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Introducción
Los fitoplasmas son patógenos de plantas que pertenecen al grupo de las bacterias gram-positivas. Estos patógenos habitan en los tubos cribosos del floema de las plantas y en diferentes órganos de su insecto vector (Bertaccini et al. 2014). En la naturaleza los fitoplasmas son transmitidos por insectos vectores en una manera propagativa y persistente, frecuentemente, permaneciendo infectivos durante toda su vida (Weintraub y Beanland 2006; Bosco y Tedeschi 2013). Como los fitoplasmas están limitados al floema, su transmisión entre plantas es por insectos del orden Hemiptera que se alimentan del floema, principalmente, Cicadoidea, Fulgoroidea y Psylloidea (Weintraub y Beanland 2006).
La transmisión del fitoplasma depende del número de plantas que este puede infectar, como también de la población del vector y su hábito alimenticio: monófaga, oligófaga y polífaga (Lee et al. 2000). La transmisión se basa en tres etapas fundamentales: adquisición, latencia e inoculación (Bosco y Tedeschi 2013). Durante la adquisición, el insecto ingiere el fitoplasma al alimentarse sobre una planta infectada (Dickinson et al. 2013). El periodo de latencia, o de incubación, es el intervalo de tiempo entre adquisición y el inicio de infectividad (Bosco et al. 2009). Durante esta fase, el fitoplasma invade el cuerpo del insecto vía hemolinfa, se multiplica y llega a las glándulas salivares (Bosco y Tedeschi 2013; Rashidi et al. 2014). Una vez se completa el periodo de latencia, el insecto puede inyectar los fitoplasmas directamente en los tubos cribosos de plantas sanas (Hogenhout et al. 2008). Por lo tanto, los vectores putativos pueden ser aislados, individualmente o en lotes, con plantas sanas para evaluar la capacidad de transmisión del fitoplasma.
Los fitoplasmas del grupo 16SrIV causan enfermedades con síntomas tipo amarillamiento letal (STAL) en palmas de diferentes zonas geográficas (Mpunami et al. 2001). En la actualidad, este grupo se ha dividido en seis subgrupos, 16SrIV-A (Vázquez-Euán et al. 2011), 16SrIV-B (Tymon et al. 1998), 16SrIV-C (Tymon et al. 1997), 16SrIV-D (Córdova et al. 2000; Harrison et al. 2002), 16SrIV-E (Martínez et al. 2008) y 16SrIV-F (Harrison et al. 2008). El grupo 16SrIV-A, incluye al fitoplasma del amarillamiento letal del cocotero (ALC), que ha causado grandes devastaciones de áreas cocoteras de Jamaica, Florida (EE. UU.) y México (Myrie et al. 2007; Harrison et al. 2008; Vázquez-Euán et al. 2011). Sin embargo, estos subgrupos de STAL, pueden diferir en su epidemiología, la susceptibilidad de los cultivares de coco y los insectos vectores (Mpunami et al. 2001).
El ritmo de identificación de fitoplasma no ha ido a la par con la identificación de sus correspondientes vectores (Weintraub 2007). Al igual que para muchas enfermedades causadas por fitoplasma, en otros cultivos a nivel mundial, en cocotero el Haplaxius crudus Van Duzee, 1907 (Hemiptera: Cixiidae), es el único vector del ALC identificado a la fecha (Howard 1986) y potencialmente, dérbidos del género Cedusa spp. en Jamaica (Brown et al. 2006). En Estados Unidos se sospecha que el Flatidae Ormenaria rufifascia (Walker, 1851), y el Derbidae, Omolicna joi Wilson, Halbert & Bextine, 2014, pueden ser vectores del fitoplasma 16SrIV-D que causan la enfermedad del bronceado letal [LBD] (Powell et al. 2015).
