Introducción

El hongo entomopatógeno, Beauveria bassiana (Bálsamo) Vuillemin ha sido ampliamente usado como controlador biológico de insectos (Ferrón 1978; Charnley 1991), especialmente de la broca del café, Hypothenemus hampei (Ferrari).

B. bassiana se encuentra naturalmente infectando H. hampei en casi todas las regiones de Colombia y experimentos, llevados a cabo en Cenicafé, han demostrado que el control del insecto en campo es posible empleando dosificaciones de 1x10¹⁰- y 1x10¹² esporas por árbol, las cuales pueden llegar a causar mortalidades entre 70-95% en las poblaciones de broca, dependiendo de las condiciones de cultivo y ambientales que se presenten (Posada 1998). Sin embargo, el uso de esta concentración de esporas es costosa y una de las formas de reducir estas dosificacionesaltas es aumentando la patogenicidad de las cepas de B. bassiana. De esta forma sería posible reducir la dosis de esporas requerida para controlar el insecto. Por otra parte, la mortalidad del insecto se lograría en un tiempo más corto, disminuyendo el daño que causa el insecto en los cafetales.

En general, los experimentos de control biológico empleando entomopatógenos han originado frecuentemente resultados inconsistentes en cuanto a la estabilidad de la formulación y la lentitud en causar la mortalidad, en comparación con los insecticidas químicos, lo que ha detenido el desarrollo comercial de estos productos; debido a esto, las consideraciones acerca de la sostenibilidad de un hongo entomopatógeno con propósitos comerciales inevitablemente conhleva a la posibilidad de mejorar su desempeño como biocontrolador.

El gen de la proteasa Pr1 de M. anisopliae ha sido donado y expresado en M. anisopliae mejorando su actividad como biocontrolador (St. Leger et al. 1996). Los genes pr1J (proteasa) y ste 1 (esterasa), que también han sido donados, están involucrados en los procesos de infección y patogenicidad del entomopatógeno M. anisopliae. El propósito de este estudio fue determinar si B. bassiana transformada con los genes pr1A, pr1J y ste 1 incrementa su patogenicidad contra la broca del café.

Los genes pr1A, pr1J y ste 1 se introdujeron mediante transformación genética en B. bassiana cepa Bb9205 monoespórica con el fin de incrementar la actividad proteolítica y esterolítica de la cepa. Las cepas transformantes Bb9205-pr1A, Bb9205-pr1J y Bb9205-ste 1 se evaluaron a nivel molecular, enzimático y de su actividad biocontroladora contra H. hampei en condiciones de laboratorio. Se comprobó que la expresión constitutiva de la proteasa pr1A en B. bassiana cepa 9205 mejora su patogenicidad contra la broca del café. Adicionalmente, el único transformante Bb9205-ste 1 obtenido presentó una disminución significativa en el tiempo de mortalidad de la broca.

Materiales y Metodos

Entomopatógeno Beauveria bassiana

La cepa 9205 de Beauveria bassiana fue originalmente aislada de Diatraea saccharalis (F.) (Lepidoptera; Pyralidae), y conservada dentro de la colección de hongos entomopatógenos de Cenicafé. Este entomopatógeno se cultivó en agar sabouraud dextrosa (SDA) y medio Samsinakova (2,3% sacarosa, 2,5% almidón, 2,5% extracto de maíz, 0,5% NaCl, 0,2% CaCO₃ y 1.5% agar), mantenido a 26°C durante 15 a 30 días.

Vectores de transformación

Los genes pr1A y pr1J que codifican para proteasas del tipo de las subtilisinas y el gen ste 1 codificador de la esterasa, aislados de M. anisopliae, fueron suministrados a Cenicafé por el Dr. Raymond St. ¡eger (Department of Entomology University of Maryland, USA). Los códigos de acceso al “Genbank”, para cada uno de los genes utilizados se presentan a continuación; Subtilisin-like serine protease pr 1A [Metarhizium anisopliae var. acridum AJ251925; Subtilisin-like protease pr1J gene. exon 1- 2 [Metarhizium anisopliae var. anisopliae AJ251922 y Esterase ste1 (ste 1 gene) [Metarhizium anisopliae var. anisopliae] AJ251924. Cada uno de estos genes había sido previamente donado en el plásmido Bluescript (pBS) (Stratagene. La Jolla, CA) y para esta investigación se subclonaron individualmente en el plásmido pBarGPE1, el cual fue obtenido del Fungal Cienetic Stock Center. (Department of Microbiology, The University of Kansas Medical Center, USA).

El plásmido pBarGPE1 se escogió como plásmido de transformación ya que contiene el gen bar que confiere resistencia al herbicida glufosinato de amonio, bajo el control del promotor para la biosíntesis del triptofano-trpC; además, posee un gen de resistencia a ampicilina. y un sitio de donación múltiple bajo el control del promotor ghiceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa-gpdA. Cada uno de los genes de interés se clonaron en este últinio sitio.

