Extracción de los aceites e hidrolatos para los formulados botánicos.

El procedimiento para la obtención de los hidrolatos de las especies de plantas, E. globulus, P. alliacea y R. graveolens, se efectuó mediante el método de extracción por arrastre de vapor, mientras que la obtención de aceites de J. curcas y R. communis, se realizó mediante el método de presión mecánica previamente descrito (^{Zambrano et al. 2015}).

Procedimiento para el método de extracción por vapor.

En una balanza analítica (ADAM®) se pesó el material vegetativo seco, 62,59 g, 74,06 g, 290,62 g, de hoja de E. globulus, hoja de R. graveolens y hoja y tallo de P. alliacea, respectivamente. Cada material pesado, se colocó en un matraz de tres bocas de 1000 mL conectado al equipo de destilación por arrastre de vapor, conformado por un balón generador de vapor de 1000 mL, un matraz de 250 mL, dos placas calefactoras digitales IKAC-MAG HS7, un termómetro de vidrio, un condensador, conexiones de vidrio y goma.

Se calentó el balón hasta su punto de ebullición y el vapor generado pasó a un segundo balón, extrayendo así la esencia del material vegetativo, que se suspendió con el consumo del 70% a 85% del agua colocada. El destilado se colectó en un matraz con una mezcla de aceite y agua, que luego se ubicó en un embudo para separar por diferentes densidades el aceite esencial del hidrolato, con la ayuda de una pipeta se determinó la cantidad de aceite e hidrolato extraído y se procedió a almacenarlos en frascos de vidrio de ámbar.

Procedimiento para el método de extracción por presión.

Se pesaron por triplicado 3 kg de semillas de J. curcas y R. communis y luego se procedió al secado, con una estufa de 101 a 105 °C hasta que el peso de la muestra permaneció constante. El prensado manual se realizó en una extractora discontinua o hidráulica con 15 t máximas de presión en frío, así mismo otra muestra con extractora mecánica continua tipo expeler, con una capacidad de 80 - 100 kg.h^-1 de semilla. Ambas emitieron aceites con presencia de gomas (fosfátidos).

Una vez extraído el aceite, se derivó con el desgomado de estos aceites, que consistió en agregar ácido cítrico de 0,2 al 0,7% a una temperatura entre 60 a 90°C durante un tiempo promedio de 5 a 20 min posterior a su almacenamiento y filtración a través de un embudo Büchner, implementado a un matraz de kitasato de 1000 mL (KIMAX®), cuyo agente de retención era papel filtro cualitativo en círculo con un diámetro de 15 cm, el aceite fue succionado con una bomba de vacío (GAST®).

Una vez filtrado, se realizaron análisis químicos del aceite para estimar el contenido de fósforo e índice de acidez. El contenido de Fósforo se obtuvo siguiendo la metodología AOCS Ca-12-55 aplicable a aceites vegetales, crudos, desgomados y refinados, para determinar la presencia de fosfátidos, se usó la espectrofotometría que consiste en pesar 3 g de aceite más 0,5 g de ZnO que se incineraron a 550 a 600°C, a los que se le agregó 5 ml de HCL, se filtró y se tomó una alícuota, a la que se adicionaron 5 ml de KOH al 50% enrazando a 100 mL, luego se tomaron 10 mL, y se adicionaron 8 mL de N₂H₆SO₄ y 2 mL de Na₂MoO₄, y la mezcla se calentó en baño María durante 10 min +/- 30 s para aforar con agua destilada y se procedió a verificar el valor arrojado por el espectrofotómetro mediante la fórmula:

PPM Fósforo= (10(A-B)) / ((PM))

La formulación contenía 6 mL de nonil fenol (4-(2,4-di metil-3 heptanil) fenol) en 100 mL del aceite filtrado. En el aceite filtrado de R. communis con una dosificación de 8 mL de nonil fenol en 100 mL de aceite.

Elaboración de dieta para la cría masiva del gusano cogollero.