La búsqueda de insectos vectores de fitoplasmas causantes de enfermedades con STAL en palmas ha sido infructuosa (Dollet et al. 2011), crítica y, por consiguiente, aún se dificulta su control. En las investigaciones recientes sobre vectores putativos del ALC solo se han usado herramientas moleculares para determinar la presencia de fitoplasma en los insectos en estudio. Mpunami et al. (2001) asociaron la transmisión de la enfermedad letal (LD) en Tanzania con el Derbidae Diostrombus mkurangai (Wilson, 1987) y a Meenoplus sp. (Hemiptera: Meenoplidae). Curiosamente, D. mkurangai ha sido reportado como potencial vector del fitoplasma ‘Ca. Phytoplasma palmicola’ en Mozambique (Bila et al. 2017) y de la enfermedad de Kerala Wilt en la India (Edwin y Mohankumar 2007), por lo que esta especie pudiera albergar más de un grupo de fitoplasma relacionado. En la provincia de Cabo Delgado, norte de Mozambique, se descubrió que algunos Pentatomidae de las especies Platacantha lutea (Westwood, 1844) portaban el mismo fitoplasma identificado en cocotero enfermo (Dollet et al. 2011). Con este mismo enfoque, Cicadellidae de la especie Nedotepa curta Dmitriev, 2016 y el Derbidae, Proutista fritillaris (Boheman, 1838) fueron encontrados positivos al fitoplasma causante del amarillamiento letal de Costa de Marfil (CILY) (Kwadjo et al. 2018). Cabe señalar, que la detección positiva a fitoplasma en un insecto, no demuestra su capacidad como vector del patógeno; sin embargo, estas detecciones pueden ayudar para que los investigadores realicen experimentos de transmisión con vectores putativos (Bila et al. 2017). Hasta este estudio se desconocía la identidad de insectos portadores de fitoplasma del ALC en las áreas de Tabasco, México. Sin embargo, las poblaciones de H. skarphion Kramer, 1979 (Hemiptera: Cixiidae), Oecleus snowi Ball, 1905 (Hemiptera: Cixiidae) y Persis foveatis Caldwell, 1944 (Hemiptera: Derbidae) eran abundantes en las palmas con sintomatología del ALC. Por lo cual, se exploraron estas especies en búsqueda de posibles vectores del fitoplasma del grupo 16SrIV.
La identificación del agente causal del ALC se realiza mediante la técnica reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en regiones variables dentro del gen 16S rARN (Davis y Lee 1993) o 16 - 23Sr (Smart et al. 1996). Esto permite la detección y caracterización molecular de fitoplasmas en palmas e insectos. La mayoría de los ensayos con PCR convencional implican un procedimiento de PCR anidada para mejorar la sensibilidad. Sin embargo, la PCR en tiempo real ha demostrado alta especificidad y amplio rango de detección (Christensen et al. 2013), además, es mucho menos sensible a la contaminación ya que no requiere ningún procesamiento post-PCR (Jarausch et al. 2010). La detección de PCR en tiempo real combina la amplificación y la detección en un mismo paso, al correlacionar el producto de la PCR de cada uno de los ciclos con una señal de intensidad de fluorescencia (Christensen et al. 2013). Esta técnica se ha utilizado principalmente para cuantificar la concentración de fitoplasma en las plantas (Brown et al. 2007). Considerando las ventajas descritas sobre PCR en tiempo real, se planteó el objetivo de identificar insectos con presencia de fitoplasma del grupo 16SrIV. Estos resultados buscan ampliar el conocimiento sobre especies de insectos hospederos de fitoplasma asociados a palmas con STAL. Además, esta detección sirve para reducir el número de especies que podrían ser convenientemente seleccionadas para realizar ensayos de transmisión, aumentando la probabilidad de identificar el vector de la enfermedad (Liu et al. 2017).
Materiales y métodos
Recolecta de insectos
Los cíxiidos y dérbidos se recolectaron sobre las de palmas Adonidia merrillii (Becc.) Becc. y Cocos nucifera L. La presencia de fitoplasma del grupo 16SrIV en estas dos especies de palmas fue confirmada por PCR en tiempo real.
Las capturas de insectos se llevaron a cabo en los municipios de Cárdenas y de Cunduacán, Tabasco, México. La recolecta se realizó en dos periodos del día: 07:00 - 09:00 hs y 18:00 - 20:00 hs. Los insectos se capturaron del foliolo de las palmas usando la trampa manual descrita por Narváez et al. (2018) . El uso de este sistema ayuda a capturar insectos minimizando el estrés y los daños mecánicos que pudieran sufrir durante la manipulación. Los insectos se almacenaron en etanol al 90 % a - 20 °C hasta su posterior identificación y extracción de ADN.
Identificación de insectos
En el laboratorio, los especímenes fueron separados en morfo especies y, posteriormente, al microscopio-estereoscopio se hizo su identificación a nivel de especie de acuerdo con las claves de Kramer (1979); Sforza et al. (1999); Bartlett et al. (2014) y Wilson (2005). Algunos dérbidos solo se identificaron a nivel de género.