Obtención de protoplastos

Esporas de la cepa monoespórica Bb9205 logradas a partir de un cultivo del hongo en medio SDA. mantenido a 26°C por 15- 30 días, se resuspendieron en ‘TWeen al 0,02% y se transfirieron a un erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de medio de cultivo líquido de saboraud dextrosa, suplementado con 0,1% de extracto de levadura, el cual se mantuvo en agitación a 110 rpm durante 36 h. De esta forma se obtuvo micelio joven, el cual se filtró utilizando Miradloth® (Calbiochem, Alemania), se lavó tres veces con agua destilada estéril y una vez con STC (sorbitol 1,2 M, tris 10 min y CaCl₂ 20 min). El micelio se incubó en 20 ml de solución enzimática Isorbitol 1,2M, MES 20 min, 0,8% de Novozyme 234® de Trichoderma harzianum (Sigma. St Louis, MO) y 0,35% de ß- glucuronidasa de Helix pomatia (Sigma), con una actividad de 400.000 U/substrato]. Se evaluaron dos temperaturas distintas, 37°C y temperatura ambiente (+ 26°C). durante 4 h. Adicionalmente se preparó una solución que tenía el doble de la cantidad de enzimas y se colocó a temperatura ambiente. La producción de protoplastos se monitoreó por observación al microscopio a intervalos de una hora. La solución enzimática con protoplastos se filtró usando Miracloth® para eliminar los restos de micelio sin degradar. Posteriormente, la solución se centrifugó a 3.450 rpm durante 10 minutos a 4°C, y se lavó dos veces adicionando 15 ml de STC. Finalmente, los protoplastos se resuspendieron en 800 µl de STC. se cuantificaron utilizando un hemocitómetro, obteniendo una concentración promedio de 3 x 10⁷ protoplastos/ml, los cuales se mantuvieron en hielo hasta su uso.

Transformación de protoplastos de B. bassiana

La transformación de B. bassiana cepa Bb9205 monoespórica se llevó a cabo con cada uno de los vectores de proteasas pBarGPE1—pr1A, pBarGPE1—pr1J y esterasa pBarGPE1—ste1.

Se emplearon dos metodologías de transformación, polietilenglicol (PEG) (St. Leger et al. 1996) y electroporación (St. Leger et al. 1995) para transformar la cepa Bb9205, usando para ambas metodologías, la resistencia al herbicida glufosinato de amonio como agente de selección. Para la selección de colonias transformadas se determinó previamente la concentración inhibitoria del herbicida glufosinato de amonio de acuerdo con el rango de sensibilidad al glifosato de protoplastos de B. bassiana sin transformar.

Análisis molecular de los transfomantes

En cada una de has colonias transformadas con los vectores pBarGPE1-pr1A, pBarGPE1- pr1J y pBarGPE1-ste 1, se verificó la presencia del gen marcador bar y de los genes -pr 1A, -pr1J y -ste 1, respectivamente, mediante su amplificación por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Para esto, se extrajo ADN de cada una de las cepas transformadas crecidas en medio con herbicida, la extracción de ADN se realizó siguiendo eh protocolo descrito por Jürgen et al. (2001). Los genes de interés se amplificaron con reacciones de PCR en un volumen de 25 µl, que contenían 20 ng de ADN fúngico, 1OX PCR buffer, 25 µM de cada oligonucleotido (específicos para la amplificación de cada uno de los genes), 2 min de deoxinucleotidos, 2.5 min de MgCl₂ y 1 U de Taq DNA polimerasa. Las reacciones se incubaron en un termociclador. siguieron un ciclo de denaturación inicial de 95°C por 5 min. 94°C por 1 min seguido de 40 ciclos de alineamiento a diferentes temperaturas según el caso (55. 60 y 65°C) por 1 min, extensión a 72°C por 1 min, denaturación a 94° C por 1 min y un ciclo final de extensión a 72°C por 5 min.

El gen pr 1A se amplificó utilizando las secuencias de oligonucleótidos pr1A F: 5’GCT GCC CCT GCC ACC AT3’ y pr 1A R: 5’TAC GCG CCC GAT AAC AT3’, los cuales se unen en las posiciones 122 y 1.470 de la secuendia del gen pr1A. Estos oligonucleótidos se usaron en la reacción de amplificación a una concentración de 12,5 µM y una temperatura de alineamiento de 55°C.

Para la amplificación del gen pr1J se probaron dos temperaturas de alineamiento 60 y 65° con el fin de incrementar las condiciones de astringencia en la reacción de FCR. Las secuencias de oligonucleotidos utilizadas fueron pr1JF: 5’CTG GGT TCG GGA TGT TCA AGT G 3’ y pr1JR: 5’TGC CAG GAG CGA GGG ACA AGA C 3’. los cuales se unen en las posiciones 204 y 1.046 de la secuencia del gen pr1J.

El gen ste 1 se amplificó utilizando las secuencias de oligonucleótidos: ste1F: 5’TAC GCC GAC GCA TCC ACC AAG AAA 3’ y ste 1R: 5’ TAT ATG CTG CCG GGG AAG GAT GT 3’, los cuales se unen en las posiciones 173 y 1.169 de la secuencia del gen ste 1, la reacción fue llevada a cabo siguiendo las condiciones de PCR inicialmente descritas con una temperatura de alineamiento de 55°C.

Para la amplificación del gen bar se modificó la reacción de PCR, se probaron diferentes concentraciones de magnesio 1,0 min, 1,5 min y 2,0 min. Se aumentó la temperatura de alineamiento a 65°C, para incrementar la astringencia y hacer mas específica la amplificación. Las secuencias de oligonucleótidos utilizados en esta reacción fueron bar F: 5’ATG CGC CCA GAA CGA CGC CC3 y bar R: 5’AGA TCT CGG TGA CGG GCA GGA C 3’, los cuales se unen en las posiciones 160 y 709 de la secuencia del gen bar.

Se seleccionaron las colonias que tenían tanto el gen bar como el gen de interés y se determinó si expresaban las respectivas proteínas.

Ensayos de actividad enzimática

Los niveles de proteasas totales producidas por las colonias transformadas y no transformadas se cuantificaron usando ensayos de actividad enzimática.

