SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.31 issue2Larval susceptibility of Aedes (Stegomyia) albopictus (Diptera: Culicidae) from Sao Paulo, Brazil to Bacillus thuringiensis var israelensis H-141Thrips of the suborder Terebrantia (Insecta: Thysanoptera) from the Bogota plateau author indexsubject indexarticles search
Home Pagealphabetic serial listing  

Services on Demand

Journal

Article

Indicators

Related links

  • On index processCited by Google
  • Have no similar articlesSimilars in SciELO
  • On index processSimilars in Google

Share


Revista Colombiana de Entomología

Print version ISSN 0120-0488On-line version ISSN 2665-4385

Rev. Colomb. Entomol. vol.31 no.2 Bogotá July/Dec. 2005

 

Nota cientifica

Modificacion de un metodo de extraccion de ADN genomico de Aedes aegypti (Diptera: Culicidae)

Modification of a method to extract genomic DNA from Aedes aegypti (Diptera: Culicidae)

YAXSIER DE ARMAS R.1. MARIA M. RODRIGUEZ C.2, JUAN A. BISSET L.M3,4

1. Autor para correspondencia: Lic. Bioquimica. Departamento de Control de Vectores. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kouri". Ciudad de la Habana. Cuba. Fax: (537) 204 6051. E mail: yaxsier@ipk.sld.cu

2. Lic. Bioquimica. Departamento de Control de Vectores. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kouri". Ciudad de la Habana. Cuba.

3 Lic Biologio. Dr. Ciencias Biologicas. Ph. D. Departamento de Control de Vectores. lnstituto de Medicina Tropical "Pedro Kouri". Ciudad de la Habana Cuba.

4 Lic. Bioquimica. Departamento de Parasitologia. lnstituto de Medicina Tropical "Pedro Kouri". Ciudad de la Habana. Cuba.


Resumen. Se extrajo el ADN genomico a 20 mosquitos Aedes aegypti de la cepa Rockefeller. Se evaluaron los resultados de la modificacion del protocoto empleado para extraer el ADN de los mosquitos. La modificacion del metodo consistio en macerar las muestras en nitrogeno liquido antes de ser extraido el material genotico. Los resultados demostraron que empleando el protocolo modificado se obtuvo un material genomico con mayor rendimiento (9,55) y concentracion (0.46 u.g/ul) que con el metodo original. Se pudo corroborar que el ADN resultante de la extraccion presenta suficiente calidad para emplcarse como molde en la tecnica del RAPD y probablemente en otras tecnicas moleculares basadas en la amplificacion por la PCR. Estos resultados se utilizaran en futuros estudios geneticos de Ae. aegypti, principal vector del dengue.

Palabras claves: Mosquitos. Material genetico. Nitrogeno liquido. Insectos. Vectores.


Summary. The genomic DNA was extracted from 20 Aedes aegypti mosquitoes of the Rockefeller strain. The results from a modi Tied protocol for DNA extraction of mosquitoes were evaluated. The modification of the method consisted in grinding up samples in liquid nitrogen before the extraction of genetic material. The results demonstrated that through the modified protocol genetic material was obtained with higher yield (9.55) and concentration (0.46 (ig/ul) than the original method. It was corroborated that the resulting DNA was of sufficient quality for RAPD technology and probably other molecular based techniques based on PCR amplification. These results will be used in future genetic studies on Ae. aegypti, the principal vector of dengue.

Key words: Mosquitoes. Genetic material. Liquid nitrogen. Insects. Vectors.


Introduccion

Aedes aegypti (L.) es el responsable directo de la transmision de los cuatro serotipos del virus del Dengue, por lo que se considera como el principal vector en America Latina (Soper 1967). El rango de muchas poblaciones de este genero no es estatico y recientemente se ha extendido por los paises de Asia y America Latina, incrementando el riesgo del dengue en esas regiones. La reduccion de los criaderos del vector, los programas de saneamiento ambiental con la participacion comunitaria, son continuos esfuerzos que se han desarrollado para el control del mismo; sin embargo estos no han sido suficientes para la lucha contra el principal vector del dengue (Rodriguez et al. 2004). Las tecnicas moleculares aportan importantes resultados que pueden ser utilizados para la confeccion de estrategias de control de las poblaciones de mosquitos. Estas metodologias han ayudado al entendimienlo de los procesos bioquimicos, moleculares y fisiologicos de este importante vector (Hemingway et al. 1998).

