Natalia Tarazona; Nathaly Ramírez; Paalo Moreno; Yajaira Combariza; Carolina Guzmán^*

Centro de Estudios e investigaciones Ambientales - CEIAM, Universidad Industrial de Santander
(UIS), Carrera 27 calle 9, Bucaramanga, Colombia.
^*caguzlun@uis.edu.co

Fecha Recepción: 11 de febrero de 2011
Fecha Aceptación: 15 de septiembre de 2011

El rápido incremento del consumo mundial de biodiésel ha generado un superávit de glicerol, correspondiente al 10% en peso del biocombustible producido. Siendo Colombia uno de los principales productores de biodiésel en Latinoamérica con 516000 ton/año, es necesario buscar usos alternativos para el exceso de glicerol generado. En esta investigación se aislaron microorganismos nativos presentes en el glicerol crudo proveniente de dos plantas Santandereanas (A y B) productoras de biodiésel y se evaluó su crecimiento en medio mineral utilizando glicerol USP (24 g/L) como única fuente de carbono. El crecimiento de los microorganismos se determinó por el método de peso seco y lecturas de absorbancia. La cantidad de glicerol consumido se determinó por medio de cromatografía líquida de alta eficiencia-Detector de Índice de Refracción (HPLC-IRD). En la muestra A, se identificó un consorcio compuesto por bacterias Gram positivas y Gram negativas, y el hongo Aspergillus fumigatus . De la muestra B, se aisló Bacillus circulans . Dos de los microorganismos aislados utilizaron el glicerol como fuente de carbono.

Palabras clave: biodiésel, glicerol, microorganismos nativos.

The rapid increase in biofuels world consumption has generated a glycerol surplus of about to 10 wt% of the overall biodiesel. With Colombia as one of the principals Latin America biodiesel producer, with 516000 ton/year it is necessary to look for glycerol alternative uses. In this work native microorganisms present in raw glycerol (A and B) were isolated, from two Santander biodiesel plants, and their growth was followed in mineral culture using glycerol USP (24 g/L) as the sole carbon source. Microorganism's growth was measured by dry weight and absorbance measurements. Glycerol intake by the microorganisms was determined by High Performance Liquid Chromatography-Refraction Index Detector (HPLC-IRD). A consortium consisting of Gram-positive and Gram-negative bacteria and Aspergillus fumigatus fungus was identified in sample A. On the other hand, Bacillus circulans was isolated and identified from sample B. Two of the microorganisms isolated used the glycerol as carbon source.

Keywords: biodiesel, glycerol, native microorganism.

El biodiésel es en la actualidad el único biocombustible capaz de desplazar completamente su homólogo del petróleo, ya que es compatible con los motores diésel, tiene un proceso de producción simple, gran variedad de materias primas y ocurre a temperatura y presión moderada. Su principal subproducto es el glicerol, que corresponde aproximadamente al 10% en peso del biodiésel producido. A pesar de tener gran aplicación en la industria (elaboración de jabones, alimento para ganado, estiércol orgánico y biogás, entre otros), el glicerol generado a partir de biodiésel ha creado un superávit, que ha disminuido el precio a nivel mundial y causado que su costo de refinación sea económicamente inviable [1-3]. Siendo Colombia uno de los principales productores de biodiésel en Latinoamérica (producción a final de 2010: 516000 ton/año) [4], es necesario investigar formas alternativas para utilizar este glicerol mediante transformaciones químicas y microbiológicas[1, 2].
Las bioconversiones son favorables desde el punto de vista de pretratamiento de materia prima y condiciones de operación del proceso. El uso de microorganismos nativos ofrece una diversidad de rutas metabólicas, mayor adaptación durante las condiciones de fermentación y disminuye el uso de antibióticos en comparación con los microorganismos genéticamente modificados. Entre los microorganismos que fermentan el glicerol sobresalen los géneros Clostridium, Citrobacter, Klebsiella, Bacillus y Enterobacter con la producción de metabolitos como 1,3 propanodiol, butanol, ácido cítrico, ácido láctico y polihidroxialcanoatos (metabolito generado a nivel intracelular). Estos compuestos son ampliamente utilizados en diferentes sectores industriales como: la producción de plásticos biodegradables, área textil, aditivos alimenticios, producción de biocombustibles, medicina y agricultura, entre otros campos [1, 2, 5].
Por lo anterior, se plantea la búsqueda de cepas nativas en el glicerol, residuo de la industria del biodiésel, que utilicen esta materia prima para la producción de sustancias de mayor valor agregado a nivel industrial.