Se colectaron esporas de 15-30 días con germinación mayor del 90% de cepas sin transformar y transformadas con los genes pr 1A y pr1J. Se utilizaron, para inocular a una concentración de 1x10⁸ esporas/ml, erlenmeyers de 125 ml con 25 ml de medio mínimo (0,1% KH₂p0₄ 0,05%, MgSO₄), suplementado con 1% (p/v) de quitina y quitina más 2% de N-acetyl glucosamida (NAG). Se incubaron los cultivos en agitación a 110 rpm, 28°C durante 60 h. Cada 12 horas se tomó una muestra de 250 µl, se centrífugó y se midió la actividad proteolitica sobre el peptido sintético succinil-(alanil) 2-prolil-fenilalanina (pNA: p-nitroanilide) (Sigma), el cual fue preparado diluyendo 3,2 mg de este substrato en 5 ml de dimetil sulfoxido (DMSO) siguiendo la metodología descrita por St. Leger et al. (1994). Para hacer las lecturas se tomaron 10µl del medio de cultivo de los hongos previamente centrifugado y a éste, se le adicionaron 90 µl de buffer Tris, HCl 0,1 M a pH 8,0 y 8 µl de substrato 1 min. Las muestras se colocaron en microplatos y se midió la cantidad de sustrato degradado a los 60 minutos por reacción colorimétrica en un espectrofotómetro modelo 3550 UV (Bio-Rad) a 405&.

Para observar la actividad enzimática proteolítica específica de las cepas transformadas por isoelectroenfoque (IEF), se tomaron 23 ml de medio de la cepa control b92O5 sin transformar y de transformantes Bb9205-pr 1A, creciendo en medio mínimo con quitina y medio mínimo con quitina más NAG después de 72 h.

Los cultivos se filtraron a través de papel filtro Whatman 1 y se concentraron por ultracentrifugación.

Para la ultracentrifugación se utilizaron unidades de ultrafiltración Centricon para 15 ml con membranas de exclusión de 10Da (Amicon) en los cuales se colocó el cultivo filtrado y se centrifugó a 1.800 rpm varias veces hasta completar los 25 ml de muestra, luego se lavó dos veces adicionando 10 ml de agua destilada y centrifugando nuevamente. Este extracto enzimático se transfirió a unidades Centricon para 2 ml (Amicon) en donde se centrífugó por 2 h a 1.800 rpm obteniendo finalmente 500 µl de extracto enzimático concentrado.

Alícuotas de 2 µl de estos extractos concentrados se aplicaron a un gel hecho con una mezcla de polimerización consistente de una solución anfolito-monómero (5,5 ml agua destilada deionizada, 2 ml acrilamida 24,25% —bis acrilamida 0,75%, 2 ml glicerol 25%, 0,5 ml anfolito 3/10 Bio-lyte). la mezcla fue desgasificada por 4 min, luego se adicionó la solución de catálisis (15 µl de 10% persulfato de amonio, 50 µl de 0,1% riboflavina 5’ fosfato (FMN), 3 µl N, N, N, N’, tetramethylethylenediamine TEMED). Las proteínas fueron separadas así: 100V por 15 min, 200V por 15 min, 450V por 1 h en una mini IEF cell model 111 (Bio-Rad). La actividad proteolítica de los transformantes se visualizó al poner en contacto el gel lEl° zymograma de proteasas con un film de radiogratia. el cual viene recubierto de una película de gelatina, las proteasas presentes en el gel hidrolizaron la gelatina en el fllm, y se observó un halo transparente (Bidochka y Khachatourians 1988).

Para observar la actividad enzimática esterolítica se siguió la metodología descrita por Peterson y Bridge (1994).

Pruebas de patogenicidad en condiciones de laboratorio

Para determinar la patogenícidad de las cepas, en condiciones de laboratorio, se utilizaron concentraciones de 1 x 10⁵ y 1 x 10⁶ esporas/ml y se siguió la metodología descrita por Vélez et al. (1997). El experimento constó de cuatro tratamientos por cada una de las cepas: Bb9205 no transformada Bb9205-pr 1A y Bb9205-ste 1 transformadas, más el testigo (brocas sin hongo). Cada tratamiento contenía cuatro repeticiones y 15 individuos por repetición, para un total de 60 brocas por tratamiento. Se realizaron tres réplicas del experimento.

La mortalidad de las brocas se evalué diariamente después de la inoculación durante 15 días. Las variables evaluadas en el experimento fueron mortalidad causada por el hongo (PMBb), mortalidad por otras causas (POC) y mortalidad por contaminantes (PMC) expresados en porcentaje a un nivel de significancia del 5%. Se determinaron las diferencias en el tiempo de mortalidad para cada cepa.

Análisis estadísticos

Para el análisis de datos de las pruebas de patogenicidad de las cepas transformadas se compararon los tratamientos entre sí y el control sin transformar mediante un análisis de varianza y se establecieron diferencias a través de pruebas de rangos múltiples de Duncan a un nivel de significancia del 5% mediante el programa SAS.

Resultados

Obtención de la cepa Bb9205 monoespórica

A partir de un cultivo multiespórico se obtuvieron 14 colonias monoespóricas, de las cuales se seleccionaron las 5 primeras que esporularon y tuvieron porcentaje de germinación mayor del 90%, para evaluar su patogenicidad contra la broca del café; para estas pruebas se usó una dosis de esporas de 1 x 10°esp/ml (tabla 1). Los aislamientos monoespóricos presentaron potenciales patogénicos que variaron entre el 45 y 78%, utilizando una dosis de 1 x 10⁶ esporas/ml.

Estandarización de la metodología para obtención de protoplastos

La evaluación de dos temperaturas diferentes: 37°C y temperatura ambiente (± 26°C) en el proceso de digestión de la pared celular de los protoplastos durante 4 h permitió determinar que a 37°C se logra la mayor cantidad de protoplastos. con una concentración de 3 x 10⁷ protoplastos/ml, mientras que en la solución que se colocó a 26°C se obtienen 1,2 x 10⁷ protoplastos/ ml. Al duplicar la concentración de enzimas en la solución y dejarla a 26°C se obtiene menor cantidad (6 x 10⁶ protoplastos/ml) y su membrana celular presenta un deterioro evidente por el exceso de enzimas.