La dieta se elaboró con los ingredientes y cantidades señalados en la metodología propuesta por ^{Morales et al. (2010)}. En una licuadora se colocaron 60 g de levadura, 6 g de ácido ascórbico, 4 g de Metil-p-Hidroxibenzoato y 1000 mL de agua, los que se licuaron por 30 s. Posteriormente se añadió a la mezcla, 400 g de frijoles (previamente cocidos) licuando por un min y 30 s. En otro recipiente se calentaron 500 mL de agua (T: 80°C), y se le añadieron lentamente 500 g de agar removiendo constantemente, una vez diluido se añadió a la mezcla previa y se licuó por un min. La mezcla final aún caliente, se colocó en envases de plásticos (500 mL) herméticos que luego fueron ubicados en refrigeración.

Establecimiento de la colonia de Spodoptera frugiperda .

En un lote de maíz de tres semanas, se colectaron aleatoriamente cuatro masas de huevos de S. frugiperda, y una vez eclosionadas las larvas, fueron individualizadas y alimentadas con la dieta artificial preparada. Cuando alcanzaron la fase de pupa se separaron por sexos y se distribuyeron en proporciones de 6:3 ♂: ♀ en condiciones de oscuridad con alimento (azúcar o miel de abeja diluida) para asegurar la cópula y sobrevivencia de los adultos. Con las masas de huevos de los adultos colectados en campo, se inició una cría de laboratorio y los bioensayos se realizaron a partir de huevos obtenidos de individuos criados en el laboratorio. Se utilizaron larvas de segundo y tercer estadio.

Bioensayos.

Para la realización de los bioensayos se utilizaron los tres hidrolatos preparados E. globulus, R. graveolens y P. alliacea, y los dos aceites formulados de R. communis y J. curcas (Factor A) preparados a concentraciones de 5, 10 y 15 mL.L^-1 de agua (Factor B) (Tabla 1). Se incluyeron en la evaluación, un insecticida comercial sintético (cipermetrina, 200 g.L^-1 de i.a.) en dosis de 1.5 mL L^-1 de agua, uno botánico (azadiractina, 4 g.L^-1 de i.a.) en dosis de 2 mL.L^-1 de agua y un testigo absoluto (agua destilada), resultando los siguientes tratamientos.

Mortalidad de larvas.

Larvas de S. frugiperda, fueron colocadas individualmente en envases plásticos de 10 mL que contenían dieta artificial. Luego fueron asperjadas con uno de los tratamientos mediante atomizadores plásticos de 100 mL. Se evaluó la mortalidad a las 24, 48 y 72 h. Se emplearon 75 larvas por tratamiento (18 tratamientos), evaluándose un total de 1350 larvas.

Una larva se consideró muerta, si no se movió después de ser colocada ventralmente y tocada con un pincel No. 1. Se calculó el porcentaje de mortalidad utilizando la fórmula de ^{Abbott (1925)}:

Efecto antialimentario.

Para determinar el efecto antialimentario de los tratamientos se empleó la prueba de elección indicada por ^{Rossetti et al. (2008)}. Larvas de S. frugiperda, se colocaron individualmente dentro de envases plásticos, y no se alimentaron durante 4 h. Posteriormente, en cada envase se colocaron dos discos de 5 cm de diámetro de hojas de maíz, uno fue sumergido en los tratamientos por 10 s el otro en agua destilada. Después de 24 h, se estableció el porcentaje de área consumida (estimando visualmente mediante el uso de papel milimétrico). Se emplearon 75 larvas por tratamiento (18 tratamientos), evaluándose 1350 larvas en total. Se calculó el índice de inhibición alimentaria (%IIA) mediante la ecuación:

%IIA = [1-(T/C)] x 100

Dónde:

%IIA = Índice de Inhibición Alimentaria.

T = consumo promedio de discos foliares tratados con los formulados.

C = consumo promedio de discos foliares en los testigos absolutos.