Aislamiento de microorganismos nativos
Los microorganismos fueron aislados a partir de glicerol crudo (GA y GB) proveniente de dos empresas Santandereanas productoras de biodiésel que utilizan aceite de palma como materia prima.
Las muestras se homogenizaron y diluyeron en solución peptonada 0,1 g/L y fueron sembradas por duplicado en medios de cultivo selectivos y no selectivos (agares: Recuento; Nutritivo; Man-Rogosa & Sharpe (MRS); Sulfito-Polimixina-Sulfadiazina (SPS); Papa Dextrosa Agar (PDA) y CZAPECK). Una vez obtenidos cultivos axénicos se realizó la identificación de las cepas por sus características macroscópicas, microscópicas, bioquímicas y mediante la aplicación de claves taxonómicas [6-9]. Como criterio de selección del microorganismo, se tuvo en cuenta su crecimiento a partir de la materia prima procesada y el no crecimiento en cultivos tomados del ambiente exterior.

Condiciones de fermentación bacteriana
Se preparó un preinóculo de cada cultivo bacteriano en 100 mL de medio Luria Bertani Broth (LB) [10]. Composición (g/L): peptona 10; extracto de carne 3; y NaCl 5. Se llevó a agitación a 225 rpm a 37°C hasta alcanzar una densidad óptica (D.O.) de 0,5 medida en espectrofotómetro a 540 nm (Genesys 20. Thermo Spectronic, NY, USA). El medio de fermentación utilizado fue el medio mineral Rennie, 1981 modificado por Salinas [11], compuesto por 24 g/L glicerol USP; K₂HPO₄ 1,5; KH₂PO₄ 1,5; (NH₄)NO₃ 2,0-Reemplazado por (NH₄)₂SO₄; MgSO₄.7H₂O 0,5; NaCl 1,0; 1 ml FeSO₄.7H₂O 16 mM + EDTA 18,6 mM. El ensayo de fermentación se realizó por duplicado, con una proporción de 5% v preinóculo/medio de sales, en un agitador orbital (Unimax 1010 - Heidolph, Germany) a 37°C durante 48h. La velocidad de agitación fue de 250 rpm durante las primeras 17h de fermentación y de 200 rpm después de las 17h hasta el final del proceso [10].

Condiciones de fermentación fúngica
Se preparó una suspensión de esporas a partir del raspado superficial de un agar PDA y mediante diluciones decimales seriadas se ajustó un preinóculo con una concentración de 1x10⁷ esporas/mL. La fermentación se llevó a cabo en el medio mineral descrito anteriormente en erlenmeyers de 250 mL de capacidad con una proporción de 7,4% v preinóculo/medio de sales [12]. El ensayo se realizó con una velocidad de agitación de 180 rpm a temperatura ambiente durante 4 días utilizando muestras destructivas.
Como control de calidad de los ensayos, se procesó en paralelo un medio de cultivo sin el microorganismo seleccionado, así como, una coloración de Gram del sobrenadante obtenido en cada tiempo de fermentación.

Medición de biomasa
A tiempos establecidos de fermentación, se tomaron alícuotas para la cuantificación de la masa celular. La determinación en bacterias se realizó mediante la lectura de densidad óptica (540 nm) y en los hongos por peso seco [13].