Selección de transformantes

Previo al proceso de transformación era necesario conocer la concentración del herbicida glufosinato de amonio que inhibiera el desarrollo de la cepa ¡3b9205. Para esto se obtuvieron protoplastos del hongo y se pusieron a crecer en 5DA con diferentes concentraciones de herbicida. Al examinar las cajas, después de 20 días, se encontró que la concentración de 50 jg/ml del herbicida glufosinato de amonio inhibía completamente el crecimiento del hongo B. buasiunu no transformado. Sin embargo, cuando se utilizó esta concentración en los experimentos de transformación no se obtuvieron colonias transformantes, lo que sugirió que esta concentración era muy alta y rio permitía la regeneración de transformantes. Por lo tanto, se decidió hacer la selección utilizando la concentración de 25 p.g/ml del herbicida, recuperando colonias transformantes antes de 20 días con el fin de evitar falsos positivos ya que después de este tiempo el tratamiento control de ¡3. bassiana sin transformar puede crecer a esta concentración del herbicida.

Transformación de B. bassiana cepa 9205

Se emplearon dos metodologías de transformación, polietilenglicol (E’UO) y electroporacióri, para transformar Bb9205, usando resistencia al herbicida glufosinato de amonio (25 pgJml) como agente de selección. Se realizaron 16 transformaciones en total. Después de 11 transformaciones por FtO (1 transformación con el gen pr 1A, 4 para pr1J y 6 para ste 1) se obtuvieron 5 colonias putativamente transformadas para el gen pr1A, 3 con el gen pr1J y 3 con el gen atel. Como el número de colonias putativamente transformadas fue bajo, se decidió probar electroporación, método con el cual se hicieron 5 transformaciones (1 para el gen pr1A, 2 para pr1J y 2 para ste 1), obteniéndose 4 colonias putativamente transformadas para el gen pr 1A, 16 para el gen prIJ y 12 con el gen ste 1. La recuperación de colonias putativamente transformadas se realizó entre 10 y 20 días cuando la transformación se hizo por polietilenglicol y desde el día 4 cuando se utilizó electroporación.

Las colonias seleccionadas se transfirieron a SDA con 25 icj/ml del herbicida glufosinato de amonio y se observó su crecimiento en este medio. Se descartaron algunas colonias porque no crecieron. Al final se evaluaron 9 colonias putativamente transformadas con el gen pr 1A. 12 con el gen pr1J y6 con el gen atel, a las cuales se les extrajo su DNA para verificar, en cada una de ellas, la presencia de los genes de proteasas o esterase y del gen marcador bar.

Presencia de genes

Se seleccionaron nueve colonias putativamente transformadas b9205-pr1A, las cuales se mantuvieron en SDA y medio Samsinakova con herbicida durante ocho generaciones. gn cada colonia se verificó la presencia del gen de proteasa pr 1A y del gen marcador bar mediante PCR. La amplificación de una banda de 1.348 pb indicó la presencia del gen pr 1A, tres colonias amplificaron el gen pr 1A.

Con el fin de verificar si los hongos putativamente transformados en los que se amplificaron bandas del tamaño del gen pr 1A. también contenían el gen bar, éste se amplificó por PCl evaluando diferentes concentraciones de magnesio. Se de- terminó que con la condición de 1,25 min de MgCI2 y una temperatura de alineamiento de 65°C en la reacción, se lograba una amplificación específica del gen. Los resultados de esta amplificación mostraron que tres colonias que contenían el gen pr 1A también amplificaron el gen bar, una de las nueve colonias sólo amplificó el gen bar.

Doce colonias putativamente transformadas con el gen pr1J fueron mantenidas en SDA y medio Samsinakova con herbicida durante seis generaciones. Ln cada colonia se verificó la presencia del gen de proteasa pr1J y del gen bar. Ambos genes fueron amplificados a una temperatura de alineamiento de 65°C. La presencia de una banda de 842 pb indicó la presencia del gen pr1J; los resultados de esta amplificación mostraron que tres colonias que contenían el gen pr1J también contenían el gen bar. Sólo una colonia que tenía el gen pr1J no amplificó el gen bar.

Seis colonias putativamente transformadas con el ste 1 fueron mantenidas en SDA o medio Samsinalçova con herbicida durante 6 generaciones. En cada colonia se verificó la presencia del gen ste 1 y del marcador bar, una colonia amplificó ambos genes.

Actividad enzimática

Para los ensayos de actividad enzimática proteolítica se evaluó la actividad enzimática proteolítica de l3b9205 sin transformar y de las cepas transformantes b9205-pr1A denominadas A4, A6 y la cepa A5 (solo con el gen bar).

En la figura 1 se observa la actividad proteolítica medida en absorbencia a las 24, 36, 48 y 60 horas. Las cepas denominadas A5 y A6 produjeron proteasas en cantidades similares al control Bb9205 cuando se pusieron a crecer en medio mínimo con quitina, la cual induce producción de proteasas. La cepa A4 produce una menor cantidad de proteasas en este medio al compararla con la producción de proteasas de las demás cepas. Solamente las cepas transformadas producen protease pr 1A cuando crecen en medio mínimo con quitina más N-acetilglucosamida (NAG), la cual actúa como inhibidor al bloquear la expresión de proteasas totales en 6b9205 no transformada. ln las cepas A5 y A6 se observa una marcada inhibición de crecimiento en medio mínimo con quitina más NAG, similar al control sin transformar. A diferencia de las anteriores, la cepa A4 produce mayor cantidad de proteasas durante su crecimiento en medio mínimo con quitina más NAG, lo cual indica que la proteasa se está expresando constitutivamente y tanto el gen como su respectivo promotor fueron incorporados dentro del genoma del hongo.

De igual manera se evaluó la producción de proteasas en las cepas transformantes l3b9205-pr1J; sin embargo, todas las cepas transformantes presentaron el mismo perfil de producción de proteasa pr1J en medio mínimo suplementado con quitina y se inhibieron en la misma proporción que la cepa control Bb9205 sin transformar en medio mínimo con quitina más NAG.

