SECCIÓN AGRÍCOLA / AGRICULTURE
ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN / RESEARCH PAPER

 

Relación entre contenido de limonina en residuos cítricos y actividad antialimentaria sobre Spodoptera frugiperda

 

Relationship between content of limonin in citrus waste and antifeedant activity against Spodoptera frugiperda

 

 

Laura Daniela Rodríguez R^I; Angel Arturo Jiménez R^I; Ever Antoni Rueda L^II; Jonh Jairo Méndez A^II; Walter Murillo A^II

^IBiólogos. Grupo de Investigación de Productos Naturales. Facultad de Ciencias. Universidad del Tolima. Barrio Santa Elena. Ibagué, Colombia. ldrodriguez@ut.edu.co. Autor para correspondencia
^IIPh. D. Departamento de Química, grupo GIPRONUT

 

 

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RESUMEN

En este estudio se cuantificó la limonina presente en extractos etanólicos de residuos cítricos (cáscaras y semillas) de dos especies (Citrus sinensis y C. limonia) y sus respectivas fracciones en n-hexano, diclorometano, acetato de etilo y agua por medio de HPLC. Se realizaron ensayos de actividad antialimentaria, medida a través de los índices antialimentarios (disuasorio y antiapetitivo) e índice antinutricional (tasa de incremento de peso), con los respectivos extractos, fracciones diclorometánicas, sobre Spodoptera frugiperda. También se relacionaron con el contenido de limonina pura en los tratamientos. Las fracciones diclorometánicas de las semillas de C. sinensis y C. limonia presentaron un mayor rendimiento de limonina (1,86 ppm y 1,35 ppm, respectivamente) y una mayor actividad antialimentaria. El análisis de regresión lineal mostró que la bioactividad, medida a través de los índices, tiene relación directa con el contenido de limonina de cada tratamiento. Los resultados permitieron establecer que los residuos de cítricos presentan metabolitos de interés que tienen un potencial uso para el control de S. frugiperda.

Palabras clave: Índice antialimentario; Limonoides; Residuos agroindustriales.

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ABSTRACT

In this study was quantified limonin in ethanol extracts of citrus waste (peels and seeds) of two species (C. limonia and Citrus sinensis) and their fractions in n- hexane, dichloromethane, ethyl acetate and water by HPLC. Antifeedant activity assays measured through several antifeedant indices to the respective extracts (dicloromethane fractions) were carried on Spodoptera frugiperda. In addition, a relationship between the content of limonin and the treatments was established. The dicloromethane fractions from seeds of C. sinensis and C. limonia had a higher yield of limonin (1.86 ppm and 1.35 ppm, respectively) and greater antifeedant activity. The linear regression analysis showed that the bioactivity, as measured by the indices, is directly related to the content of limonin on each treatment. The results are promising in terms of the use of citrus waste metabolites as potential control agents of S. frugiperda.

Key words: Antifeedant index; Limonoids; Agroindustrial wastes.

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Introducción

Numerosos limonoides (Fig. 1) provenientes de las familias Meliaceae, Labiatae y Rutaceae han recibido especial atención debido a que actúan como antialimentarios, toxinas y reguladores del crecimiento de insectos plaga (Morgan 2009; Ambrozin et al. 2006; Silva et al. 2006). En el caso específico de las rutáceas de interés comercial, estos compuestos se encuentran presentes principalmente en semillas, las cuales luego de procesos agroindustriales se convierten en residuos que representan un problema ambiental y económico debido a que son dispuestos de forma inadecuada y su eliminación es costosa (Alfonso et al. 2010).

 

 

Estudios recientes sobre estos compuestos han resaltado la importancia de los más de 300 limonoides naturales aislados con características estructurales complejas, diversificadas y con alta actividad biológica (Caballero 2004; Isman 2006; Roy y Saraf 2006); específicamente los limonoides cítricos, obtenidos de residuos agroindustriales (cáscaras y semillas) han presentado actividad antialimentaria significativa a bajas concentraciones frente a lepidópteros, coleópteros y dípteros, entre otros insectos plaga (Bilal et al. 2012; Hafeez et al. 2011; Ruberto et al. 2002).

