Introducción

En un abordaje ecológico, de plasticidad fenotípica en animales se define como un grupo de expresiones fenotípicas dependientes del ambiente que obedecen a un ajuste del individuo a su entorno (^{Bradshaw 1965}; ^{Schilichting 1986}; ^{Sultan 1995}; ^{Pigliucci 2002}; ^{West-Eberhard 2003}; ^{DeWitt y Scheiner 2004}). Representa un poderoso medio de adaptación en el cual alelos alternativos (o sus productos) reaccionan de manera diferente al medio ambiente; aquellos con reacciones favorables persisten y los otros desaparecen. Frecuente y tradicionalmente la plasticidad fenotípica se interpreta como una expresión “no genética” (^{Wright 1931}). Las dudas sobre sí las variaciones fenotípicas de los organismos en determinados ambientes son plásticas o genéticas son persistentes y engañosas debido a esta visión incorrecta de que efectos ambientales y genéticos son independientes. Los genes y el ambiente pueden interactuar y las respuestas fenotípicas son genéticas en todos los casos; la diferencia radica en sí las mutaciones que surgieron son favorecidas (heredadas) o no (^{DeWitt y Scheiner 2004}).

Desde décadas, el papel de la plasticidad fenotípica en la adaptación a ambientes inciertos ha sido foco de varios estudios. Sin embargo, a pesar del volumen grande de artículos en este campo, la plasticidad adaptativa no ha sido ampliamente documentada (^{Scheiner 1993}; ^{Gotthard y Nylin 1995}).

Las interacciones entre insectos y sus hospederos vegetales conforman un sistema complejo y altamente dinámico (^{Bernays 1998}) que puede inducir modificaciones fenotípicas a corto plazo que afectan el desarrollo y la evolución de sus estructuras corporales, inclusive sus piezas bucales (^{Menna-Barreto y Araújo 1985}; ^{Périco y Araújo 1991}; ^{Price 1997}; Bernays 1998; ^{Larsson 2002}). ^{Bernays (1986)} usando larvas de Spodoptera (Lepidoptera: Noctuidae) y algunas especies de grillos, demostró que las dimensiones de la cápsula cefálica y músculos mandibulares están intimamente relacionados con el tipo de dieta. En este sentido, la autora también mostró alometría en larvas de Pseudaletia unipuncta (Haworth, 1809) (Lepidoptera: Noctuidae) sometidas a diferentes dietas, donde la alimentación con tejido rígido provocó un aumento proporcional mayor de la cabeza con relación al tamaño del cuerpo.

Las mandíbulas de insectos masticadores juegan un papel decisivo en su desarrollo al establecer el primer contacto con el tejido vegetal y al encargarse de cortarlo en fragmentos, determinando si puede o no ser ingerido. En ese sentido, las mandíbulas pueden sufrir presiones selectivas importantes (^{Chapman 1998}). Generalmente, las mandíbulas presentan dos áreas distintas en su morfología externa: una parte distal o ‘región incisiva’ que contiene los dientes incisivos y es responsable por cortar el alimento; y una área proximal o ‘región molar’ que lo tritura (^{Chapman 1995}). Internamente, la anatomía de las mandíbulas ha sido estudiada en ortópteros (^{Baines et al. 1990}), himenópteros (^{Masuko 1986}; ^{Rehder 1989}; ^{Paul y Gronenberg 2002}) y larvas de Sphingidae (^{Griss 1990}). En lepidópteros que poseen mandíbulas dicóndilas y aparatos bucales hipognatos, existe un par de músculos insertados en apodemas que están localizados a cada lado del plano de articulación y se encargan de los movimientos de abducción y aducción (^{Snodgrass 1935}; ¹⁹⁵⁰). Dichos músculos se originan en la porción antero-dorsal de la cabeza, donde el músculo abductor se encarga de la rapidez de contracción mientras el aductor proporciona la fuerza de cierre a las mandíbulas, siendo responsable de generar gran parte de la fuerza empleada para cortar el alimento. Debido a eso, el aductor es más grande que el abductor y ocupa, prácticamente, toda la cavidad cefálica (^{Snodgrass 1935}; ^{Chapman 1995}; ^{Vegliante 2005}).

