas de manejo integrado de plagas.

Palabras clave: BEA. ELISA. Micotoxina.

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Summary. The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana (Bals.) Vuillemin is a good tool for biological control of insects that attack economically important crops. This fungus produces a ciclohcxadepsipeptide toxin that exhibits biological activity as an insecticide. The objective of this research was to produce polyclonal antibodies (Pabs) that could be used for the immunologicai quantification method in order to quantify of the produccion of beauvericin in seven (7) strains of B. bassiana (Bb) from the collection of Cenicafe-Colombia. Liquid cultures of Sabouraud s medium were inoculated with 3,0 x 10* conidia/ml of each isolate and these extracts were filtered and evaluated at 7, 9 and 11 days of growth. Pabs were obtained through two intramuscular injections in New Zealand white rabbits. The injections contained 2,5 mg of the emulsified immunogen with Freund's complete adjuvant for the first injection and with Freund's incomplete adjuvant for the second. The serological tests used in this experiment were ELISA and Dot-blot. The results showed differences in toxin produccion among seven isolates of the fungus B. bassiana. All isolations showed a peak of produccion between 9 and 11 days of culture. The levels of the beauvericin detected fluctuated between 1,16 ug/ul for isolate B. bassiana 9610 and 1,57 ug/ul for isolate B. bassiana 9205. This methodology will permit selection of the strains most efficient in toxin produccion, which could be incorporated into integrated pest management programs.

Key words: BEA. ELISA. Mycotoxin.

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Introducciòn

Actualmente se utilizan en el pais diferentes aislamientos del hongo Beauveria bassiana (Bals.) Vuillemin en el control biologico de insectos plaga como la broca del cafe Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Scolytidae) (Bustillo et al. 1998). El potencial de este microorganismo en el control biologico de insectos ha permitido su inclusiòn en diversos programas de manejo integrado de plagas que atacan cultivos de importancia econòmica en el pais (Ferron 1981). La accion del hongo sobre el insecto es facilitada principalmente por la accion de una gran variedad de metabolicos secundarios producidos a lo largo del proceso de infeccion. El proceso patogenico del hongo se inici a en la cuticula del insecto con la germinacion de los conidios y la produccion de hifas invasoras, los cuales penetran los tejidos a traves de los intersticios y partes blandas del insecto (Castellanos 1997) dando inicio de esta forma a la actividad enzimatica degradativa de la cuticula (Paterson et al. 1994; Delgado et al. 2001). Las hifas se ramifican, colonizan y Megan hasta la cavidad hemocelica del insecto, donde se produce una masa micelial por el crecimiento del hongo. En muchos casos, el insecto puede ser colonizado totalmente por el hongo (Fig. 1). Ademas. se liberan toxinas, las cuales estan implicadas en bloquear el desarrollo fisiològico y cansar la muerte del insecto (Paterson et al. 1994; Castellanos 1997). Estas determinan la gravedad de la enfermedad producida y la capacidad del hongo para bloquear los mecanismos de respuesta inmune del insecto (Vey et al. 1985; Ignoffo y Mandava 1988; Eyal et al. 1994; Abbas et al. 1995).

Las micotoxinas son metabolicos fungicos secundarios que hacen parte de los mecanismos de infeccion y pueden dar lugar a una respuesta toxica en diferentes organismos. Ellos son producidos por una serie de reacciones consecutivas, las cuales son catalizadas por enzimas intermediarias del metabolismo primario (Volcy y Pardo 1994). Los metodos mas utilizados para la identificacion y cuantificacion de analitos de interes biologico como las micotoxinas son la Cromatografia de Gases (GC), la Cromatografia Liquida de Alta Eficiencia (HPLC). y la Espectrometria de masas (MS), entre otros (Uribe et al. 1997). Estas metodologias son por lo general muy costosas y requieren de personal altamente calificado en el manejo del instrumental (Wilson el al. 1998).