En el caso específico de los lepidópteros, un estudio que evaluó los extractos de semillas y cáscaras de C. sinensis y C. limonia, encontró que aquellos etanólicos y fracciones en diclorometano de residuos cítricos, presentaban actividad antialimentaria sobre Spodoptera frugiperda J. E. Smith, 1797 (Lepidoptera: Noctuidae) (Jiménez et al. 2013). Por lo anterior esta investigación tuvo como objetivo determinar la relación entre el contenido de limonina de los extractos y fracciones diclorometánicas, de residuos de dos especies cítricas (C. sinensis y C. limonia), y su relación con la actividad antialimentaria sobre S. frugiperda, medida a través de pruebas de preferencia, no preferencia, y el establecimiento de índices antialimentarios y antinutricionales, para establecer el potencial de los residuos cítricos aquí evaluados como materia prima para la obtención y formulación de un producto eficaz y de bajo impacto ambiental para el control de S. frugiperda y potencialmente a otros lepidópteros de importancia económica.

 

Materiales y métodos

Tratamiento del material vegetal. Se recolectaron residuos agroindustriales (cáscaras y semillas) de C. sinensis proveniente de la zona urbana de Ibagué (Tolima-Colombia) y C. limonia del municipio de Prado Tolima (3°46'40,40"N 74°57'31,52"O). Cada tipo de residuo se secó a 45 °C durante 72 horas y se pasó por un molino eléctrico Thomas Wiley. Del material homogenizado con un tamiz de 2 mm de poro, se empacaron 170 g de cada tipo en un dedal de interlón y se realizó un desengrasado con n-hexano en un equipo soxhlet hasta el agotamiento. El exceso de n-hexano fue retirado a 35 ± 2 °C y, nuevamente, sometido a reflujo en soxhlet con etanol al 96%. Los extractos etanólicos (crudos) fueron concentrados a presión reducida en un rotavapor BÛCHI R114 y cada uno fue fraccionado líquido-líquido colocando 50 mL y agregándole la misma cantidad de n-hexano, diclorometano (DCM), acetato de etilo y agua sucesivamente, hasta obtener de cada extracto crudo las fracciones correspondientes a los solventes mencionados.

Caracterización y cuantificación de la limonina. A cada uno de los extractos y fracciones purificadas se les realizó una identificación preliminar de limonina utilizando cromatografía de capa delgada (CCD) usando limonina (Sigma Aldrich^®) como referencia. Las muestras seleccionadas en función de la presencia de limonina, se cuantificaron por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), en un equipo Agilent Technologies serie 1200, con detector de arreglo de diodos, bajo las siguientes condiciones: longitud de onda de 210 nm, columna C18 de 2x150 mm (diámetro de partícula de 5µm), flujo de 0.5 ml/min, volumen de inyección 20 µl, temperatura de corrido 25 °C, fase móvil acetonitrilo:agua para los extractos y fracciones de semillas y acetonitrilo:buffer acido fórmico pH 2,73 para los extractos y fracciones de cáscaras, en gradiente 30-80% durante 15 minutos con una fase de estabilización de 100% acetonitrilo durante 15 minutos. La curva de calibración se realizó con limonina Sigma Aldrich de pureza HPLC > 95% a una concentración de 5, 10, 20, 30 y 40 ppm (Fig.1).

Actividad antialimentaria. Se realizaron ensayos anti-alimentarios sobre larvas de 120 ± 10 mg de una colonia de S. frugiperda establecida en condiciones de laboratorio a partir de posturas proporcionadas por la Corporación para Investigaciones Biológicas (CIB) de Medellín. Los ensayos se efectuaron en condiciones de preferencia (con posibilidad de elección) y no-preferencia (sin posibilidad de elección) con discos foliares de Ricinus communis tratados con 10 μL de soluciones del 0,25, 0,5, 0,75 al 1% de los extractos etanólicos crudos y la fracción diclorometánica de cada residuo y sin tratar con 10μL de agua o el solvente usado en la dilución. Los extractos crudos se suspendieron en agua mientras que la fracción diclorometánica en una mezcla diclorometano:agua en proporciones (1:4) (Caballero 2004; Jiménez et al. 2013); se tomaron los datos del peso inicial de los discos foliares en fresco (antes y al final del ensayo); el peso final seco del disco foliar se obtuvo luego de 12 horas de secado a 60 ± 5 °C.