Actividad proteolítica por isoelectroen foque

Para este experimento se escogieron las cepas Bb9205-pr 1A denominadas A3 y A4 en las cuales se había verificado la presencia de los genes pr 1A y bar. La cepa A4 demostró expresión constitutiva de la proteasa pr1A, en la cepa A3 no se midió actividad enzimática proteolítica por espectrofotometría debido a que esta cepa presentó disminución en su capacidad de esporulación; sin embargo, el isoelectroenfoque permitió conocer su actividad proteolítica específica.

Para observar la actividad enzimática proteolítica. se tornaron extractos enzimáticos concentrados de la cepa control flb9205 sin transformar y de las cepas A3 y A4, creciendo en medio mínimo con quitina y medio mínimo con quitina más NAG. Las proteasas fueron separadas por isoelectroenfoque (IEF), comprobándose la actividad proteolítica por exposición del gel a una película de radiografía, la cual viene recubierta de gelatina. Las proteasas degradaron la gelatina formando un halo transparente. El zimograma mostró que no hubo inhibición de proteasas en las cepas A3 y A4 creciendo en medio mínimo con quitina más NAG, como si es evidente en el control Bb9205 sin transformar. Estos resultados confirman la transformación y expresión constitutiva de pr1A en las cepas Bb9205-pr 1A A3 y A4. Ambas cepas fueron seleccionadas para realizar pruebas de patogenicidad sobre la broca del café.

Actividad esterolítíca

El ensayo de actividad esterolítica mostró que la cepa control l3b9205 sin transformar poseía una actividad moderada en el medio Tween 80, dado que la cepa tiene enzimas esterasas; sin embargo, en la cepa transformada Bb9205-ste 1 se observó un incremento de actividad esterolítica debido a la transformación con el gen ste 1. El medio sobre el que creció el transformante contenía 25 ng/ml de herbicida glufosinato de amonio.

Pruebas de patogenicidad en condiciones de laboratorio

Se determinaron promedios de porcentaje de mortalidad causado por B. bassiana y tiempo de mortalidad sobre la broca del cafe para cada una de las cepas transg€nicas y control sin transformar.

El análisis de varianza y la prueba de rangos múltiples de Duncan con un nivel de significancía del 5% mostraron que hubo diferencia significativa entre el porcentaje de mortalidad causado por la cepa transgénica l3b9205-pr 1A y los porcentajes de mortalidad causados por el control Bb9205 sin transformar y la cepa transgénica Bb9205-ste 1, pero no existió diferencia significativa entre el porcentaje de
mortalidad causado por Bb9205-ste 1 y el control Bb9205 (tabla 2 y fig. 2).

La expresión constitutiva de la proteasa pr1A en la cepa transgénica Bb9205-pr 1A mejora su actividad insecticida al demostrar con una dosis de 1 x 10 esporas! ml un incremento de mortalidad sobre la broca del café del 21,7 lo al compararse con el control Bb9205 sin transformar.
La cepa transgénica Bb9205-ste 1 tuvo un incremento del 7,3% en su porcentaje de mortalidad sobre broca, pero este valor no fue significativamente diferente (P=0,05) del porcentaje de mortalidad sobre broca causado por el control Bb9205 sin transformar.

Para el tiempo de mortalidad (TMOR) el análisis de varianza con un nivel de significancia del 5% y la prueba de rangos múltiples de Ouncan, mostró que existe diferencia significativa en el TfrTOR de las brocas causado por las cepas 6b9205- pr1A y 6b9205-ste1 con respecto al control Bb9205, pero no existió diferencia significativa entre el TMOR de las cepas Bb9205-pr 1A y Bb9205-ste 1. Bb9205- pr 1A tuvo una disminución del 14,3°k en el tiempo de mortalidad y la cepa Bb9205- ste 1 demostró una disminución del 9,S% al ser comparadas con bb9205 sin transformar (Tabla 2).

Adicionalmente, se realizó otra prueba de patogenicidad utilizando una dosis de 1 x 10° esporas/mI, la cepa Bb9205-ste 1 no se incluyó en esta ocasión debido a que no se disponía de esporas con germinación superior al 9O% de esta cepa para realizar la prueba. Los resultados de esta prueba muestran que con una dosis de 1 x 10° esporas! ml la cepa Bb9205-pr 1A tuvo un incremento del 25% en su porcentaje de mortalidad y una disminución del 16,2% en el tiempo de muerte sobre la broca del café. Estos resultados concuerdan con los obtenidos cuando se utilizó una dosis de 1 x 10° esporas/ml ya que el incremento en el porcentaje de mortalidad y la disminución del tiempo de muerte sobre la broca fueron similares con ambas dosis.

Discusión

El uso de un cultivo rnonoespórico de B. bassiarza minimiza los riesgos de variación por la naturaleza mononuclear de estas esporas. En la tabla 1 se observa que en el cultivo multiespórico existen conidias con diferentes potenciales patogénicos, los testigo cuales pueden variar entre el 45 y 78%, utifizando una dosis de 1 x 10° esporas/ml. Resultados similares fueron obtenidos por Estrada et al. (1999) quienes también produjeron aislamientos monoespóricos de 6. bassiana cepa Bb9205, ellos mostraron una gran variabilidad en sus cultivos monoespóricos, utilizando una dosis de lx10⁷ esporas/ml obtuvieron mortalidades menores del 42% y mayores del 70%.

En los experimentos tic transformación la calidad de los protoplastos es un factor crítico ya que de esto depende la frecuencia de transformación (Valadares e lnglis 1997). Al estandarizar la metodología para 6b9205, se encontró que a 37°C y 4 h de tratamiento enzimático se obtuvo la cantidad de protoplastos adecuada para el procedimiento de transformación. Estas condiciones fueron similares a las determinadas por Florez el al. (2000) para regeneración de protoplastos y pruebas de fusión en B. bassíaria.

