Activación de las cepas de microalgas

Se utilizaron cepas de Scenedesmus sp. y Chlorella sp., provenientes del Banco de Cepas del Laboratorio de Bioprocesos de la Universidad Francisco de Paula Santander, estas cepas se aislaron mediante la utilización de medios selectivos y se encuentran caracterizadas morfológicamente, las mismas cepas han sido usadas y reportadas previamente ⁸. En otro reporte estas mismas cepas se cultivaron en medio PCG en condiciones de autotrofía y se activaron a 30°C, con una intensidad lumínica de 200μmol/m²s (provista por lámparas fluorescentes de luz fría de día), una agitación de 125rpm, 1vvm y un pH de 8 para Scenedesmus sp. y de 6,8 para Chlorella sp. ⁹

Acondicionamiento de las cepas de microalgas a heterotrofia

Una vez activadas las cepas, se procedió a su adaptación a condiciones de heterotrofía (crecimiento en ausencia de luz y utilizando un sustrato orgánico). Se utilizó el medio PCG modificado ¹⁰, el cual contiene glucosa en una relación 12:1 con respecto a la fuente de nitrógeno. En esta etapa se evaluó la producción de biomasa y de lípidos para luego seleccionar la cepa más productiva. Las condiciones de cultivo para esta etapa fueron: agitación a 150rpm, 1vvm de caudal de aire, pH 8 para Scenedesmus sp. y pH 6,8 para Chlorella sp., a 30°C.

Cinética de crecimiento a escala de 10L

Una vez seleccionada la cepa, se procedió a realizar la cinética en el Biorreactor BioFlo115. Se utilizó la consola de control y se adaptó un recipiente a capacidad de 15L, con el fin de tener un volumen operacional de 10L. La cepa se inoculó en el medio PCG modificado ¹⁰, al 10% del volumen. Las condiciones fueron de agitación a 150rpm, caudal de aire de 1,2vvm, temperatura 28°C y pH de 6,8. Se realizó medición de biomasa, consumo de nutrientes y determinación final de lípidos al concluir la cinética.

Métodos de análisis

Para analizar la cinética de crecimiento de 10L se determinó la producción de biomasa, el consumo de nitrógeno, fósforo y glucosa. La biomasa se cuantificó en peso seco mediante filtración al vacío usando membranas de nitrocelulosa de 0,22μm de diámetro de poro (Millipore ®) ¹⁰. La cuantificación de nitratos se realizó por el método de Brucina-Ácido Sulfámico midiendo posteriormente la absorbancia a 410nm ¹¹. La cuantificación de fósforo inorgánico se realizó a 660nm por el método modificado de Taussky y Shorr como establece Perales H ⁹. Para determinar el consumo de glucosa se empleó el método DNS ¹⁰.

Extracción y cuantificación de lípidos

La biomasa fue floculada utilizando Cloruro de aluminio (AlCl₃) en una concentración de 40g/L en una dosis de 1,5mL de floculante por cada 100mL de medio. Posteriormente, fue secada en el liofilizador Labcom y pulverizada en mortero. Finalmente, se extrajeron los lípidos, con un solvente en un extractor Soxhlet ⁸.

La cuantificación y determinación del perfil lipídico se realizó siguiendo la metodología propuesta por Sánchez et al.¹². Los ésteres metílicos resuspendidos en 1mL de h-hexano fueron analizados en un cromatógrafo de gases marca: Thermo scientific, modelo: Trace 13007 890A, equipado con un detector modular de ionización de llama (FID) (IEC) y una columna capilar TR-5MS, 30m, 0,25mm ID, 0,25μm HP-5 con un gradiente de temperatura de 10°Cmin^-1 desde 125 hasta 255°C y 270°C por 3min. Se empleó Hidrógeno como gas portador, manteniendo un flujo de 1mLmin^-1 El volumen de inyección fue de 1μl en modo Split 100:1. La temperatura del inyector y del detector fue de 250°C.