Las mariposas de la tribu Heliconiini (Lepidoptera: Nymphalidae) han sido utilizadas en diversos estudios evolutivos y son reconocidas principalmente por la estrecha relación con sus plantas hospederas (Passifloraceae). Durante mucho tiempo este complejo fue propuesto como un sistema de evolución conjunta (^{Gilbert 1975}; ^{Benson et al. 1976}; ^{Benson 1978}).

^{Alexander (1961)} describió diferentes estrategias adoptadas por larvas de seis especies de heliconíneos que rompen la nervadura central de las hojas y raspan tejidos superficiales de las mismas para poder alimentarse, sugiriendo que dichas estrategias estarían relacionadas no solamente con el comportamiento de los individuos sino también con la forma de sus mandíbulas. Décadas después, ^{Aymone (2009)} registró cambios de forma convergentes en la cabeza de ocho especies de heliconíneos durante su trayectoria ontogenética, lo que relacionó con el crecimiento gradual de las mandíbulas y músculos aductores en la cabeza de estas mariposas. Al igual que ^{Alexander (1961)}, Aymone sugirió que dicha convergencia estaría relacionada a los hábitos alimenticios (convergentes) adoptados por las especies durante su trayectoria evolutiva; dichos hábitos fueron descritos detalladamente por ^{Benson (1978)}. Sin embargo, aunque se reconoce que la variación en el uso de la planta hospedera está asociada a plasticidad fenotípica en estos insectos, por lo menos en relación al tamaño y forma de las alas (^{Jorge et al. 2011}), se desconoce la existencia de tal relación a los respectivos apéndices alimenticios.

Heliconius erato phyllis (Fabricus, 1775) es una especie oligófaga cuyos individuos tienen una alta orientación espacial con relación a las plantas hospederas y una acentuada capacidad de inspeccionar su calidad (Mugrabi-Oliveira y Moreira 1996 a, b). Las hembras adultas ponen huevos exclusivamente en hojas jóvenes, que son más suaves, y en los zarcillos (^{Mugrabi-Oliveira y Moreira 1996} a, ^b), más blandos que las hojas maduras, que se encuentran en la base del ramo (^{Fenny 1970}; ^{Barp et al. 2006}; ^{Elpino-Campos 2010}). En estudios comportamentales ^{Rodrigues y Moreira (1999)} observaron que, en condiciones naturales, larvas del primer y segundo instar se alimentan de tejidos jóvenes (suaves) localizados en la parte superior del ramo de Passiflora y, a medida que ocurre la ontogénesis, las larvas avanzan hacia la parte posterior del ramo donde se encuentran las hojas más rígidas. Los autores también registraron una mortalidad significativa de las larvas jóvenes cuando fueron obligadas a alimentarse de hojas maduras. Posteriormente, ^{Silveira (2002)} y ^{Elpino-Campos (2010)} atribuyeron dicha mortalidad acentuada a que las mandíbulas de los individuos jóvenes serian incapaces de masticar hojas duras.

Interrogantes relacionados con la descripción y cuantificación de procesos evolutivos que implican variaciones en las tasas de crecimento y posibles cambios de forma que sufrirían las mandíbulas de los heliconíneos frente al consumo de diferentes pasifloras permanecen inexploradas. Los objetivos de este trabajo fueron 1) determinar si el consumo de diferentes plantas por parte de larvas de H. erato influenciaba el tamaño/forma mandibulares y las dimensiones del músculo aductor asociado a las mismas y 2) determinar si existían diferencias en las tasas de crecimiento entre mandíbulas y músculos aductores mandibulares que puedieran ser atribuidas al consumo de las diferentes plantas. Las hipótesis de trabajo fueron que 1) las larvas de H. erato presentarían diferencias de tamaño y forma de las mandíbulas y también diferencias en el área del músculo aductor como una respuesta fenotípica al consumo de diferentes plantas y que por ese motivo, 2) las larvas de H. erato presentarían diferentes tasas de crecimiento de mandibula y el músculo aductor.