En Colombia, se han realizado pocos estudios sobre la accion y la produccion de las micotoxinas como beauvericina por parte del hongo B. bassiana. Por esto, se hace necesario desarrollar metodologias sensibles, rapidas, confiables, economicas y de facil aplicacion que permitan cuantificar la produccion de esta micotoxina por los diferentes aislamientos del hongo B. bassiana y relacionarlo con la patogenicidad del hongo sobre los insectos plaga (Smith et al. 1981; Castellanos 1997). En este estudio se aplico una metodologia para producir anticuerpos policlonales contra beauvericina (BEA), para detectar y cuantificar la presencia de la toxina en cultivos liquidos del hongo B. bassiana.

Materiales y Metodos

Material Biologico

Se utilizaron conejos de raza Nueva Zelanda de un año de edad y con un peso aproximado de 5 kg. Los conejos se sangraron antes de ser inoculados con el antigeno, y el suero se utilizo como blanco para las diferentes pruebas inmunologicas.

Preparation del inmunogeno

El inmunogeno empleado para la produccion de anticuerpos policlonales se preparo disolviendo 2,5 mg de la micotoxina beauvericina (Sigma chemical Co. B 7510) (Sigma 2001), con 1,5 ml de una solucion Etanol: Agua en proporcion 2:1. Posteriormente, esta solucion se mezclo con 3 ml de adjuvante completo de Freund's para la primera aplicacion y adjuvante incompleto para la segunda. Finalmente, la solucion se emulsifico durante 5 min.

Inoculacion de los conejos

Una vez preparada la solucion del inmunogeno se procedio a realizar la primera inoculacion por via intramuscular inyectando 0,7 ml del antigeno en tres partes diferentes del cuerpo del conejo. Posteriormente, los conejos se trasladaron al bioterio bajo condiciones normales de alimentacion y cuidado. La segunda inoculacion a los conejos se llevo a cabo a los 28 dias de forma similar a la inoculacion inicial con el objeto de buscar una produccion masiva de los anticuerpos contra la toxina.

Obtencion del antisuero

Despues de 10 dias de la ultima inoculacion, los conejos se introdujeron en un cajon de madera de modo que el animal quedara inmovil. Se ubicaron canales sanguineos de buena irrigacion en ambos lados de los ojos y se introdujeron en ellos canulas de vidrio con el fin de colectar la sangre; tambien se extrajo sangre realizando pequeñas incisiones en las orejas del conejo con la ayuda de un bisturi esteril. En ambos casos, el area fue cuidadosamente desinfectada con una solucion de etanol al 70%. La sangre colectada se dejo a temperatura ambiente durante 24 h y posteriormente se centrifugo a 14. 000 rpm durante 20 min. El antisuero obtenido se almaceno en alicuotas de 50 ul a -80°C y se uso como fuente de los anticuerpos policlonales contra beauvericina (AntiBEA).

Reactivacion de los aislamientos del hongo Beauveria bassiana

Los aislamientos de B. bassiana Bb 9205, Bb 9620, Bb 9601. Bb 9616 y Bb 9618, Bb 9610 y Bb 9010 provenientes de la micoteca perteneciente al Centro Nacional de Investigaciones de Cafe. CENICAFE - Colombia, se reactivaron en medio solido Sabouraud complementado con broca macerada al 0,4%. Todos estos aislamientos se seleccionaron por sus diferentes grados de patogenicidad sobre adultos de la broca del cafe Hypothenemus hampei (Tabla 1).

Obtencion de los cultivos liquidos del hongo Beauveria bassiana

A erlenmeyers de 500 ml se adicionaron 200 ml del medio de cultivo liquido Sabouraud conteniendo 0,4% de cuticula de broca. Posteriormente, el medio se esterilizo por autoclave a 121ºC y 15 libras de presion durante 15 min (Kucera 1971; Jegorov et al. 1998). La inoculacion de los hongos en este medio se hizo a partir de una solucion madre de 1 x 10° conidios /ml preparada en 10 ml de agua conteniendo tween 80 al 0,1% y glicerol al 0,25% (Velez et al. 1997). A partir de esta solucion se realizaron diluciones seriadas hasta obtener una dilucion de 10^-4 tres recipientes se inocularon con los diferentes aislamientos de B. bassiana a una concentracion de 3 x 10⁵ conidios / ml. Los medios de cultivo se dejaron durante 11 dias en agitacion rotacional a 110 rpm a 27± 1° C y HR 80%.