Análisis de datos

Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Los resultados fueron verificados estadísticamente por la prueba T de Student (P<0,05) utilizando el programa Sigma-Plot-Stat versión 14.

Acondicionamiento de las cepas de Chlorella sp. y Scenedesmus sp., a heterotrofia y cinética de crecimiento a escala de 1L

Las cepas de Chlorella sp. (CHL2) y Scenedesmus sp. (SCE) crecieron satisfactoriamente en medio sólido PCG modificado, sin embargo el tiempo necesario para evidenciar crecimiento en caja Petri fue mayor para SCE (19 días) en comparación con CHL2 (12 días).

Dentro del diverso grupo de las microalgas, las pertenecientes a la familia de las algas verdes en su gran mayoría pueden crecer bajo condiciones heterotróficas. De hecho, algunas especies de microalgas presentan mayor velocidad de crecimiento ^13,14 y productividad de lípidos ^15,16 en condiciones heterotróficas ¹⁷. En el caso de Chlorella se han reportado varios estudios del comportamiento bajo este régimen nutricional, ^18,19 y se ha logrado alcanzar valores de ácidos grasos de hasta 3 órdenes de magnitud por encima de los alcanzados en autotrofía ²⁰. Para el caso de Scenedesmus, son muy pocos los trabajos bajo condiciones de heterotrofía, se reporta que la productividad de biomasa de este género de microalgas puede ser 2,5 veces mayor en comparación al cultivo autotrófico.

Los resultados de la producción de biomasa y consumo de nutrientes de las cepas se muestran en la Figura 1, donde se aprecia que el crecimiento de la cepa CHL2 fue relativamente mayor (1,2±0,0141g/L) en comparación a la máxima alcanzada por la cepa SCE (0,8200±0,0235g/L). Como se puede observar ocurre un descenso de biomasa a partir de la hora 150 lo cual se debe a que la cantidad de sustrato disponible para este tiempo de la cinética es prácticamente nula, lo que evidencia que el número de células que mueren es mayor al número de células que se generan.

Figura 1 Cinética de Crecimiento CHL2 y SCE. 

La mayor parte de las algas verdes pueden crecer heterotróficamente en oscuridad, lo que supone que estos organismos poseen la capacidad de obtener a expensas de un sustrato orgánico, en este caso glucosa, la energía y el carbono necesario para la síntesis celular. Para el caso de Chlorella varios autores han reportado crecimiento de esta alga bajo condiciones de heterotrofia; así mismo, se ha reportado que al cultivar células de Chlorella zofingiensis con 30g/L de glucosa en la oscuridad, se obtiene un rendimiento mayor de biomasa (41%), lípidos totales (98%) y una productividad de lípidos de 354mg/Ld equivalente a 91% en comparación con el cultivo foto autotrófico ¹⁴. De igual forma, se reportan las ventajas de utilizar células heterótrofas como inóculo de un cultivo fotoautotrófico en estanques abiertos para la producción a gran escala de biomasa con alto contenido de lípidos de Chlorella sorokiniana; adicionalmente compararon el desempeño de cultivos fotoautotróficos y heterotróficos encontrando que la velocidad de crecimiento, la densidad celular y la productividad fue 7,4 veces mayor bajo condiciones heterotróficas ²¹. En relación a especies del género Scenedesmus, son pocos los trabajos reportados, no obstante se encontró para Scenedesmus incrassatulus una producción de biomasa de 1,21g/L, mayor a la alcanzada en condiciones de autotrofía ⁹. Sin embargo, en la presente investigación, la producción de biomasa fue menor, lo cual se podría explicar con el hecho que a diferencia del trabajo referido, no se utilizó extracto de levadura.

Otros trabajos reportan valores de biomasa para Chlorella sp. (0,88g/L) y Scenedesmus sp. (0,68g/L) en condiciones de autotrofía ²² por debajo de los alcanzados en este trabajo.