La extraccion del ADN es el primer paso de muchas tecnicas moleculares. A pesar de su aparente sencillez, a menudo existen problemas con el rendimiento de los metodos, la calidad del ADN obtenido encontrandose posibles contaminantes, degradaciones parciales. asi como el tiempo de duracion de los protocolos. Un estudio detallado de estos importantes parametros garantizaria las bases para futuros estudios geneticos del principal vector del dengue. El empleo del nitrogeno liquido como variante en los protocolos de extraccion de ADN de diferentes especies (Mann et al. 1989; Kang et al. 2004; Nichols et al. 2004), ha permitido aumentar el rendimiento y la calidad del material genetico obtenido. En varias familias de insectos esta variante ha sido empleada, demostrandose ademas del aumento del rendimiento su posible empleo en tecnicas moleculares comprobandose la calidad del ADN resultante (Reincke et al. 1998; Fraga et al. 2004). En un estudio reciente, para caracterizar geneticamente dos poblacioncs de mosquitos Ae. aegypti de Santiago de Cuba nuestro grupo de trabajo ha empleado esta simple y facil modificacion, obteniendose un material genetico con suficiente calidad para ser utilizado en la tecnica del ADN polimorfico amplificado al azar (RAPD) (Bisset et al. en prensa).

En este trabajo se muestran los resultados al modificar un metodo de extraccion de ADN genomico de mosquitos Ae. aegypti (Gaillard y Strauss 1990). Con el protocolo modificado, el cual consiste en macerar con nitrogeno liquido la muestra antes de ser extraido el ADN, se obtienen mejores resultados en el rendimiento y concentracion de ADN resultante, el que tiene calidad suficiente para emplearse en tecnicas moleculares como el RAPD, y probablemente en otras tecnicas moleculares basadas en la amplificacion por la PCR. lo que representa una gran ventaja en los estudios geneticos del Ae. aegypti.

Materiales y Metodos

Origen de las muestras

Se utilizaron mosquitos Ae. aegypti de la cepa susceptible de referenda Rockefeller suministrada por el laboratorio del Centro de Control de Enfermedades de San Juan. Puerto Rico. Los mosquitos se mantuvieron en condiciones de laboratorio: 25 ± 2°C de temperatura y 70 ± 5% de humedad relativa, con un foto-periodo de 10 h de luz y 14 h de oscuridad.

Metodologia de trabajo

Se escogieron 20 mosquitos hembras al azar, se dividieron de forma aleatoria en dos grupos de 10 individuos cada uno y se pesaron para que esa variable no afectara los resultados. De un grupo de culicidos se extrajo el ADN por el metodo de Gaillard y Strauss 1990; mientras que en el segundo grupo se empleo el mismo metodo con la modificacion realizada. La misma consistia en usar el nitrogeno liquido para macerar los individuos antes de la extraccion del material genomico. Posteriormente, a ambos grupos se les elimino el ARN.

Extraccion del ADN

Metodo de Gaillard y Strauss 1990

Se maceraron 10 mosquitos de forma individual en 500 ul del tampon de extraccion (SDS al 20%, Tris-HCl 1M pH 8,25. EDTA 0,5 M, Sacarosa 1M). El homogenizado se incubo a 65ºC por 10 min, se añadieron 120 ul de acetato de potasio 5M, se coloco en hielo por 10 min y se centrifuge a 10.000 g por 10 min. Al sobrenadante se le adicionaron 35 ul de mezcla de acetato (acetato de sodio 4M y acrilamida al 0,25%) y 1.200 ul de etanol absoluto incubandose 10 min a temperatura ambiente. El homogenizado se centrifugo a 10.000 g por 20 min, el prccipitado se lavo con etanol al 70 %, se centrifugo a 10.000 g por 10 min, se seed a temperatura ambiente y se resuspendio en 25 ul del tampon Tris-EDTA (TE 1X) (Tris-HCl ImM pH 8,0, EDTA 0,1 mM pH 8,0). Posteriormente, se adicionaron 2 ul de RNAsa (10 mg/ml), se incubo 1 h a 37ºC, se añadio igual volumen de la mezcla cloroformo: alcohol isoamilico (24:1) y se centrifugo a 10.000 g por 10 min. El sobrenadante se conservo a 4°C.

Electroforesis de la extraccion del ADN

Para la visualizacion del producto de la extraccion del ADN en las muestras se realizo la electroforesis al 0.8% en geles de agarosa en tampon Tris-Borato-EDTA (TBE 0.5X) (Tris-Borato 0,045 M y EDTA 0,001 M, pH 8,0) conteniendo bromuro de etidio (0,5 mg/ml).