Con el fin de evidenciar la relación entre la limonina y los resultados obtenidos, se realizaron ensayos con el limonoide a 10 y 50 ppm teniendo en cuenta las condiciones utilizadas en los ensayos anteriormente mencionados.

Ensayos de preferencia. Discos foliares tratados con la limonina y control (sin tratamiento), se alternaron dentro de cada caja de Petri de forma que el insecto pudiera elegir. El ensayo se dio por finalizado trascurridas cinco horas desde el inicio del ensayo o cuando la larva hubiese ingerido el 50% de los discos foliares. Con la información del consumo de discos foliares se calculó por cada larva el índice disuasorio (ID) así:

ID = [(C-T)/(C+T)] x 100% donde: C= consumo de discos foliares testigo y T = consumo de discos foliares tratados (Blaney et al. 1988; Jiménez et al. 2013).

Ensayos de no preferencia. En situaciones de no-elección se colocó en una caja de Petri un disco foliar impregnado con la limonina en solución acetonitrilo:agua (1:4). El ensayo finalizó cuando las larvas ingirieron el 50% del disco foliar en las cajas de Petri testigo o a las cinco horas de transcurrido el ensayo. Con los datos del consumo de discos foliares se calculó el índice antiapetitivo (IA) mediante la siguiente ecuación:

IA = [(C-T)/C] x 100%

donde: C= ingestión de discos foliares testigo y T = ingestión de discos foliares tratados (Blaney et al. 1988; Jiménez et al. 2013).

Análisis estadístico. Los datos obtenidos se analizaron mediante un diseño experimental 2x2 con 10 réplicas para el índice antiapetitivo y cinco réplicas para el índice disuasorio, en el que se evaluaron las variables tratamiento (cuatro extractos, sus fracciones diclorometánicas) y su dosificación.

Se verificó la normalidad de los datos mediante la prueba de bondad de ajuste de Kolmogorov-Smirnov; se realizó un análisis de varianza ANOVA de dos vías; usando el test de Tukey para las comparaciones múltiples, la información fue procesada con el programa Infostat versión libre 2008.

Para determinar la relación entre la actividad y la concentración de la limonina, se realizaron análisis de regresión simple relacionando los índices antialimentarios en función del contenido de limonina en los extractos y fracciones mediante el programa Statgraphics Centurion XV versión 15.2.06. Se determinó el p valor del modelo y el intercepto, se calculó el error estándar del estimado, el error absoluto medio (MAE) y el estadístico de Durbin-Watson (DW) para determinar si existió correlación significativa entre ellos.

 

Resultados y discusión

Cuantificación de limonina. Las muestras con mayor rendimiento de limonina fueron las fracciones diclorometánicas obtenidas de semillas de C. sinensis y C. limonia con 1,86 ppm y 1,35 ppm, seguidas del extracto etanólico de C. limonia con 0,204 ppm de limonina en relación peso/peso con la materia seca de cada residuo; de esta manera las fracciones diclorometánicas de semillas mostraron mayor efecto antialimentario, tal como lo habían reportado Jiménez et al. (2013). Estos resultados se lograron correlacionar con la cantidad de limonina presente y el incremento en la actividad de las fracciones diclorometánicas guardó relación directa con la concentración de la limonina indicando que es el principal metabolito activo en las muestras evaluadas; lo cual es consistente con otros estudios, en los cuales se demostró que este limonoide tiene acción anti-apetitiva y disuasoria de la alimentación (Ruberto et al. 2002;Vikram et al. 2007).

El porcentaje de limonina de cada uno de los extractos y correspondientes fracciones diclorometánicas, mostró que las semillas son el tipo de residuo con mayor contenido de este limonoide, lo que concuerda con los resultados obtenidos por Manners et al. (2003) y Manners y Breksa (2004). Igualmente se realizó la cuantificación de limonina en semillas y cáscaras de C. limonia, comparándola bajo el mismo método cromatográfico usado para Citrus sinensis (Vikram et al. 2007) mostrando al diclorometano como un solvente adecuado para la extracción de metabolitos de naturaleza limonoide en los extractos crudos.