Para la condición de heterotrofia algunos investigadores sugieren que especies de los géneros Scenedesmus y Chlorella son capaces de utilizar la glucosa probablemente, a través de la vía de las pentosas fosfatos del ciclo EmbdenMeyerhof-Parnas ^10,23, ya que la glucosa-6fosfato deshidrogenasa, la primera enzima de esta vía, tiene una alta actividad en las células de estos géneros ¹⁰. Existen reportes que en Scenedesmus obliquus la densidad celular inducida por la glucosa puede ser 3,1-3,6 veces mayor que la inducida por la luz u otro tipo de sustratos orgánicos ²⁴. Esto se explicaría dado que la energía obtenida a partir de la glucosa por una mol de sustrato produce 38 moles de ATP, lo que es una ganancia mayor a la alcanzada por la fotosíntesis donde se alcanzan 18 moles de ATP ²³. Los resultados obtenidos en esta etapa con relación a la producción de biomasa, mostraron que la cepa CHL2 se adaptó mejor a las condiciones de heterotrofia en comparación con el resultado mostrado por la cepa SCE.

La Figura 2 muestra la concentración de lípidos totales alcanzados tanto para la cepa CHL2, como para la cepa SCE en condiciones de heterotrofia, al igual que un control en condiciones de autotrofía para cada cepa. Se observa, que el mayor contenido de lípidos [mg de lípido/g de biomasa seca] se alcanzó con la cepa CHL2 en condiciones de heterotrofía (150,4±2,3), seguido de la cepa CHL2 en condiciones de autotrofía (92,5±4,625), para el caso de la cepa SCE el porcentaje más alto se presentó en la condición heterotrófica (62,4±0,823) en comparación con la condición autotrófica (51,3±4,0). De acuerdo a los resultados obtenidos, se puede evidenciar que la condición heterotrófica favoreció a la cepa CHL2, perteneciente al género Chlorella en comparación a la cepa SCE perteneciente al género Scenedesmus.

Se ha reportado para Chlorella protothecoides un 55% de lípidos en condiciones heterotróficas en un medio con acetato de sodio enriquecido con un hidrolizado de maíz ²⁰. Así mismo, para un cultivo de 2g/L de glucosa y utilizando una cepa de Chlorella sp. de agua dulce, se alcanzó una concentración de 13% de lípidos en peso seco ²⁵. Y para el caso de Chlorella vulgaris se alcanzó un porcentaje entre 14%-28% de lípidos en condiciones de heterotrofia utilizando alrededor de 3g/L de glucosa ²⁶.

Las condiciones de cultivo influyen en la producción de biomasa y acumulación de lípidos ²⁷, el hecho de crecer en ausencia de luz y con sustrato orgánico permite que exista un menor gasto energético en la síntesis de lípidos; además se puede controlar la velocidad de crecimiento en condiciones de ausencia de luz en comparación con procesos fotoautotróficos, la razón radica en que en condiciones de heterotrofia es el sustrato orgánico, quien ejerce un papel fundamental en la síntesis tanto de biomasa como de lípidos, cuando la velocidad de crecimiento disminuye, adicionar más sustrato al medio permite mantener una síntesis de lípidos. Caso contrario, con el proceso fotoautotrófico donde la luz pasa a ser el aspecto que ejerce el control sobre el proceso. El problema radica en que a medida que se aumenta la luz, aumenta la densidad celular, llegando a un punto donde el proceso de autosombreado de las células limita el crecimiento y por ende la síntesis de ácidos grasos, así se aumente la intensidad de luz, si el cultivo presenta una alta densidad celular, no es posible mantener un control en la velocidad de crecimiento. Este proceso podría explicar lo obtenido en este trabajo, donde ambas cepas obtuvieron una mayor cantidad de lípidos en condiciones heterotróficas.

Figura 2 Contenido de lípidos en [mg de lípido/g de biomasa seca] de las cepas CHL2 y SCE en condiciones heterotróficas y autotróficas 

La cepa CHL2 perteneciente al género Chlorella mejores resultados en términos de biomasa y sp., se seleccionó para realizar la cinética de de lípidos en comparación con la cepa SCE crecimiento a escala de 10L ya que presentó perteneciente al género Scenedesmus sp.