Procesamiento de las muestras

Los cultivos liquidos se colectaron a los 7, 9 y 11 dias de crecimiento, y se filtraron al vacio utilizando papel Whatman #1. El extracto liquido se centrifugo a 15.000 rpm durante 30 min. y la toxina presente en el sobrenadante se concentro haciendo uso de membranas con un punto de exclusion de 3 Kda (Buchawaldt y Jensen 1991; Jegorov et al. 1998; Kershaw et al. 1999).

Preparacion de la solucion patron de beauvericina Se preparo una solucion madre disolviendo 500 ug, de beauvericina comercial (Sigma Chemical, C₄₅H₅₇N₃O₉; masa molecular 784 y 97% de pureza), en 1 ml de metanol puro. Posteriormente, se realizaron diluciones para ser usadas como patrones tanto en la prueba Dot-blot, como para la obtencion de la curva de calibracion a usar en la metodologia de ELISA.

Deteccion de la micotoxina mediante la metodologia de Dot-blot

La presencia de beauvericina en los extractos liquidos del hongo se llevo a cabo aplicando alicuotas de 5 ul de los cultivos liquidos filtrados y los patrones de beauvericina, sobre una membrana de nitrocelulosa, la cual habia sido tratada previamente sumergiendola en una solucion de metanol al 20% durante 30 min, y secada a 50°C. Seguidamente, la membrana se dejo durante 30 min en solucion de bloqueo (solucion amortiguadora Trissaiino (TBS) conteniendo gelatina al 1%).

Despues, la membrana se lavo con agua destilada esteril (ADE) y se incubo con la misma solucion amortiguadora conteniendo el primer anticuerpo (AntiBEA) a una concentracion de 10 ul/ml, durante 1 h a temperatura ambiente. Posteriormente, se realizaron dos lavados de 15 min cada uno con solucion amortiguadora Trissaiino mas TWeen 20 al 0,1 % (TTBS), y un lavado con TBS. Paso seguido, la membrana se incubo nuevamente durante 1 h a temperatura ambiente con 5 ul del segundo anticuerpo (Antirabbit conjugado a la enzima peroxidasa) disuelto en 30 ml de la solucion de bloqueo. Cumplido este tiempo, se repitieron los mismos tres lavados como en el paso anterior. Finalmente, la presencia de la toxina sobre la membrana fue revelada, sumergiendola en una solucion preparada con 30 ml TBS, a la cual se le adicionaron 50 ul de peroxido de hidrogeno y 30 mg de 4-cloro-1 naftol disuelto en 10 ml de metanol.

Cuantificacion de la micotoxina mediante la metodologia ELISA (Enzyme - Linked Inmunosorbent Assay)

Se aplicaron 200ul de cada extracto a pozos de un microplato ELISA para su fijacion durante 24 h a 8°C (Ball 1974). Posteriormente, el plato se lavo tres veces con solucion de TTBS (2) y con TBS (I), y se procedio a bloquear los pozos durante 1 h adicionando 200 ul de Tween 20. Se repitieron los tres lavados de igual forma como en la etapa anterior, y se continuo con la incubacion del plato por 2 h a 37°C con 700 ul del primer anticuerpo AntiBEA) disueltos en 30 ml de solucion de bloqueo. De nuevo se repitieron los tres lavados con TTBS (2) y con TBS (1) y se incubo el plato por 2 h a 37°C con 5 ul del segundo anticuerpo (Antirabbit conjugado a la enzima peroxidasa) disuelto en 30 ml de solucion de bloqueo.

Finalmente, se lavaron nuevamente los pozos y se revelo, adicionando a cada pozo 200 ul de una solucion de 1 mg de Tetrametilbenzidina (TMB) disuelta en 10 ml de TBS, conteniendo 5 ul de peroxido de H₂0₂. Finalmente, se llevò a cabo la lectura de absorbancia en un lector ELISA a una a de 490 nm. La estimation de la concentracion de beauvericina (ug/ul) en cada una de las muestras se hizo por interpolacion en una curva patron con concentraciones conocidas de la toxina (Datos no mostrados).