RAPD

El ADN extraido por los dos metodos (50 ng) se amplifico en un volumen de reaccion de 25 uL, utilizando los cebadores OPA-1, OPA-2 y OPA-9 (Kit A, Operon Technologies, USA) manteniendo constante el resto de los componentes de la reaccion (2,5 ul. de tampon de amplificacion 10x (Tris-HCl 100 mM pH 8,3, K.C1500 mM; gelatina al 0.01 %) (Promega, USA), 200 pM de cada deoxinucledotido trifosfato (Promega, USA), 2,5 mM de MgCf. 5 pmol de cebador. 2 U Taq ADN polimerasa (Promega, USA) con el objetivo de determinar la calidad del ADN para ser utilizado en la tecnica de RAPD. La amplificacion se realizo en un termociclador (Perkin Elmer, USA) con el siguiente perfil: desnaturalizacion inicial a 94ºC por 5 min, seguido de 45 ciclos de: desnaturalizacion a 94°C por 1 min, hibridacion a 36°C por 1 min y extension 72°C por 2 min, con una extension final despues del ultimo ciclo a 72ºC por 15 min. Para la deteccion del producto se analizaron 20 uL de cada mezcla resultante en electroforesis en gel de agarosa al 1.2 %, preparado en tampon TBE 0,5x con bromuro de etidio 0,5 mg/uL. La corrida electroforetica se realizo a 150 V durante 1 hora. La visualizacion de los productos de amplificacion se realizo medianle luz ultravioleta.

Analisis estadistico

Se realizaron las lecturas de las muestras del ADN obtenido a las longitudes de onda de 260 y 280 nm en un espectrofotometro (Pharmacia, LKB, USA). Se calculo el grado de pureza a traves del cociente DO 260/280, la concentracion y el rendimiento del ADN resultante. Finalmente, se realizo un analisis de varianza de clasificacion simple (Statistic version 5.0) para el peso de los mosquitos y los valores del grado de pureza, rendimiento y la concentracion del ADN extraido.

Resultados y Discusion

El metodo de Gaillard y Strauss (1990) es empleado en la extraccion de pequeñas cantidades en el orden de los picogramos de material genomico, aprovechando su alta eficiencia debido al uso de la acrilamida (Gaillard y Strauss 1990). El protocolo se extrapola a estudios en muestras de Ae. aegypti porque posee bajo costo y buen rendimiento. ademas de presentar un tiempo de extraccion muy rapido, lo que permite procesar un gran numero de muestras y dar resultados fidedignos en un corto tiempo. Estas ventajas indican claros beneficios en la confeccion de estrategias y loma de decisiones para el control de las poblaciones del vector del dengue.

El analisis de varianza de clasificacion simple para la variable peso demostro que no existieron diferencias significativas para los valores comparados (P>0,()5). Resultado que indica que esta variable no influye en el analisis del rendimiento.

En la tabla 1 se aprecian los valores de las medias de la variable concentracion, grado de pureza y rendimiento para el metodo original y su modificacion. Se demostro que el metodo modificado tiene un mejor rendimiento en la extraccion del ADN genomico (9,55), con diferencias altamente significativas (P - 0,001) con respecto al original, posee ademas una mayor media de concentracion de ADN extraido (0,46 pg/ml). estadisticamente significativo (P = 0,01) a la obtenida por el metodo original. Este resultado tiene un gran significado, ya que se dispone de mayor cantidad de ADN obtenido para emplearse en mas reacciones de tecnicas moleculares. Realizando el mismo analisis estadistico, se llego a la conclusion que las medias del grado de pureza entre el metodo empleado y su modificacion no son significativamente diferentes (P>0,05). En la figura 1. las diferentes intensidades de los patrones de las corridas electroforeticas obtenidos con las dos metodologias evidencian claramente los resultados antes explicados. Es valido añadir que en ninguna de las dos metodologias se observo contaminacion con ARN (Fig. 1), lo que es un aspecto importante para emplearse en la tecnica del RAPD. tecnica muy utilizada en estudios genoticos de poblaciones de mosquitos (Apostol et al. 1996; Zhu et al. 1998; Ay res etal. 2002).

A pesar de no tener un alto grado de pureza (valores > 1,8) se han obtenido patrones reproducibles en la tecnica del RAPD con el cebador OPA-9 (Fig. 2), asi como con el resto de los cebadores analizados (datos no mostrados), pudiendose demostrar con patrones amplificables. claros y reproducibles la calidad del ADN obtenido por ambas metodologias y especular sobre su uso en otras tecnicas moleculares que contengan en algunos de sus pasos la PCR. Este resultado se pretende utilizar en futuros estudios geneticos donde se encuentre involucrado el principal vector del dengue en las Americas.

La utilidad del nitrogeno liquido en los protocolos de extraccion de ADN genomico en insectos ha sido reportada por muchos autores. Similares resultados a los obtenidos por nuestro grupo fueron reportados por Reine et al. (1998) al comparar seis protocolos los de extraccion de ADN de insetos y evaluar su aplicacion en la tecnica del polimorfismo de la longitudde fragmentos amplificados (AFLP). En hemipteros cubanos, Fraga y colaboradores (2004) demostraron que el uso del nitrogeno liquido se obtienen mejores rendimientos en la extraccion del ADN genomico.