Materiales y métodos

Analisis morfométricos

Una vez se tomaron las fotos y las medidas a todos los individuos, se realizaron comparaciones entre las longitudes cefálicas, tamaño de las mandíbulas y áreas de los músculos aductores. No se cumplieron los supuestos de normalidad (Tests Shapiro-Wilk) y homegenidad de varianza (Test de Hartley), por lo que dichas comparaciones se analizaron con estadística no paramétrica. Las alometrías en las mandíbulas y músculos aductores de las larvas de quinto instar se analizaron usando corelación de Pearson y comparaciones ANCOVA (GraphPadPrism 5.00) entre las rectas de crecimiento correspondientes.

Para el análisis de la forma mandibular, la digitación de los “landmarks” y su localización en coordenadas cartesianas se hizo sobre las fotos obtenidas en laboratorio, utilizando el programa TPSdig 2.16 (^{Rohlf 2010}); siendo asignados 17 coordenadas consideradas regiones anatómicas de interés (Tabla 1) (Fig. 1). Dichas coordenadas se analizaron con el método de sobreposición de Procustes (^{Rohlf y Slice 1990}) y análisis de componentes principales (PCA) seguidos de análisis discriminantes (CVA). La significancia de variación ontogenética se calculó por medio de análisis multivariados MANOVA y los análisis de distribucion de las formas mandibulares en los instares y en las plantas se hicieron mediante PCA y posterior MANOVA.

Tabla 1 Descripción de las regiones mandibulares y respectivos puntos anatómicos utilizados en los análisis morfométricos. 

Región	Coordenada “Landmark”	Descripción
Condilar	1	Cóndilo posterior de la mandíbula
	2	Vértice de la margen distal, localizado entre los dos cóndilos mandibulares
	3	Cóndilo anterior de la mandíbula
Molar	4	Límite lateral izquierdo de la margen establecida por la región molar
	5	Límite proximal del diente 11 - 12 con la margen de la región molar
	6	Límite proximal del diente 9 - 10 com a margem de la región molar
Incisiva	7, 9, 11, 13, 15 y 17	Ápice del diente incisivo
	8, 10, 12, 14 y 16	Base externa entre los dientes incisivos

Figura 1 A. Mandíbula de primer instar de H. erato, vista mediana. Los números se refieren a las coordenadas usadas en los análisis morfométricos. B. Localización de coordenadas en mandíbulas de primer (izquierda) y quinto (derecha) instar de H. erato por microscopía electrónica. Barras horizontales en la parte inferior derecha de las imágenes corresponden a 0,05 mm. 

Además, se realizó un análisis de deformaciones relativas (^{Rohlf 2006}) gráficamente a través de la función “Thin Plate Splines” (^{Adams y Rosenberg 1998}) y se establecieron relaciones de proximidad fenotípica a través de distancias de ^{Mahalanobis (1936)} y árboles del vecino cercano “neighbor-joining” (^{Saitou y Nei 1987}) no enraizadas. Los análisis se rodaron en el programa “R”, usando Rmorph package (^{Baylac 2008}) y los paquetes MASS, Ape, ade4 y stats (^{Development Core Team 2008}).

Resultados

Las mandíbulas de larvas de H. erato fueron de tipo cortador/masticador (^{Alexander 1961}) durante toda su ontogénesis (Fig. 1) y los índices de identificación correcta para la determinación de cada instar fueron superiores al 90 % (Tabla 2). Dicha mandíbula cortadora presentó algunas modificaciones en los cinco instares larvales (que serán discutidos posteriormente) y se destacaron cinco patrones: 1) 6 dientes conspícuos en la región incisiva, que se tornaron más alargados a medida que trancurrió el desarrollo; 2) región molar poco desarrollada, prácticamente lisa en el primer instar, seguido por regiones molares conspicuas con crestas y tubérculos fuertemente erguidos en el quinto instar, 3) el dislocamiento de los dientes incisivos en dirección al cóndilo anterior de la mandíbula, 4) la fusión de la cúspide del diente 7 con su base 8 (coordenadas 7 y 8) en el quinto instar, 5) el vértice de la margen distal, localizado entre los dos cóndilos (coordenada 2), se prolongó en dirección opuesta a la región incisiva (Fig. 2) (Tabla 3).