Figura 3 Cinética de crecimiento de CHL2 en condiciones heterotróficas escala 10L. 

Cinética de crecimiento en el BioFlo115 a escala 10L

En la Figura 3 se puede apreciar que la máxima concentración de biomasa (1,6±0,032g/L) alcanzada en el proceso fue en la hora 180, después de ese tiempo el sistema entró en estado de latencia, donde ya no se evidenció un consumo de sustrato; lo cual se demuestra con una baja sustancial en el consumo de oxígeno durante las primeras 24h del proceso, después de los cuales este valor se mantuvo constante hasta la hora 180. Lo anterior permite inferir que la baja tasa en el consumo de oxígeno se presenta porque no hay requerimiento para crecimiento celular y el poco oxígeno que se consume, se utiliza para actividades de mantenimiento. En cuanto el pH y la temperatura se puede evidenciar que se mantuvieron relativamente constantes y que el sistema de control actuó satisfactoriamente durante la cinética de crecimiento.

En la actualidad, varias investigaciones en biotecnología de microalgas se enfocan en la obtención de cepas con alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados, especialmente; ácido eicosapentaenoico (EPA), araquidónico (AA) y docosahexaenoico (DHA) ²⁸. Las microalgas con contenidos lipídicos altos, han tomado un gran interés para diversos usos, por lo anterior la cantidad de lípidos contenidos en la biomasa, la velocidad de crecimiento, la asimilación de nutrientes y la tolerancia a condiciones ambientales constituyen parámetros de gran importancia ^29,30.

Los resultados aquí obtenidos sobre el contenido de lípidos, corresponden a la cinética realizada en un biorreactor de 10L. En la Figura 4 se relaciona el contenido de lípidos con la concentración máxima de biomasa en peso seco. Se reporta que el contenido lipídico más alto en la cepa de Chlorella sp., se presentó en cultivo heterotrófico con un valor de 158,7±3,87 mglípidos/gbiomasa seca para el caso del cultivo autotrófico (control) se alcanzó un contenido lipídico 88,4±2,63 mglípidos/gbiomasaseca. Las microalgas del género Chlorella han sido ampliamente estudiadas, existen reportes de Chlorella protothecoides donde se ha demostrado en cultivos con glucosa y bajas concentraciones de nitrógeno, valores de lípidos 3,4 veces mayores que en condiciones foto autotróficas ^17,18,19.

Figura 4 Porcentaje de lípidos CHL2 en cinética de 10L. 

Otros autores, han encontrado que el contenido lipídico de Chlorella sp., en condiciones de heterotrofia puede oscilar entre un 10 a 30% en peso seco ²⁵; Cuando se aumenta la concentración de glucosa hasta 10g/L, existe un aumento considerable de la productividad de lípidos ¹³, pero se debe tener en cuenta que concentraciones arriba de 25g/L pueden ocasionar una inhibición por sustrato y por ende una disminución en la concentración de biomasa, afectando directamente la acumulación y producción de lípidos. Cabe resaltar De acuerdo a los resultados de este trabajo se confirmó que el cultivo heterotrófico induce la acumulación de lípidos en comparación al cultivo autotrófico, siendo dos veces más alta, como se observa en la Figura 4. Este aumento se explica dado que la concentración de lípidos es directamente proporcional al contenido de biomasa y esta cantidad de biomasa a su vez, incrementa en condiciones de heterotrofia. Además, tomando en cuenta que al no tener luz los procesos fotosintéticos bajan su intensidad, el consumo de sustrato estará relacionado mayoritariamente en actividades de crecimiento permitiendo que más átomos de carbono estén disponibles para la síntesis de lípidos.