Según los resultados de las pruebas de PCR, de 9 colonias que se obtuvieron por FEO, cuatro (45%) fueron transformadas, mientras que de 18 colonias que se obtuvieron por electroporación solo tres (17%) fueron transformadas, esto sugiere que la electroporación no resultó ser eficiente en términos de frecuencia ya que se obtuvieron muy pocos transformantes por este método. [‘feifer y tÇ.hachatourians (1992) obtuvieron resultados similares en la transformación de 6. bassiaria por electroporación.

Al revisar los resultados obtenidos con diferentes metodologías de transformación en diferentes hongos entomopatógenos (l3ernier et al. 1989; Ooettel el al. 1990; Reis ct aL. 1996; flarreto et al. 1997; Valadares e Inglis, 1997; St. Leger el al. 1995; Inglis et al. 1999), no se encuentra un patrón claro que permita establecer comparaciones entre ellos, por lo tanto no es posible establecer si las diferencias en la frecuencia de transformación se deben a la especie de hongo o al método utilizado, además la información existente sobre 15. bassiana sigue siendo limitada.

En general, ambas metodologías de transformación permitieron la obtención de transformantes, sin embargo de 27 colonias evaluadas solo siete resultaron transformadas, tres contenían el gen pr 1A, tres contenían el gen pr1J y tina contenía el gen sIc 1, lo que indica la presencia de un alto número de colonias falso positivas. Esto posiblemente fue debido a la concentración de herbicida utilizada para la selección de los transformantes. Otros autores describen el uso de diferentes concentraciones de glufosinato de amonio para selección de transformantes (Cantone y Vandenberg 1999a, b; Góngora 2004; Screen el al. 2001). Esto conlleva a establecer que la concentración mínima inhibitoria de herbicida varía de acuerdo con la especie y probablemente la concentración mínima inhibitoria de glufosinato de amonio para selección de
transformantes de 6b9205 monoespórica es una concentración intermedia entre 25 y 50 pg/ml. El uso de estas concentraciones restringiría la posibilidad de obtener colonias falso positivas.

En el análisis molecular de los transformantes para amplificar el gen de la proteasa pr1J y el gen bar, fue necesario establecer condiciones muy astringentes en las reacciones de amplificación debido a la baja especificidad de los oligonucleótidos o a que B. bassiaria tiene muchas proteasas que se desconocen, las cuales pueden ser muy similares a lapr1J de [1. ariisopliae. En las investigaciones de hongos entomopatógenos, M. anisopliae ha sido modelo global para patogenicidad, mientras que 6. bassiaria ha sido menos estudiada. Hasta el momento, en esta última solo se ha hecho la donación de una proteasa [‘rl (Joshi el al. 1995) y se ha deducido su secuencia de aminoácidos, demostrando que es similar a la proteasa [‘rl de ti. anisopliae. Otra proteasa de 6. bassiana similar en un 83,3°/o a la Fn antes descrita, ha sido registrada por Png et al. (2002).

En eventos de transformación utilizando el promotor constitutivo “gpcM”, St. Leger cf al. (1996), l1igheli ct al. (1998) y Screen el al. (2001) registran la obtención de transformantes con incremento de actividad proteolítica con respecto al control sin transformar. En este caso de tres transformantes que fueron positivos por [‘CR para el gen pr1A, dos de ellos Hb9205-pr 1A A3 y A4 demostraron expresión del gen pr 1A y producción constitutiva de la proteasa cuando fueron comparados con la cepa control 6b9205 sin transformar, bajo condiciones de crecimiento inducidas y no inducidas. Esto apoya la observación de Covert y Cullen (1992), de que los hongos filamentosos son a menudo permisivos con respecto a la expresión de genes foráneos. De igual forma, St. Leger y Joshi (1997) y St Leger et al. (1995) aseguran que los plásmidos son integrados dentro del genoma frecuentemente en múltiples copias, algunas veces en loci homólogos. En esta investigación es sorprendente que con tan pocos transformantes obtenidos se hayan encontrado cepas que presentaran una buena expresión de proteínas, teniendo en cuenta que St. Leger et al. (1996) hablan que de 40 transformantes de M. anisopliae obtenidos para el gen pr 1A, sólo 12 (30%) expresaron constitutivamente la proteasa Pr 1.

Ninguno de los tres transformantes identificados por [‘CR para el gen pr1J, demostró incremento de actividad proteolítica, debido a que la transformación es un proceso completamente aleatorio; sin embargo, a pesar de haber obtenido tan pocos transformantes se podría considerar: 1) La probabilidad de que en estos hongos transformados se hubiera presentado el fenómeno de silenciamiento de genes dependiente de homología (IIDOS), eventos de recombinación homóloga han sido registrados por Inglis el al. (1999), en Ffumosoroseus y por Cogoni y f°Iancino
(1997, citado por Catalanotto et al. 2000) en lYeurospora crassa. 2) El efecto de posición, en el que los genes pueden integrar- se en lugares del genoma que nunca son transcritas (Cantone y Vandenberg 1999b). 3) Exceso en el número de copias del gen, el cual puede causar un silenciamiento (Carthew 2001). Para el caso del único transformante obtenido para el gen stei, éste expresó la proteína, nuevamente reiterando lo aleatorio del proceso de transformación.

Alteraciones fenotípicas se presentaron en uno de los transformantes Bb9205- pr 1A- A3 que demostró mayor actividad proteolítica, pero disminuyó su capacidad de esporulación, probablemente por la integración del plásmido en diferentes posiciones dentro del genoma. Resultados similares fueron registrados por St. Leger et al. (1996) en ti. anisopliac transformado con el gen [‘rl y Upchurch el al. (1994) en Cercospora kikuchii transformado con el gen bar.