Figura 2 Análisis de componentes principales (PCA) de las formas mandibulares de los cinco instares larvales de H. erato. A. y B. representan las deformaciones por “Thin Plate Splines” del componente principal 1 (PC1) y componente principal 2 (PC2), respectivamente. La línea punteada representa o extremo negativo y la línea continua o extremo positivo de los componentes. 

Las larvas de quinto instar de H. erato alimentadas exclusivamente con P. actinia tuvieron cabezas más grandes que aquellas alimentadas con las otras tres especies de Passiflora. Por otro lado, el tamaño de las mandíbulas y áreas de músculos aductores mandibulares de los individuos en todos los tratamientos no presentaron diferencias estadísticas significativas (Tabla 4) (Fig. 3).

Figura 3 Longitud de: A. Cápsula cefálica. B. Tamaño de la mandíbula (tamaño del centroide). C. Área del músculo aductor mandibular de larvas de quinto instar de H. erato alimentadas con cuatro especies de Passiflora. Cajas con letras diferentes difieren estadísticamente (Kruskal-Wallis, seguido las pruebas de Dunn, P < 0,05).  

El análisis de variables canónicas estructuró en media las diferentes plantas hospederas (F = 2,183, Wilks’λ = 0,259, P = 0,001) (Fig. 4). Comparaciones MANOVA pareadas entre la forma mandibular de los individuos alimentados con las cuatro plantas mostró que los que comieron P. suberosa tienen mandíbulas significativamente diferentes de los que comieron P. actinia y P. misera. Las otras comparaciones no difirieron estadísticamente (Tabla 5).

Figura 4 Análisis de variables canónicas (CVA) de la forma mandibular de larvas de quinto instar de Heliconius erato criadas en cuatro especies de Passiflora. CV1 y CV2 representan las variables canónicas 1 (A) y 2 (B). La línea punteada representa el extremo negativo y la continua el positivo de los componentes.  

El análisis discriminante mostró porcentajes de identificación correcta superiores al 70 % para cada una de las plantas hospederas (71,43 % para mandíbulas de larvas criadas en P. actinia, 71 % en P. caerulea, 75 % en P. misera y 78,68 % para larvas criadas en P. suberosa). El árbol (no enraizado) de distancias fenotípicas de Mahalanobis obtenido del análisis discriminante (CVA) ilustra dicha comparación al mostrar que la cría en P. misera y P. actinia originó larvas con mandíbulas muy similares entre sí y diferentes de las de los individuos criados en P. suberosa, los cuales divergen drásticamente del resto del grupo. Además, las mandíbulas de larvas alimentadas con P. caerulea aparecen como un grupo de “forma mandibular intermediaria” entre el grupo formado por los individuos de P. misera + P. actinia y el de los individuos de P. suberosa (Fig. 5).

Figura 5 Árboles “neighbor-joining” (no enraizadas) de las distancias fenotípicas de Mahalanobis para la forma mandibular de larvas de quinto instar de H. erato alimentadas con cuatro especies de Passiflora. Las ilustraciones mandibulares asociadas a cada planta hospedera corresponden a la forma media obtenida por sobreposición de Procrustes (GPA) de las coordenadas mandibulares de individuos criados en cada hospedero vegetal y en el extremo inferior derecho la forma media total de los datos, sin discriminación de la planta hospedera usada como alimento por los individuos.  

Las rectas correspondientes al tamaño de la mandíbula y del músculo aductor asociado de larvas de quinto instar de H. erato en las cuatro plantas hospederas mostraron coeficientes alométricos negativos (Fig. 6) y se presentaron diferencias estadísticamente significativas entre las inclinaciones de las rectas correspondientes al área del músculo aductor y el tamaño de la mandíbula de los individuos (ANCOVAs, P < 0,0001) (Tabla 6).

Figura 6 A. Rectas de crecimiento mandibular (gris) y crecimiento del área del músculo aductor de la mandíbula (negro) de larvas de quinto instar de H. erato criadas en cuatro especies de Passiflora. B. Variación del área del músculo aductor mandibular en relación al tamaño mandibular (tamaño del centroide) de los individuos. Comparaciones entre las rectas correspondientes al área del músculo y la recta del tamaño mandibular en cada hospedero, usando el total de datos, difieren significativamente en su inclinación (ANCOVAs, P < 0,0001). 