Analisis

estadisticoA los resultados obtenidos de los analisis Dot-blot y ELISA se les aplico estadistica descriptiva.

Resultados y Discusion

Metodologia Dot-Blot

Con el objetivo de evaluar la especificidad de los anticuerpos policlonales producidos, se procedio a aplicar, sobre membranas de nitrocelulosa, diferentes cantidades de una solucion patron de beauvericina. A partir de los 5 min de aplicada la solucion de revelado sobre las membranas de nitrocelulosa se observaron cambios en el sitio donde se aplicaron los patrones de la toxina. Los puntos de color azul aparecen por la accion enzimatica de la enzima peroxidasa sobre el sustrato 4-cloro-1-naftol (Sigma 2001). Mo se detectaron manchas en aquellos puntos donde se aplicaron soluciones blanco sin la toxina. El resultado anterior indica que mediante la metodologia utilizada, fue posible la obtencion de anticuerpos policlonales contra la micotoxina, y ademas corrobora la presencia y utilidad de dichos anticuerpos AntiBEA en la deteccion y cuantificacion de beauvericina proveniente de aislamientos de B. bassiana a traves de la prueba serologica Dot-blot (Fig. 2). Manchas de caracteristicas iguales aparecieron sobre las membranas de nitrocelulosa cuando se probaron cultivos liquidos de los hongos Bb 9620 y Bb 9205 correspondientes a diferentes dias de crecimiento. Igualmente, se pudo observar mayor intensidad en los puntos correspondientes al dia 9 de crecimiento del aislamiento Bb 9205 (Fig. 3), lo cual indica una mayor produccion de la toxina a este tiempo, similar a los resultados encontrados por Uribe et al. (1997) en el aislamiento Bb 9401 haciendo uso de cromatografia liquida de alta eficiencia (HPLC).

Metodologia ELISA

A traves de esta metodologia se observo que los valores mayores de produccion de beauvericina se presentaron en los aislamientos Bb 9205; con pico de produccion de la toxina de 1,567 ug/ul al dia 9, y en el aislamiento Bb 9010 con un pico de produccion al dia 11 de 1,542 ug/ul. Los valores mas bajos de produccion de esta toxina se presentaron en los aislamientos Bb 9616 al dia 9 y Bb 9610 al dia 7 con 1,083 ug/ul y 1,164 ug/ul, respectivamente. En general para todos los aislamientos los valores de produccion de toxina fueron muy similares al dia 7, fluctuando entre 1,333 ug/ul para Bb 9620 y 1,164 ug/ul para Bb 9610, mientras que la produccion estimada de toxina para los dias 9 y 11 de crecimiento en todos los aislamientos mostraron valores mas contrastantes (Tabla 2). Otros estudios como los de Genthner y Middaugh (1994) y Gupta et al. (1995) confirman la variabilidad que existe en la produccion de beauvericina por diferentes aislamientos del hongo.

Aspectos como el medio de crecimiento, el tiempo de obtencion, la cantidad de micelio producida y el metabolismo del hongo entre otros, influyen notoriamente en la produccion de las toxinas (Rombach 1988).

La mayoria de los estudios de toxicidad con beauvericina han sido realizados probando su actividad biologica contra insectos. Sin embargo, estudios recientes llevados a cabo in vitro, muestran alta toxicidad de esta toxina hacia murine y lineas celulares humanas (Di Paola et al. 1994; Ojcious et al. 1999). Asi mismo, a este ciclopeptido se le atribuyen propiedades insecticidas y antimicrobiales (Thakur y Smith 1997; Dev y Koul 1997; Milanonta et al. 2000).