Medición del consumo de glicerol
Luego de centrifugar cada muestra, fue filtrado el sobrenadante (membranas de diámetro de poro: 0,45 μm de polivinil difluoruro, Millipore, Bedford, MA, USA) para ser analizado por cromatografía líquida de alto rendimiento - HPLC (Agilent Technologies 1100, Sigma Aldrich. USA), con detector de índice de refracción. Se utilizó una columna de intercambio catiónico Supelcogel C610-H a 40°C, utilizando como fase móvil ácido sulfúrico 6mM con un flujo 0,8 ml/min. El procesamiento de los datos se realizó a través del sistema de datos Agilent ChemStation [14]. Los análisis cromatográficos fueron desarrollados por Ángela Vásquez Cardeño (Joven Investigador Colciencias, 2009).

Las muestras recolectadas de dos plantas industriales, presentan un pH alcalino (GA: 9,5) y ácido (GB: 6,0) asociado con el tipo de catalizador y los tratamientos desarrollados. Por otra parte, contienen un porcentaje de jabones de 7,5 y 2,9, respectivamente.

Aislamiento de microorganismos nativos
Una vez realizada la caracterización fenotípica de los microorganismos, fueron identificados los géneros Bacillus y Aspergillus. Estos corresponden a bacterias Gram positivas esporuladas y hongos filamentosos hialinos, respectivamente. Además se encontró un consorcio microbiano compuesto por bacterias Gram positivas y Gram Negativas. Las características de los microorganismos encontrados se describen en las Tablas 1 y 2.

B. circulans se caracteriza por la producción de enzimas como la α-amilasa y la &946;-glucanasa, así como, la síntesis de compuestos utilizados en medicina (butirosinas). Adicionalmente, produce metabolitos intracelulares tipo polihidroxialcanoatos [15]. En cuanto a Aspergillus fumigatus se ha descrito su capacidad de producir metabolitos secundarios como antibióticos, proteasas y se ha demostrado su capacidad de remover metales pesados de muestras de la industria minera.

Resultados de la fermentación
En el análisis de los cromatogramas realizados, aparece un único pico, el cual coincide con el tiempo de retención del patrón de glicerol. En las Figuras 1, 2 y 3 se observa la utilización de glicerol como fuente de carbono por parte de los microorganismos identificados.

En las Figuras 1 y 2 se observa un crecimiento exponencial de estas bacterias a diferentes tiempos de incubación. Sin embargo, el consumo de sustrato de Bacillus circulans fue significativamente mayor (1295 ppm), que el presentado por el consorcio bacteriano (294,5 ppm).
En el caso del hongo, se observa un crecimiento significativo a partir de las 40 h de fermentación. A pesar de haberse demostrado en estudios previos su capacidad fermentativa en presencia de glicerol y almidón [16], la utilización del glicerol por parte de Aspergillus fumigatus fue menor (5,1 ppm) comparado con Bacillus circulans.
Las concentraciones de glicerol superiores a la inicial, pueden estar relacionadas con la variabilidad del método de cuantificación del sustrato, así como, una posible coelución con un metabolito producido por el microorganismo.
El comportamiento metabólico de Bacillus circulans relacionado con el consumo de glicerol en el tiempo, permite su inclusión en estudios posteriores utilizando glicerol crudo. La optimización del proceso de fermentación permitirá obtener metabolitos útiles para la industria con alto valor agregado.

A pesar de las impurezas propias de las muestras de glicerol crudo producto de la industria del biodiésel, fue posible aislar un consorcio bacteriano, y las especies Bacillus circulans y Aspergillus fumigatus como microorganismos nativos. Dos de estos microorganismos tuvieron la capacidad de aprovechar de forma eficiente este subproducto como única fuente de carbono, sobresaliendo el consumo de 1295 ppm por Bacillus circulans.

Las autoras agradecen a la Dirección de Investigación y Extensión de la Facultad de Salud (DIEF, UIS); Vicerrectoría de Investigación y Extensión (VIE, UIS); Gobernación de Santander; Neomundo por la financiación dada a esta investigación y a los estudiantes de pregrado: Carolina Becerra, Laura Vergel, Yeimmy Rodríguez, Leidy Rojas, Juan Fernando Cancino y Javier Gómez, por su trabajo y entrega al proyecto.

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