Discusión

La hembra de H. erato pone huevos en regiones blandas de la planta hospedera, como zarcillos y hojas jóvenes (^{Périco y Araújo 1991}) garantizando que las larvas recién eclosionadas se alimenten con éxito pues, como fue demostrado por ^{Rodrigues y Moreira (1999)}, gran parte de larvas pequeñas obligadas a comer hojas maduras (que son naturalmente más rígidas) mueren durante los primeros días de vida. En ese sentido, los estudios morfológicos de ^{Silveira (2002)} revelan que las mandíbulas de larvas de H. erato al inicio del desarrollo son fuertemente dentadas, sin estructuras accesorias y, por tanto, incapaces de triturar alimentos rígidos, lo que explicaría la mortalidad cuando son sometidas a alimentación con hojas duras. A medida que transcurre la ontogénesis larval, los individuos se alimentan progresivamente de hojas cada vez más duras (^{Rodrigues y Moreira 1999}) se sugiere que el desarrollo de crestas y tubérculos conspicuos en la región molar de las mandíbulas de larvas de quinto instar, observados en este estudio, posiblemente es lo que les permite que trituren y consuman hojas rígidas.

Diversos autores sugieren que las adaptaciones mandibulares en insectos herbívoros están sujetas a sus hábitos alimenticios y a las características del recurso utilizado por los mismos (^{Snodgrass 1935}; ^{Bernays 1991}) ya que las mandíbulas son las únicas estructuras encargadas de seleccionar y cortar el alimento en fragmentos menores que puedan ser ingeridos (^{Chapman 1998}). Según esto, hojas con diferentes niveles de dureza requerirían diferentes niveles de esfuerzo por parte del herbívoro (Elpino-Campos 2010); hojas más duras necesitarian de más esfuerzo y una musculatura mandibular mayor y, en contraste, hojas más suaves no demandarían un incremento de la musculatura mandibular (^{Bernays 1986}).

Considerando solamente las hospederas viables para la especie, P. misera tiene hojas más suaves y menos nutritivas que P. suberosa (^{Kerpel 2004}); pese a esto, P. misera es la planta que confiere mejor desarrollo larval a H. erato (^{Menna-Barreto y Araújo 1985}; ^{Périco 1995}; Kerpel 2004). En lo que se refiere a dureza de las hojas, las pasifloráceas utilizadas en este estudio varian significativamente (^{Silveira 2002}; ^{Kerpel 2004}; ^{Elpino-Campos 2010}). Nuestros resultados muestran que las larvas de H. erato alimentadas desde el inicio de su desarrollo en dichas plantas no sufrieron cambios significativos en las dimensiones de sus mandíbulas ni en los músculos aductores. Además, independiente de las plantas hospederas, los músculos aductores crecieron proporcionalmente menos que las mandíbulas en todas las larvas, lo que puede deberse a que la energía metabólica invertida en cambios morfológicos sea totalmente direccionada a originar modificaciones en la forma mandibular, especificamente, y no necesariamente en su tamaño ni en el tamaño de los músculos (^{Molen et al. 2007}). En este estudio, los cambios de forma propiamente dicha (ver definición usada en morfometría geométrica en ^{Molen et al. 2007}) evidenciados son discutidos a continuación.

Pese a que el efecto de la planta hospedera no repercutió en el tamaño de la mandíbula, si lo hizo en su forma, la cual fue diferente dependiendo de la Passiflora que las larvas comieron. Como fue registrado en la literatura, se esperaría que las larvas alimentadas con P. suberosa, con hojas más duras (^{Kerpel 2004}), tuvieran dientes incisivos más lisos cuando se comparan con los individuos criados en los otras tres hospederas, que poseen hojas más suaves y menos densas (^{Elpino-Campos 2010}). Esto no sucedió. Pese a que mandíbulas con dientes aplanados (o ausentes) se asocian a insectos que se alimentan de hojas duras (^{Bernays y Janzen 1988}), nuestros resultados revelaron que los individuos que comieron P. suberosa, de hojas más duras, desarrollaron dientes más largos y conspicuos que los criados en P. caerulea y P. misera, que tienen hojas más suaves.