Los resultados encontrados en este estudio muestran una mayor produccion de beauvericina por parte del aislamiento Bb 9205m, el cual es usado actualmente para el control biologico de la broca del cafe (Bustillo et al. 1991). La curva de produccion de la toxina para este aislamiento muestra que el hongo inicia la exportacion de la toxina hacia el medio liquido a partir del dia 5 de crecimiento (Datos no mostrados). Esto sugiere que dicho peptido juega un papel importante en la patogenicidad de B. bassiana sobre el insecto, determinando ai parecer la real capacidad del hongo para afectar de manera negativa al insecto y bloquear sus mecanismos de respuesta hasta provocarle la muerte (Vey et al. 1985; Ignofo y Mandava 1988; Eyal et al. 1994). En este estudio se encontro que existe una estrecha relacion entre el contenido de la toxina en el medio de cultivo y la patogenicidad de cada uno de los aislamientos de B. bassiana que fueron analizados (Velez et al. 1998) (figura 4). Zacharuk en 1973, con resultados similares, concluyo que la toxina causa en el hospedero degeneracion progresiva de los tejidos, cambios estructurales de las membranas y deshidratacion. Asi mismo, durante la patogenesis se evidencian cambios en la actividad electrica de los nervios causada por el incremento del consumo de oxigeno en un intento del insecto por restablecerse (Evlakhova y Rakitin 1968). Zizca y Weiser (1993) probaron "in vitro" el efecto de la beauvericina sobre larvas de Culex pipiens, encontrando que aun con bajas concentraciones de la toxina (0,1 mg / ml) aplicadas topicamente sobre el insecto se obtiene una morciendo uso de inmunoensayos basados en los anticuerpos policlonales (AntiBEA) producidos. Hasta la fecha se han desarrollado numerosos metodos para detectar micotoxinas especialmente en alimentos (Wilson et al. 1998); en contraste con los pocos estudios sobre metabolicos producidos por hongos entomopatogenos usados como micoinsecticidas, micoherbicidas y/o micoparasitos (Strasser et al. 2000; Vey et al. 2001).

La metodologia utilizada en el presente estudio permitira rastrear el metabolico toxico en una amplia gama de muestras biologicas, identificar las condiciones que regulan la produccion de la toxina, apoyara el estudio de las propiedades de la toxina a nivel celular en el insecto y determinara si este tipo de metabolico tiene accion insecticida, nematicida, antimicrobiana o citotoxica. De igual manera, esta metodologia se puede utilizar como diagnostico para profundizar en el modo de accion del metabolico toxico (destruccion de membranas, inhibicion de ATPaas, mitosis o citoquinesis) sobre insectos plaga (Strasser et al. 2000) con el fin de establecer criterios de seleccion de cepas del hongo B. bassiana que sean mas eficientes para el control biologico de plagas, apoyando de esta forma la produccion de formulaciones y la incorporacion del hongo en programas de manejo integrado de plagas.

Estos resultados constituyen una ayuda valiosa en la busqueda de moleculas bioactivas de interes entomologico y muy especialmente de genes que puedan ser utilizados en el desarrollo futuro de material de cafe resistente, mediante la transformacion genetica del cultivo.

Conclusiones 

- Se logro la deteccion y cuantificacion de la toxina beauvericina (micotoxina de interes entomologico), en cultivos liquidos provenientes de diferentes aislamientos de B. bassiana, mediante la aplicacion de pruebas serologicas (Dot blot y ELISA) basadas en la produccion de anticuerpos policlonales.

- Los aislamientos del hongo B. bassiana que fueron evaluados produjeron, bajo condiciones de cultivo en medio liquido, niveles diferentes de la toxina, lo cual podria reflejar diferencias geneticas importantes o diferencias en su especificidad hacia el insecto hospedero. En virtud de lo anterior, la concentracion de la toxina podria ser incorporada como un nuevo criterio de seleccion de aislamientos del hongo B. bassiana, en la busqueda de formulaciones mas eficientes para el control biologico de la broca del cafe.

Agradecimientos

El presente estudio se realizo gracias al apoyo financiero del Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnoiogia "Francisco Jose de Caldas" COLCIENCIAS y la federacion Nacional de Cafeteros a traves de su Centro National de investigaciones de Cafe CENICAFE. Los autores tambien agradecen a la Universidad Catolica de Manizales por su colaboracion y a la Universidad de Caldas por la asistencia tecnica y asesoria en la produccion de los anticuerpos policlonales.

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Recibido: Abr. 22 / 2003 Aceptado: Oct. 29/2003