Análisis molecular
El ADN total de cada insecto se extrajo utilizando el método descrito por Harrison et al. (1996) y Brown et al. (2006). Se eliminó el etanol de los insectos antes de iniciar el procedimiento de extracción. Los insectos fueron colocados individualmente en microtubos de 1,5 ml con 300 µl de buffer de extracción CTAB [2 % CTAB; 100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 20 mM EDTA, pH. 8,0; 3M NaCl; 1 % PVP-40 y 1 % 2-mercaptoetanol] y fueron macerados con micro pistilos. Las muestras maceradas se incubaron por 1 hora a 65 °C, se enfriaron a temperatura ambiente y se les agregó 300 µL de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1). Las mezclas se emulsionaron con vortex a alta velocidad y luego se centrifugaron a 14.000 rpm por 10 minutos para separar las fases, y los ácidos nucleicos se precipitaron de la fase acuosa con acetato de sodio 3M y volúmenes de isopropanol frío (30 µl y 180 µl, respectivamente) a -20 °C por 1 h. Los ácidos nucleicos se sedimentaron por centrifugación por 10 minutos a 14.000 rpm. Las pastillas de ADN se lavaron con 100 µL de etanol al 70 %, se secaron a temperatura ambiente y re-suspendidas en 30 µl de buffer TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH. 8). El ADN total obtenido de los insectos se visualizó por electroforesis en geles de agarosa al 1 % en buffer TAE 1X teñido con bromuro de etidio.
PCR en tiempo real
El ADN total extraído de cada insecto fue diluido en 1:10 con agua desionizada estéril, y de esta dilución se utilizó 2 µl como molde para cada mezcla de reacción de PCR tiempo real. La mezcla de reacción para las amplificaciones por PCR en tiempo real fue realizada de acuerdo con Córdova et al. (2014) . Las reacciones fueron realizadas en volúmenes de 20 µl. Cada reacción contenía 10 μl de TaqMan Universal PCR con AmpErase UNG (uracil N-gluccolasa) (Applied Biosystems, EE. UU.), 1 μl de mezcla de cebador que contiene 900 nM de cada cebador, 2 µl sonda (250 nM), 2 µl de muestra del molde de ADN y 5 μl de agua grado biología molecular (Invitrogen, Carlsbad, EE. UU.). Para la detección de fitoplasma asociado al amarillamiento letal de cocotero, subgrupos 16SrIV-A, D y E, se utilizó el par de cebadores TaqMan LY16S-LSF (5´- GCTAAAGTCCCCACCATAACGT-3´) y LY16S-LSR (5´-CGTGTCGTGAGATGTTAGGTTAAGT-3´) y la sonda (FAM-CCCCTGTCGTTAATTG-NFQ) (Córdova et al. 2014). La amplificación fue realizada utilizando un termociclador Rotor-Gene® Q (Qiagen, EE. UU.). La PCR fue realizada en dos etapas: un ciclo previo a la reacción a 50 °C por dos minutos y otro ciclo a 95 °C por 10 minutos para activar la polimerasa AmpliTaq Gold, seguido de 40 ciclos de amplificación a 95 °C durante 15 segundos y 1 minuto a 61 °C. Después se cuantificó el producto de la reacción. Los valores de ciclo umbral (Ct) de cada reacción de PCR se establecieron manualmente para intersectar la fase exponencial de las curvas de amplificación, pero las líneas de base se establecieron automáticamente por Rotor-Gene Q Series Software 2.0.2 (QIAGEN, EE. UU.). El control negativo utilizado fue ADN extraído de plantas asintomáticas y agua estéril. El control positivo fue ADN de palma (Acc. No. GU473590) e identificada como 16SrIV-A (Vázquez-Euán et al. 2011).
Resultados y discusión
Se recolectaron 66 individuos de Cixiidae y 29 de Derbidae sobre palmas de cocotero y A. merrillii con ALC. En la Tabla 1 se presenta el número de individuos identificados por familia y especie. Del total de insectos capturados y analizados con la técnica de PCR tiempo real, usando la sonda TaqMan y los cebadores específicos para fitoplasma del grupo de amarillamiento letal (16SrIV), 11 Haplaxius, seis Oecleus y siete Persis fueron positivos para este patógeno. La PCR en tiempo real utilizado en este estudio demuestra que tiene la capacidad de detectar insectos positivos al fitoplasma del ALC como lo mencionan Myrie et al. (2011) .
Dado que, en este estudio, del total de insectos positivos, el 100 % fue capturado durante la mañana (Tabla 1), lo cual, sugiere una mayor oportunidad de realizar recolectas de insectos positivos durante este periodo, con la finalidad de realizar ensayos de transmisión. En reciente ensayo de transmisión se ha demostrado que H. crudus puede trasmitir fitoplasma 16SrIV -A y -D a palmas de Pritchardia pacifica Seem. & H. Wendl. (CICY, resultados no publicados).