La limonina, presentó relación directa estadísticamente significativa con la actividad disuasoria, lo que se evidencia en el análisis de regresión lineal del índice disuasorio (Tabla 1). Lo anterior se aplicó para los extractos etanólicos de semilla de naranja y cáscaras de naranja y limón, y las fracciones diclorometánicas de cáscara de naranja, semillas de limón y semillas de naranja, exceptuando el extracto etanólico de semillas de limón y la fracción en diclorometánica de cáscaras de limón, que en este caso no evidenciaron una relación estadísticamente significativa entre dicha actividad y la concentración de limonina (Tabla 1). Desde el punto de vista de la composición química, esto podría mostrar que la actividad biológica puede estar influenciada por sinergismos con otros compuestos de naturaleza limonoide, tales como nomilina y obacunona los cuales han sido reportados en cítricos (Bilal et al. 2012; Ruberto et al. 2002; Vikram et al. 2007); en este caso, la fracción en DCM de semilla de naranja mostró la mayor actividad disuasoria relacionada directamente con la concentración de la limonina, con un coeficiente de correlación de 0,9603, observación que se reafirma con el valor del estadístico r-cuadrado del modelo ajustado que explicó el 92,22% de variabilidad.

La comparación gráfica de los valores estimados calculados para el índice antialimentario, frente a la concentración de limonina, cuando ésta es igual a 50 ppm muestra de igual forma que la fracción en diclorometano de cáscaras de limón, presentó un mayor índice antiapetitivo que la limonina pura (Tabla 2); esto de nuevo conduce a suponer que existen compuestos activos diferentes a la limonina que pueden actuar de manera conjunta potenciando la bioactividad sobre S. frugiperda; por tal motivo el uso de extractos a base de residuos cítricos se convierte en una alternativa para el control de insectos plaga. Es de aclarar que los demás extractos y fracciones presentan una relación estadísticamente significativa con el contenido de limonina (Tabla 3).

La aplicación del coeficiente de correlación a los resultados obtenidos de la tasa de incremento de peso (Jiménez et al. 2013), indicó que existe una relación estadísticamente significativa entre las dos variables tasa de incremento de peso y concentración de limonina (Tabla 4), lo que se traduce en un efecto dosis dependiente entre la limonina y la disminución de la tasa de incremento de peso de las larvas. Estos resultados concuerdan con resultados de Ruberto et al. (2002) con la limonina, mostrando así la actividad tóxica de este limonoide sobre larvas de S. frugiperda. En este caso las fracciones en diclorometano de semillas de limón y cáscaras de limón no presentaron una relación directa con el contenido de limonina ya que presentaron un valor P > 0,05 y un R² < 90% indicando nuevamente la interacción entre compuestos diferentes a la limonina (Tablas 1, 3 y 4).

 

Conclusión

La evaluación del contenido de limonina presente en residuos cítricos y la determinación de la relación directa que existe entre compuestos de naturaleza limonoide y la actividad antialimentaria sobre S. frugiperda, sugieren un potencial uso y aprovechamiento de estos residuos, considerados en la actualidad como material de desecho. Esto abre la posibilidad de usar extractos ricos en limonoides para el control de lepidópteros de importancia económica, a través de la implementación de bioinsumos que se articulen a programas de manejo integrado de plagas (MIP).