Obtener un material genetico con una buena calidad (libre de contaminacion y sin degradaciones parciales), unido a un buen rendimiento y concentracion, asi como en un tiempo breve, seria una herramienta muy importante para el trabajo en la Entomologia Molecular. El ADN extraido es el primer paso de muchas tecnicas moleculares, que se emplean entre otras cosas, en la confeccion y elaboracion de estrategias que permitan un mejor control sobre los insectos vectores transmiten enfermedades que afectan al hombre. Por lo que el empleo de la modificacion con nitrogeno liquido del protocolo original aqui descrito, proporciona una beneficiosa opcion para el trabajo futuro.

Conclusiones

La maceracion con nitrogeno liquido antes de extraer el ADN genomico, brinda una nueva y ventajosa variante, que permite contar con un metodo con mejor rendimiento y concentracion del ADN obtenido sin variar significativamente el tiempo empleado en la metodologia de la extraccion. Obteniendose un ADN con calidad suficiente para emplearse como molde en tecnica del RAPD y probablemente en otras tecnicas moleculares basadas en la amplificacion por la PCR.

Agradecimientos

A Alfredo Gutierrez por la revision y sus criticas valoraciones del manuscrito.

Literatura citada

APOSTOL, B. L; BLACK. W. C. IV.: MILLER, B. R.; REITER, P. 1996. Populations genetics with RAPD-PCR markers: the breeding structure of Aedes aegypti in Puerto Rico. Heredity 76: 325-331        [ Links ]

AYRES, C. F J.; ROMAO, T. P. A.; MELO-SANTOS, M. A. V.; FURTADO, A. F. 2002. Genetic diversity in brazilian populations of Aedes albopictus. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz 97: 871-875.        [ Links ]

BISSET, J. A.; RODRIGUEZ, M. M.; DE ARMAS Y. 2005. Comparacion, de dos poblaciones de mosquitos Aedes aegypri de Santiago de Cuba con diferente conducta de reposo. Revista Cubana de Medicina Tropical 57 (en prensa).         [ Links ]

FRAGA, J.; RODRÍGUEZ, J.; FUENTES. O.; CASTEX, M.; FERNÁNDEZ-CALIENES. A. 2004. Comparación entre cinco métodos para la extracción de ADN de Triatomineos: Su utilización en la técnica de ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD). Revista Cubana de Medicina Tropical 56: 23-27.         [ Links ]

GAILLARD, C.; STRAUSS, F. 1990. Ethanol precipitation of DNA with linear polyacrylamide as carrier. Nucleic Acids Rcscarch 15: 378.         [ Links ]

HEMINGWAY, J.; KARUNARATNE, H. P. P. 1998. Mosquito carboxy lesterases : a review of thc molecular hiology and hiochemistry of a major insecticide resistance mechanism. Medical andVeterinary Entomology 12: 1-12.         [ Links ]

KANG. T. J.; YANG, M. S. 2004. Rapid and reliable extraction of genomic DNA from various wild-type and transgenic plants BioMedical Central Biotechnology 4: 20.         [ Links ]

MANN, W.; JEFFERY, J. 1989. Isolation of DNA from yeasts. Annual Biochemistry 178: 82-87.         [ Links ]

NICHOLS, R.A.; SMITH, H.V. 2004. Optimization of DNA extraction and molecular detection of Cryptosporidium oocysts in natural minera water sources. Journal of Food Protection 67: 524-532.         [ Links ]

REINEKE, A.; KARLOVSKY, P.: ZEBITZ, C. P. W. 1998. Preparation and purification of DNA from insects for AFLP analysis. Insect Molecular Biology 7: 95-99.         [ Links ]

RODRÍGUEZ, M. M.; BISSET, J. A.: FERNÁNDEZ, D.; PÉREZ. O. 2004. Resistencia a insecticidas en larvas y en adultos de Aedes aegypt: prevalencia de la esterasa A4 asociada con la resistencia a temefos. Revista Cubana de Medicina Tropical 56: 54-60.         [ Links ]

SOPER, F. L. 1967. The prospects forAed aegvpti eradication in Asia in the light its eradication in Brazil. Bulletin World Health Organization 36: 645-647.         [ Links ]

ZHU, C. L.; TIAN, H. S.: LI, J. M.: YU. Z.: YE B. H. 1998. Identification deltamethrin-resistant mosquito, Culex pipiens pallens. with RAPD-PCR. Chino. Journal of Parasitic Disease II: 214-216.         [ Links ]

Recibido: 05-jun-04-Aceptado: 10-dic-03

Creative Commons License All the contents of this journal, except where otherwise noted, is licensed under a Creative Commons Attribution License