Tabla 1 Detección de fitoplasma del grupo 16SrIV por PCR en tiempo real en cíxiidos y dérbidos (Hemiptera). Individuos recolectados en Cárdenas y Cunduacán, Tabasco, México.
| Especies | Mañana | Tarde | Total de insectos | ||
|---|---|---|---|---|---|
| Pos. | Neg. | Pos. | Neg. | ||
| Cixiidae | |||||
| Haplaxius crudus | 0 | 5 | 0 | 14 | 19 K |
| Haplaxius skarphion | 11 | 16 | 0 | 8 | 35 K, C |
| Oecleus snowi | 6 | 6 | - | - | 12 C |
| Derbidae | |||||
| Persis foveatis | 7 | 14 | - | - | 21 C |
| Otros Derbidae | 0 | 8 | - | - | 8 C |
| Total | 24 | 49 | 0 | 22 | 95 |
Palma de captura: K= Adonidia merrilli; C: Cocos nucifera . Pos.= positivos; Neg.= negativos.
Detección de fitoplasma 16SrIV en muestras de insectos
El cíxiido, H. crudus es el único vector confirmado del ALC en el continente americano (Howard et al. 1983) y tiene importancia económica por su papel como vector de este patógeno y su asociación al cocotero en la etapa adulta (Tsai et al. 1976; Howard 1986). En el presente estudio, durante febrero y marzo del 2015, se capturaron 19 individuos de esta especie en el municipio de Cárdenas. Ningún individuo fue positivo a fitoplasma del grupo 16SrIV con PCR en tiempo real (Tabla 1), a pesar de que A. merrillii, palma en la cual se realizaron las capturas por la mañana y noche, fue positiva a ese fitoplasma. Haplaxius crudus se alimenta de forma restringida del floema ubicado en las hojas de palmas o en su totalidad de plantas monocotiledóneas (Howard 1986). También puede permanecer inmóvil durante largos periodos en la superficie del envés de las hojas, próximas al nervio central o utilizar como refugio el punto donde los foliolos se unen al raquis (Howard 2001). Tsai y Kirsch (1978), observaron durante cinco meses que el 65,25 % de los individuos de H. crudus es atraído a las palmas de cocotero durante las horas de tarde. Los adultos emigran a palmas en la noche y durante las mañanas muchos regresan al pasto cuando las temperaturas comienzan a incrementar después de la salida del sol (Reinert 1977). Sin embargo, ciertas especies de palmas y variedades son más atractivas que otras a los adultos de H. crudus (Howard 1986).
El número de individuos de H. crudus capturados sobre las hojas de A. merrilli en el presente trabajo puede ser considerado bajo. En contraste, Reinert (1977) menciona que se pueden encontrar hasta 50 individuos adultos de este cíxiido/hoja de cocotero. Sin embargo, algunos autores reportan bajo porcentaje de insectos positivos a pesar de capturar y analizar un gran número de individuos de esta especie. Así, Vázquez-Euán (2010), analizó un total de 1,809 individuos de H. crudus capturados en cuatro sitios distintos del estado de Yucatán durante 2007 - 2008, de ellos 23 casos fueron positivos, es decir, 1,3 % del total de insectos donde la presencia de plantas positivas al ALC había sido confirmada. Además, después de analizar alrededor de 800 individuos de H. crudus capturados en sitios afectados por ALC, la detección positiva fue obtenida en el 4 % de los insectos probados. Este porcentaje tan bajo de positivos podría estar estrechamente relacionado al poco éxito que han tenido los ensayos de transmisión en otras regiones de América, sin lograr la transmisión, como en Jamaica (Brown et al. 2006; Eden-Green 1979) y México (Dzido 2010, com. pers.). También se han utilizado plantas de cocotero en edad no reproductiva y especies de palmas más pequeñas para realizar ensayos de transmisión (Thomas y Norris 1980); sin embargo, no se ha logrado la transmisión con H. crudus en varias regiones del Caribe fuera de la Florida. Así mismo, en África se han repetido ensayos de transmisión para identificar el vector del Cape Saint Paul Wilt (CSPWD) en Ghana, siendo el principal sospechoso Myndus adiopoduemeensis Synave (Homoptera: Cixiidae) (Dery et al. 1996).