 

Literatura citada

ALFONSO, D.; BRIÑES, N.; PEÑALVO, E.; VARGAS, C.; PÉREZ, A.; GÓMEZ, P.; PASCUAL, A.; RUIZ, B. 2010. Cuantificación de materias primas alimentarias de origen vegetal. Desarrollo de sistemas sostenibles de producción y uso de biogás agroindustrial en España. Ministerio de Ciencia e Innovación de España.         [ Links ]

AMBROZIN, A. R. P.; LEITE, A. C.; BUENO, F. C.; VIEIRA, P. C.; FERNANDES, J. B.; BUENO, O. C.; Silva, M. F. das G. Fernandes da; Pagnocca, F. C.; Hebling, M. J. A.; Bacci Jr., M. 2006. Limonoids from andiroba oil and Cedrela fissilis and their insecticidal activity. Journal of the Brazilian Chemical Society 17 (3): 542-547.         [ Links ]

BILAL, H.; AKRAM, W.; ALI-HASSAN, S. 2012. Larvicidal activity of Citrus limonoids against Aedes albopictus larvae. Journal of Arthropod-borne Diseases 6 (2): 104.         [ Links ]

BLANEY, W. M.; SIMMONDS, M. S. J.; LEY, S. V.; JONES, P. S. 1988. Insect antifeedants: a behavioural and electrophysiological investigation of natural and synthetically derived clerodane diterpenoids. Entomologia experimentalis et Applicata 46 (3): 267-274.         [ Links ]

CABALLERO, C. 2004. Efectos de terpenoides naturales y hemisintéticos sobre Leptinotarsa decemlineata (Say)(Coleoptera: Chrysomelidae) y Spodoptera exigua (Hubner)(Lepidoptera: Noctuidae). Memoria Doctoral, Universidad Complutense de Madrid. Fac. de Cs. Biológicas. Madrid, España        [ Links ]

HAFEEZ, F.; AKRAM, W.; SHAALAN, E. A. A. 2011. Mosquito larvicidal activity of citrus limonoids against Aedes albopictus. Parasitology Research 109 (1): 221-229.         [ Links ]

ISMAN, M. B. 2006. Botanical insecticides, deterrents, and repellents in modern agriculture and an increasingly regulated world. Annual Review of Entomology 51: 45-66.         [ Links ]

JIMÉNEZ, A.; RODRÍGUEZ, L.; MURILLO, W.; MÉNDEZ, J.; RUEDA, A. 2013. Actividad anti-alimentaria de metabolitos secundarios de residuos cítricos sobre Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae). Revista Colombiana de Entomología 39 (1): 113-119.         [ Links ]

MANNERS, G. D.; BREKSA, A. P. 2004. Identifying citrus limonoid aglycones by HPLCGÇÉEI/MS and HPLCGÇÉAPCI/MS techniques. Phytochemical Analysis 15 (6): 372-381.         [ Links ]

MANNERS, G. D.; JACOB, R. A.; ANDREW III, P.; SCHOCH, T. K.; HASEGAWA, S. 2003. Bioavailability of citrus limonoids in humans. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51 (14): 4156-4161.         [ Links ]

MORGAN, E. D. 2009. Azadirachtin, a scientific gold mine. Bioorganic & Medicinal Chemistry 17 (12): 4096-4105.         [ Links ]

ROY, A.; SARAF, S. 2006. Limonoids: overview of significant bioactive triterpenes distributed in plants kingdom. Biological and Pharmaceutical Bulletin 29 (2): 191-201.         [ Links ]

RUBERTO, G.; RENDA, A.; TRINGALI, C.; NAPOLI, E. M.; SIMMONDS, M. S. 2002. Citrus limonoids and their semisynthetic derivatives as antifeedant agents against Spodoptera frugiperda larvae. A structure-activity relationship study. Journal of Agricultural and Food Chemistry 50 (23): 6766-6774.         [ Links ]

SILVA, O. S.; PROPHIRO, J. S.; NOGARED, J. C.; KANIS, L.; EMERICK, S.; BLAZIUS, R. D.; ROMAO, P. R. 2006. Larvicidal effect of andiroba oil, Carapa guianensis (Meliaceae), against Aedes aegypti. Journal of the American Mosquito Control Association 22 (4): 699-701.         [ Links ]

VIKRAM, A.; JAYAPRAKASHA, G. K.; PATIL, B. S. 2007. Simultaneous determination of citrus limonoid aglycones and glucosides by high performance liquid chromatography. Analytica Chimica Acta 590 (2): 180-186.         [ Links ]

 

 

Recibido: 16-feb-2014
Aceptado: 3-nov-2014