Peso de larvas.

Fueron alimentadas con hojas de maíz de 5 cm de diámetro embebidas en cada uno de los tratamientos, se les estimó el peso al iniciar el ensayo. Posteriormente a las sobrevivientes, se les determinó el peso diario con la balanza durante 10 días para evaluar los posibles efectos de los tratamientos sobre este parámetro.

Análisis de datos.

Se utilizó un diseño factorial AxB+3, en un arreglo completamente al azar (DCA), considerando como factores, los formulados a partir de las cinco especies de plantas, el testigo botánico comercial (azadiractina a dosis de 2 mL.L^-1), el testigo químico sintético (cipermetrina, 1,5 mL.L^-1) y el testigo absoluto (agua destilada) (Factor A), asperjando los formulados a tres concentraciones (5, 10 y 15 mL.L^-1 de agua) (Factor B), para un total de 18 tratamientos. Las variables analizadas fueron: porcentaje de mortalidad, índice de inhibición alimentaria y peso de larvas. En el análisis se comprobó el cumplimento de los supuestos estadísticos (homogeneidad, normalidad, independencia y aditividad), y se realizaron las comparaciones de medias mediante la prueba de Fisher (p < 0,05) usando el Software estadístico Infostat (^{Di Rienzo et al. 2019}).

Mortalidad de larvas.

En la Tabla 2 se muestra que el testigo químico sintético (cipermetrina) causó la mayor mortalidad promedio de larvas de S. frugiperda (68,7%, p < 0,05) seguido del tratamiento a base de J. curcas en dosis de 15 mL.L^-1 de agua (33,7%), sin diferencias con P. alliacea y el insecticida botánico comercial a base de azadiractina en la misma dosificación (Tabla 2). La menor mortalidad de larvas fue detectada bajo el tratamiento con R. communis en dosis de 5 mL.L^-1 de agua (3,9%). Aunque los tratamientos con azadiractina y P. alliacea en dosis de 15 mL.L^-1 de agua no difirieron de J. curcas en la misma dosificación, bajo este último tratamiento hubo mayor mortalidad de larvas a las 24 h (16,6%) comparado con la observada en azadiractina (1,4%) y la detectada en P. alliacea en dosis de 15 mL.L^-1 de agua (6,9%) (Fig. 1). Adicionalmente, el aceite de J. curcas en dosis de 15 mL.L^-1 de agua a las 48 y 72 h, mostró la mayor mortalidad con valores que alcanzaron 34 y 50%, respectivamente (Fig. 1).

Figura 1 Mortalidad de larvas de Spodoptera frugiperda Smith causada por los diferentes tratamientos a las 24, 48 y 72 h después de la aspersión. 

Efecto antialimentario.

El Índice de Inhibición Alimentaria en larvas de S. frugiperda resultó significativamente superior cuando se les ofreció hojas de maíz tratadas con cipermetrina, así como con las tres concentraciones de P. alliacea, con R. graveolens en dosis de 10 y 15 mL.L^-1 de agua y con R. communis en dosis de 15 mL.L^-1 de agua (Tabla 2).

Peso de larvas.

El peso de las larvas sobrevivientes también fue afectado por el tratamiento que recibió la hoja de la que se alimentó (Tabla 2). El aumento del peso no pareció ser afectado por hojas de maíz tratadas con E. globulus a dosis de 5 y 10 mL.L^-1 de agua y con azadiractina, mientras que, en el resto de los tratamientos, ese peso resultó inferior, cuyos valores más bajos se detectaron en larvas alimentadas sobre hojas tratadas con P. alliacea a concentraciones de 10 y 15 mL.L^-1 de agua y con R. communis en dosis de 15 mL.L^-1 de agua (Tabla 2).