Otro aspecto importante, es que los individuos de H. erato consumen progresivamente hojas más duras a medida que el desarrollo larval avanza (^{Elpino-Campos 2010}) por lo que cambios en la resistencia y dureza de las mandíbulas a medida que la ontogénesis transcurre también serían esperados, mas fueron descartadas por Elpino-Campos en estudio detallado realizado en 2010. La plasticidad fenotípica entendida como una capacidad adaptativa de los individuos a las condiciones que les son impuestas, siempre a partir de un fenotipo preexistente (^{Whtiman y Ananthakrishnan 2009}) nos lleva a sugerir que los dientes más pronunciados en las larvas alimentadas con P. suberosa son una optimización de la mandíbula cortadora, preexistente en estos individuos, para maximizar el efecto de “corte” de las hojas rígidas. En otros hospederos como P. misera y P. caerulea, los individuos presentan dientes menos conspicuos; pues al ser hospederos de hojas más blandas (^{Elpino-Campos 2010}) el acceso estaría facilitado y las adaptaciones plásticas no serían requeridas en la mandíbula.

Passiflora suberosa, P. misera y P. caerulea ya fueron usadas en estudios de desarrollo larval de H. erato (^{Rodrigues y Moreira 1999}; ^{Elpino-Campos 2010}; ^{Kerpel 2004}; ^{Mugrabi-Oliveira y Moreira 1996}b; ^{Périco y Araújo 1991}; ^{Périco 1995}; ^{Menna-Barreto y Araújo 1985}) mostrando que, en algunas regiones donde las tres plantas están disponíbles, P. misera es el hospedero en el cual las larvas llegaron más rapidamente al estado adulto (^{Menna-Barreto y Araújo 1985}; ^{Périco 1995}; ^{Rodrigues y Moreira 2002}, ²⁰⁰⁴) a pesar de tener una menor cantidad de nutrientes que las otras hospederas (e.g. P. suberosa) (^{Kerpel 2004}). Por tal motivo, las larvas necesitan consumir mucho más tejido para compensar el déficit nutricional y, en consecuencia, gastan más tiempo alimentándose (^{Elpino-Campos 2012}). En términos energéticos, consumir hojas blandas es más favorable, aunque la calidad del hospedero sea menor, pues es más barato alimentarse de tejido suave por más tiempo, que invertir metabolicamente en adaptaciones mandibulares que permitan ingerir hojas más duras y más nutritivas, como fue el caso de los individuos alimentados exclusiva y obligatoriamente con P. suberosa.

Predicciones sobre la evolución del aparato bucal de larvas de H. erato con relación al consumo de P. actinia no fueron posibles debido a la inexistencia de datos experimentales previos sobre la dureza de sus hojas. Sin embargo, nuestros resultados muestran que individuos alimentados con hojas de esta planta poseen mandíbulas similares a los alimentados con P. misera, sugiriendo que P. actinia sería una planta con características similares, de hojas suaves y blandas, lo que aún necesita ser corroborado en futuros estudios.

Conclusiones

Se demostró que la planta hospedera utilizada como alimento durante la ontogénesis de larvas de la mariposa H. erato puede moldear la forma de sus mandíbulas como respuesta a una adaptación plástica de los individuos para acceder al recurso vegetal de una forma más eficiente. En este estudio, larvas alimentadas exclusivamente con las hojas de P. suberosa, que son más duras, desarrollaron dientes significativamente más largos que los individuos alimentados con las otras pasifloráceas, consideradas más suaves. Lo anterior contradice lo propuesto por otros autores de que dientes largos y prolongados no son aptos para consumir tejido vegetal rígido y son propios de especies herbívoras que comen hojas blandas. Sugerimos que el aumento en la longitud de los dientes inducido por comer P. suberosa junto con el desarrollo de crestas y tubérculos en la región molar de las mandíbulas que H. erato, más que una contradicción a la literatura conocida, puede entenderse como una adecuación que parte de una condición morfológica preexistente (mandíbula cortadora), mediado por plasticidad fenotípica, que es más barata en términos energéticos y optimiza el proceso de alimentación de estos insectos.