El incremento en la patogenicidad de Bb9205-pr 1A del 21,7% de mortalidad y una disminución del 16,3°/o en el tiempo de muerte de la broca con una dosis de 1 x 10° esporas/ml en comparación al control sin transformar, es atribuido a que la proteasa [‘rl es esencial para la penetración de la cutícula y es un determinante de patogenicidad (Charnley y St Leger 1991). Lo anterior unido al hecho de que aproximadamente el 70% de la cutícula del insecto es proteína (Charnley y St. Leger 1991; Bidochka y thachatounians 1992; Oniesch y Vilsinskas 1998). resultó en mejoramiento de la actividad biocontroladora de la cepa I3b9205. Resultados similares fueron obtenidos por St. Leger et al. (1996 en la transformación de ri. anisopliae con el gen Pr 1. Es importante resaltar que en esta investigación se presentó incremento de mortalidad del insecto, lo cual no se registró en el trabajo de St. Leger el al. (1996).

Un incremento de la actividad biocontroladora utilizando proteasas también ha sido obtenida en otros hongos biocontroladores, como ha sido descrito por Flores et al. (1997), quienes transformaron Tíchoderma harzianum con el gen de la proteasa prb 1.

Con respecto a la patogenicidad del transformante Bb9205-slel, se planteó la hipótesis de que el incremento de actividad esterolítica mejoraría la patogenicidad de 6. bassiarta 9205 contra la broca del café, basados en el hecho de que las esterasas son las primeras en ejercer su acción para degradar la cutícula del insecto. El transformante bb9205-ste 1 incrementó su actividad esterolítica pero no mejoró significativamente su patogenicidad contra la broca al ser comparada con la cepa Bb9205 no transgénica. Sin embargo, el incremento de la actividad esterolítica en la cepa Bb9205-ste 1 puede facilitar la acción de otras enzimas como las proteasas, lo que se demostró al disminuir en un 9,5 % el tiempo que tarda el hongo en causar la mortalidad de la broca.

Las cepas transqénicas generadas mostraron estabilidad genética bajo condiciones selectivas, por más de seis generaciones.

Finalmente, se demostró que la transformación de l3b9205 con el gen pr 1A y expresión constitutiva de esta proteasa mejoró la actividad biocontroladora de esta cepa contra 11. hampei. Se requiere información adicional de la cepa b92O5 transformada con el gen ste 1 ya que en este estudio no se cuantificó la actividad enzimática esterolítica, ni tampoco se obtuvieron más transformantes para comparar y poder establecer que no existen diferencias signilicativas en la patogenicidad de transformantes Rb9205-ste 1 y la cepa l3b9205 no transformada.

Con respecto a las perspectivas de este trabajo es conveniente producir más transformantes para los tres genes evaluados en este estudio, ya que la cantidad obtenida fue muy poca, lo cual limita las conclusiones del estudio y se hace necesario evaluar el efecto sinérgico de estos genes con otros genes implicados en patogenicidad. teniendo en cuenta el hecho de que la mezcla de varias enzimas puede ser necesaria para una eficiente degradación de la cutícula del insecto en la interacción entomopatógenos, plaga.

Agradecimientos

Las autoras agradecen a Cenicafé y a Colciencias por el apoyo financiero para la realización de esta investigación.

Literatura citada

BERNIER, L.; COOPER, R. M.; CHARMLEY, A. K.; CLARKSON, J. M. 1989. Transformation of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae to benomyl resistance. FEMS Microbiology Letters 60: 261-266.         [ Links ]

BIDOCHKA, M. J.; KHACHATOURIAMS, G. G. 1988. N acetyl-D glucosamine-medited regulation of extracellular protease in the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana. Applied Environmental Microbiology 54: 2699-2704.         [ Links ]

BIDOCHKA, M. J.; KHACHATOURIAMS, G. G. 1992. Growth of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana on cuticle components from the migratory grasshopper, Melanoplus sanguinipes. Journal of Invertebrate Pathology 59: 165-173.         [ Links ]

CANTONE, F. A.; VANDENBERG, J. D. 1999a. Use of the green fluorescent protein for investigation of the Paecelomyces fumosoroseus in insect host. Journal of Invertebrate Pathology 74: 193-197.         [ Links ]

CANTONE, F. A.; VANDENBERG, J. D. 1999b. Genetic transformation and mutagenesis of the entomopathogenic fungus Paecilomyces fumosoroseus. Journal of Invertebrate Pathology 74: 281-288.         [ Links ]

CARTHEW, R. W. 2001. Gene silencing by double-stranded RNA. Cell Biology 13: 244-248.         [ Links ]

CATALANOTTO, C; AZZALIN, G.; MACINO, G.; COGONI, C. 2000. Gene silencing in worms and fungi. Nature 404: 245.         [ Links ]

CHARNLEY, A. K. 1991. Microbial pathogens and insect pest control. Letter Applied of Microbioiogy 12: 149-157.         [ Links ]

CHARNLEY, A. K.; ST. LEGER, R. J. 1991. The role of cutícle-degrading enzymes in fungal pathogenesis in insects. p. 267-287. En Colé G T & Hoch H C (eds.). The fungal spore and disease initiation in plants and animals, London, Plenum.         [ Links ]

COVERT, S. F.; CULLEN, D. J. 1992. Heterologous protein expression in filamentous fungi. p. 66-77. En Leatham. G. F. (eds.). Frontiers in Industrial Mycology. Chapman & Hall, New York.         [ Links ]

ESTRADA, M.; VELEZ, P.; MONTOYA, E. C; BUSTILLO, A. 1999. Esporulación, germinación y patogenicidad de aislamientos monoespóricos de Beauveria bassiana. Cenicafé 50 (l):49-65.         [ Links ]