De acuerdo con los resultados, tres formulados botánicos mostraron mayor actividad insecticida sobre larvas de S. frugiperda. Por un lado, aceites extraídos de semillas de J. curcas a una concentración de 15 mL.L^-1 de agua causaron la segunda mortalidad de larvas más alta después del insecticida sintético, lo que comenzó a ser notorio desde las 24 h e incrementó hasta las 72 h de evaluación, superando la mortalidad observada a las 24 h en larvas tratadas con el insecticida botánico comercial a base de azadiractina.

Estos resultados son similares a los obtenidos en otras investigaciones. Esteres de forbol extraídos de semillas de J. curcas causaron 40% de mortalidad de larvas de S. frugiperda e inhibieron más del 50% del consumo de hojas de maíz en condiciones de laboratorio (^{Devappa et al. 2012}). Extractos obtenidos a partir de hojas de esta misma especie causaron 60% de mortalidad cuando fueron tratadas larvas de tercer estadio de Spodoptera litura Fabricius, 1775 (Lepidoptera: Noctuidae) (^{Ingle et al. 2017a}).

El efecto de extractos de J. curcas también ha sido evaluado en otras especies de plagas agrícolas detectando una actividad insecticida superior a la encontrada en este estudio. Estudios de laboratorio mostraron que aspersiones de aceites de J. curcas a concentración de 15% causaron el 100% mortalidad de individuos de Aphis fabae Scopoli, 1763 (Hemiptera: Aphididae) a las 96 h post exposición (^{Habou et al. 2011}). Extractos obtenidos de la cubierta de la semilla de J. curcas asperjados a concentraciones de 5% y 15% causaron una mortalidad de 100% y 60% en larvas de Plutella xylostella L 1758 (Lepidoptera: Plutellidae) y Heliothis armigera (Hübner, 1805) (Lepidoptera: Noctuidae), en condiciones de laboratorio (^{Ingle et al. 2017b}). Asimismo, las larvas de H. armigera alimentadas con discos de hojas de algodón asperjadas con extractos de semilla de J. curcas al 5% disminuyeron significativamente el peso (30%) desde las 24 hasta las 72 h de exposición (^{Ingle et al. 2017b}).

La actividad insecticida de aceites de semillas de J. curcas fue observada sobre las especies, Callosobruchus maculatus Fabricius, 1775 y Bruchidius atrolineatus (Pic, 1921) (Coleoptera: Chrysomelidae) plagas de semillas almacenadas de Vigna unguiculata L. (^{Habou et al. 2014}). Concentraciones de 15% mostraron que la mortalidad de adultos de ambas especies incrementó a partir de las 48 h post aplicación, hasta alcanzar más de 85% siete días después de aplicación (^{Habou et al. 2014}). La eficacia de aceites extraídos de semillas de J. curcas, también ha sido evaluada en el laboratorio, sobre el nematodo parasito, Haemonchus contortus de importancia veterinaria sobre el que afectó la eclosión de los huevos (^{Monteiro et al. 2011}). Por otro lado, el 100% de las larvas del mosquito trasmisor de la malaria, Anopheles gambiae Giles, 1902 (Diptera: Culicidae) tratadas in vitro con extractos de hojas de esta planta murieron después de las 48 h de aspersión (^{Okbatinsae y Haile 2017}).

En este estudio, el hidrolato a base de P. alliacea, y el aceite de R. communis en la dosis de 15 mL.L^-1 de agua además de causar mortalidad de larvas tuvieron efecto tanto en la inhibición de la alimentación, como en el peso de las larvas de S. frugiperda. Un ensayo de campo conducido en un cultivo de maíz evaluando varios formulados botánicos, mostró 80% de eficiencia para el control de S. frugiperda de un tratamiento a base de P. alliacea (^{Figueroa et al. 2019}). Un experimento de laboratorio evaluó el efecto de varios macerados de plantas sobre S. frugiperda en el preparado con raíces de P. alliacea que causaron mortalidad en el 98% de las larvas evaluadas (^{Tagliari et al. 2010}). La actividad insecticida de formulados a base P. alliacea ha sido reportada para otras especies de plagas agrícolas. Extractos de semillas de P. alliacea aplicados a una concentración del 10% causaron una mortalidad aproximadamente 40% sobre larvas de Spodoptera exigua (Hübner, 1808) (Lepidoptera: Noctuidae) y una inhibición antialimentaria que superó el 80% (^{Barreto et al. 2012}).