En este estudio, de 35 individuos del congénere H. skarphion, 11 fueron positivos al fitoplasma del grupo 16SrIV (Tabla 1), lo que se considera alto, si se compara con las detecciones de fitoplasmas realizadas en plantaciones de cocotero en otros países. Dollet et al. (2010) en la provincia de Granma, Cuba, registraron otro cíxiido, Nymphocixia caribbea (Fennah) abundante en una plantación donde había ALC y encontraron 15/91 individuos positivos al fitoplasma del ALC. Por el contrario, Mpunami et al. (2001) en las búsquedas de vectores de enfermedad letal del cocotero en Tanzania reportaron un número bajo de insectos positivos al fitoplasma, 8/1270 de la especie Diastrombus mkurangai Wilson (Homoptera: Derbidae) y 4/14 de Meenoplus spp. (Meenoplidae).
Otra especie de la familia Cixiidae asociada a C. nucifera y A. merrilli positivas a fitoplasma del grupo 16SrIV fue O. snowi. Al efectuar el diagnóstico molecular por PCR en tiempo real para la detección del fitoplasma (Tabla 1), se obtuvo que seis individuos resultaron positivos al 16SrIV. La distribución de O. snowi fue revisada por Kramer (1977), aunque sólo para el norte de México. Aunque gran parte de la fauna de Oecleus mesoamericana aún no se ha estudiado sistemáticamente, esta especie es particularmente importante como potencial vector de fitoplasmas del 16SrIV (Bartlett et al. 2018). Estos resultados resaltan la importancia que puede tener esta especie como vector putativo de fitoplasmas en las plantaciones de cocotero.
El análisis de insectos de otras familias como vectores putativos del fitoplasma del grupo del ALC aportó resultados favorables (Tabla 1). De 21 individuos de P. foveatis, siete adultos capturados en plantas de cocotero de las comunidades de Miahuatlán 2da secc., Cunduacán y Habanero 2da. Secc., Cárdenas, fueron positivos al fitoplasma 16SrIV. Otras especies de dérbidos de los géneros Cedusa y Otiocerus, que se capturaron en palmas de cocotero de Pailebot y R/a Habanero del municipio de Cárdenas. Dos de tres individuos de Cedusa, resultaron positivos al fitoplasma del grupo de ALC mientras que los especímenes de Otiocerus fueron negativos. En Jamaica, Brown et al. (2006) , reportan que de 13 Derbidae que portaban el fitoplasma del grupo del ALC, seis tenían una cepa diferente de fitoplasma del grupo ALC. Esto indica que para el género Cedusa los fitoplasmas podrían pertenecer a diferentes subgrupos que integran al grupo 16SrIV.
En este estudio, la detección positiva de H. skarphion, O. snowi y P. foveatis nos lleva a considerar que es probable que exista un vector del ALC distinto a H. crudus, en Tabasco. Sin embargo, algunas investigaciones reportan que los insectos recolectados en campo y con la presencia fitoplasmas, han sido incapaces de transmitir el patógeno en cautiverio (Galetto et al. 2019). Es importante anotar que para que el fitoplasma sea transmitido, debe ingresar a células específicas de las glándulas salivares y pasar a la hemolinfa. En caso contrario el insecto se clasifica como hospedero “sin salida” (Brown et al. 2006), por lo tanto, la penetración y reproducción del fitoplasma en las glándulas salivales son requisitos previos para su transmisión (Hogenhout et al. 2008). El periodo de latencia es el tiempo entre el momento en que el insecto adquiere el fitoplasma y el desarrollo de una concentración infecciosa en las glándulas salivales. Así, los fitoplasmas pueden ser detectados en el interior de los insectos después de alimentarse de plantas enfermas (Dollet et al. 2010), sin ser capaces de transmitir el patógeno (Lu et al. 2016). En consecuencia, varias especies de insectos son capaces de adquirir, pero no de transmitir los fitoplasmas (Galetto et al. 2019). Bressan et al. (2006), consideran que probablemente los insectos pueden albergar células de fitoplasmas en sus cuerpos, pero la capacidad para transmitir fitoplasma depende de la combinación patógeno-planta hospedera-insecto vector, y varios factores, como un mecanismo molecular especifico de reconocimiento del hospedero. El ADN del fitoplasma puede ser detectado en el intestino del insecto o después de alimentarse de plantas infectadas sin que sea capaz de transmitir el patógeno (Lu et al. 2016). Aunque la detección del fitoplasma en un insecto no necesariamente provee el estatus como vector (Liu et al. 2017), sí, es un paso hacia su identificación como tal. Por lo que realizar ensayos de transmisión con estas especies sería recomendable para su rol putativos de vectores del ALC.