FANG, W. G.; ZHANG Y. J.; YANG X. Y; WANG Z. K; PEÍ, Y. 2002. Cloning and characterization of cuticle degrading enzyme CDEP-1 from Beauveria bassiana. Yi Chuan Xue Bao, 29(3): 278-82. (Resumen en: NCBI Data Base, http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Consultado en abril de 2003).         [ Links ]

FERRON, P 1978. Biological control of insects pests by entomopathogen fungi. Annual Review of Entomology 23:409-442.         [ Links ]

FLORES, A.; CHET, I.; HERRERA-ESTRELLA, A. 1997. Improved biocontrol activity of Trichoderma harzianum by over-expression of the proteinase-encoding gene prbl. Current Genetics 31: 30-37.         [ Links ]

GÓNGORA, C. 2004. Transformación de Beauveria bassiana cepa Bb9112 con los genes de la proteína verde fluorescente y la proteasa prlA de Metarhizium anisopliae. Revista Colombiana de Entomología 30(1): 15-21.         [ Links ]

GRIESCH, J.; VILSINSKAS, A. 1998. Proteases released by entomopathogenic fungi impair phagocytic activity, attachment and spreading of plasmatocytes isolated from haemolymph of the greater wax moth Gallería mellonella. Biocontrol science and technology 8: 517- 531.         [ Links ]

INGLIS, P. W.; TIGANO, M. S.; VALADARES-INGLIS, C 1999. Transformation of the entomopathogenic fungi, Paecilomyces fumosoroseus and Paecilomyces lilacinus (Deuteromicotina: hyphomycetes) to benomyl resistance. Genetics and Molecular Biology 22 (1): 119-123.         [ Links ]

JOSHI, L.; ST. LEGER, R. J.; BIDOCHKA, M. J. 1995. Cloning of a cuticle-degrading protease from the entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana. FEMS Microbiology Letters 125: 211-217.         [ Links ]

JÜRGEN, W.; LENGELER, K. B.; KOTHE, E. 2001. An instant preparation method for nucleic acids of filamentous fungí, http://www.fgsc.net/fgn43wendlan.html Última modificación 7/25/96.         [ Links ]

MIGHELI, Q.; GONZÁLEZ, C. L.; DEALESSI, L.; CAMPONOGARA, A.; VIDAL, D. 1998. Transformants of Trichoderma longibra-chiatum overexpresing the b-1,4 endoglucanase gene egl1 show enhanced biocontrol of Pythium ultimum on cucumber. Biological control 88: 673-677.         [ Links ]

PETERSON, R. R. M.; BRIDGE, P. D. 1994. Biochemical techniques for filamentous fungi. IMI technical handbooks No 1. p. 19. CAB International.         [ Links ]

PFEIFER, T. A.; KHACHATOURIAMS, G. G. 1992. Beauveria bassiana protoplast regeneraron and transformation using electroporation. Applied Microbioiogy and Biotechnology 38: 376-381.         [ Links ]

POSADA, F. J. 1998. Production, formulation and application of Beauveria bassiana for control of Hypothenemus hampei in Colombia. p. 227. Ascot, University of London. Imperial College of Science, Technology and Medicine, Department of Biology, (Tesis: Doctor of Philosophy).         [ Links ]

REIS, M.; HENNING, M.; LIMA, F. J.; RECH, E.; SCHRANK, A. 1996. High frequency gene conversión among benomyl resistant transformants in the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. FEMS Microbioiogy Letters 142: 123-127.         [ Links ]

SCREEN, S. E.; HU, G.; ST. LEGER, R. J. 2001. Transformants of Metarhizium anisopliae sf. anisopliae over expressing chitinase from Metarhizium anisopliae sf. acridum show early induction of native chitinase but are not altered in pathogenicity to Manduca sexta. Journal of Invertebrate Pathology 78 (4):260-266.         [ Links ]

ST. LEGER, R. J.; JOSHI, L. 1997. The application of molecular techniques to insect pathology with emphasis on entomopathogenic fungi. p. 365-409. En: LACEY, L. A. (eds.) Manual of techniques in insect pathology. San Diego, Estados Unidos. Academic Press.         [ Links ]

ST. LEGER R. J.; BIDOCHKA M. J.; ROBERTS, D. W. 1994. Isoforms of the cuticle-degrading PR1 proteinase and the production of a metalloproteinase by Metarhizium anisopliae. Archives of Biochemistry and Biophysics 313: 1-7.         [ Links ]

ST. LEGER, R. J.; SHIMIZU, S.; JOSHI, L.; BIDOCHKA, M.; ROBERTS, D. W. 1995. Cotransformation of Metarhizium anisopliae by electroporation or using the gene gun to produce stable GUS transformants. FEMS Microbioiogy Letters 131: 289-294.         [ Links ]

ST. LEGER, R. J.; JOSHY, L.; BIDOCHKA, M. J.; ROBERTS, D. W. 1996. Construction of an improved mycoinsecticiden over expressing a toxic protease. Proceedings of the National. Academy of Sciences 93: 6349-6354.         [ Links ]

UPCHURCH, R. G.; MEADE, M. J.; HIQHTOWER, R. C; THOMAS, R. S.; CALLAHAN, T. M. 1994. Transformation of the fungal soybean pathogen Cercospora kikuchii with the selectable marker bar. Applied and Environmental Microbiology 60: 4592-4595.         [ Links ]

VALADARES-INGLIS, M. C; IWGLIS, P. W. 1997. Transformation of the entomopathogenic fungus, Metarhízium flavoviridae strain CG423 to benomyl resistance. FEMS Microbiology Letters 155: 199-202.         [ Links ]

VELEZ, R; POSADA, F; MARÍM, P; GONZÁLEZ, M.; OSORIO, E.; GUSTILLO, A. 1997. Técnicas para el control de calidad de formula-clones de hongos entomopatógenos. Boletín Técnico Cenicafé No. 17. 4-13.         [ Links ]

Recibido: Dic. 15/2003 Aceptado: Jul. 05 / 2004