Petiveria alliacea también ha mostrado efectividad en el control de otras plagas insectiles. Un experimento de campo conducido en V. unguiculata en Ogbomoso, Nigeria, evaluó entre los tratamientos el efecto de extractos de hojas de P. alliacea sobre las densidades poblacionales del trips de las flores, Megalurothrips sjostedti (Trybom, 1908) (Thysanoptera: Thripidae), el barrenador de la vaina de las leguminosas, Maruca vitrata Fabricius, 1787 (Lepidoptera: Crambidae) y la chinche, Riptortus dentipes Fabricius, 1787 (Hemiptera: Alydidae). Para las tres plagas evaluadas, el número de individuos disminuyó de 1 a 0 individuos desde la primera a la cuarta semana post tratamiento en parcelas tratadas con P. alliacea al 20% sin diferencias con las parcelas que fueron asperjadas con el insecticida sintético a base de deltametrina (^{Olaitan y Abiodun 2011}). Al igual que J. curcas, P. alliacea muestra propiedades antihelmínticas. Un estudio de laboratorio realizado para evaluar el efecto de extractos botánicos sobre nematodos ciatostominos parásitos de equinos mostraron más del 90% de inhibición en la eclosión de huevos cuando se aplicó P. alliacea una concentración de 75 μg.mL^-1 o superior (^{Flota-Burgos et al. 2017}).

En cuanto a R. communis, en un ensayo ejecutado en el estado de Puebla, México en maíz, fue registrada la disminución de un 67% del daño foliar causado por S. frugiperda cuando se aplicaron extractos de hojas al 30% de esta especie de planta (^{Ortiz-García et al. 2018}). Extractos acuosos provenientes de frutos verdes de R. communis al 10% mostraron bioactividad, sobre el peso de larvas y pupas de S. frugiperda criadas en dieta artificial en condiciones de laboratorio (^{Santiago et al. 2008}).

La actividad insecticida de estas plantas se atribuye a componentes almacenados en sus diferentes órganos. En el caso de J. curcas, extractos y ésteres de forbol del aceite de la semilla han sido señalados como protectores promisorios contra una gama de insectos plagas antes y después de la cosecha en una variedad de cultivos (^{Kumar y Tewari 2015}; ^{Ingle et al. 2017b}). En cuanto a P. alliacea, se han aislado algunos compuestos bioactivos incluidos esteroides, terpenoides, saponinas, polifenoles, taninos, flavonoides, cumarinas y alcaloides (^{Luz et al. 2016}), mientras que en semillas de R. communis existen, aceite de ricino, ricina, los alérgenos proteicos Ric c1 y Ric c3 y ricinina con actividades bioinsecticidas (^{Ramos-López et al. 2010}).

Dado los efectos adversos de uso indiscriminado de los plaguicidas órgano sintéticos, los formulados de origen botánico han incrementado su uso en los últimos años comparado con otras técnicas no convencionales (^{Figueroa et al. 2019}). A pesar de la actividad insecticida demostrada para el control de S. frugiperda y otras especies plagas, la utilización de compuestos botánicos para el control no se ha consolidado como técnica de manejo. Los resultados obtenidos abren las posibilidades a evaluar otras concentraciones, mezclas de compuestos botánicos o la evaluación de su combinación con otras alternativas racionales en el manejo integrado de plagas. Todo con el fin de disminuir el uso frecuente de plaguicidas órgano sintéticos que tanto impactan sobre el equilibrio del agroecosistema, el ambiente en general y disminuir el riesgo de los efectos sobre la salud humana.