Los parámetros cinéticos se reportan en la Tabla 1; la velocidad de crecimiento se calculó en la fase exponencial del cultivo, la productividad de biomasa y lípidos se determinó hasta la concentración máxima alcanzada. La concentración de biomasa (base seca) presentó el valor más alto en el cultivo heterotrófico (1,6±0,032gPS/L) en comparación con el cultivo autotrófico (0,78±0,01gPS/L). La velocidad de crecimiento más alta se presentó en el cultivo heterotrófico obteniéndose un valor de 0,33d^-1, en comparación al cultivo autotrófico (0,16d^-1). De acuerdo a los resultados obtenidos es evidente que la tasa de crecimiento es aproximadamente dos veces mayor en el cultivo heterotrófico. Según Jacob-Lopes (2009) ³¹, los cultivos autotróficos son dependientes del periodo de exposición a la luz, siendo por tanto, el incremento de la biomasa directamente proporcional al aumento del fotoperiodo. De igual forma, se ha reportado que la intensidad lumínica se puede afectar por diversos factores, entre ellos el aumento de la concentración celular que provoca efectos de sombreados y la formación de zonas oscuras e iluminadas que afectan, los procesos metabólicos ³². En el cultivo heterotrófico la disponibilidad de sustrato viene dada por la adición de la fuente orgánica por lo tanto, la tasa de crecimiento está sujeta a la disponibilidad del sustrato en el medio, a diferencia del cultivo autotrófico la microalga no requiere realizar procesos fotosintéticos para la formación de los azúcares simples ya que estos se proporcionan al medio. Lo anterior permite explicar la diferencia de la velocidad de crecimiento del cultivo autotrófico con el heterotrófico.

Tabla 1 Parámetros cinéticos cepa CHL2 en heterotrofia. 

ND. No se determinó el cultivo autotrófico no contenía glucosa *Se calculó con la concentración alcanzada hasta cuando hubo consumo de sustrato.

Se ha reportado que cuando las microalgas se someten a condiciones de estrés impuestas por estímulos ambientales químicos y físicos, solos o en combinación, ocurre síntesis y acumulación de grandes cantidades de lípidos, acompañada por considerables alteraciones en la composición de los lípidos y ácidos grasos ^33,34,35. En la Tabla 1, se puede apreciar que bajo condiciones de heterotrofia tanto la concentración máxima de lípidos (252,16±2,93mg/Ld) como el porcentaje de acumulación de lípidos (158,7±3,87 mglípidos/gbiomasaseca) fue alrededor de 2 veces mayor en comparación al cultivo autotrófico (68,172±1,68mg/Ld y 88,4±2,63 mglípidos/gbiomasaseca respectivamente). Diversos autores han reportado que el cultivo heterotrófico permite obtener una mayor acumulación de lípidos. En cultivos de Chlorella sp. se reporta una acumulación de lípidos 3,4 veces mayor que las alcanzadas en autotrofía ²⁰, con Tetraselmis suecica se obtuvo que tanto la productividad como la acumulación de lípidos fue tres veces superior a las condiciones de autotrofía ¹³, al cultivar células de Chlorella zofingiensis con 30g/L de glucosa en oscuridad se obtuvo un porcentaje dos veces más alto de lípidos totales y una concentración de lípidos de 354mg/Ld, nueve veces más alta comparada con células el cultivo fotoautotrófico ¹⁴.

Los resultados obtenidos en este trabajo resultan congruentes con lo anteriormente expresado ya que las condiciones más favorables para la obtención de lípidos fue en condiciones de heterotrofia donde además se utilizó una concentración de glucosa menor a las reportadas, siendo el valor de 3g/L de glucosa para este trabajo.

Perfil lipídico de la cepa CHL2 en condiciones de heterotrofia

El contenido y perfil lipídicos de las microalgas son considerados como propios de la especie y no del género, de manera tal que este parámetro varía notablemente entre las especies individuales de cada grupo taxonómico ³⁶. En la Tabla 2, se muestra el perfil lipídico de CHL2, nótese que el ácido graso predominante es el ácido oleico (18:1) con un 28,75% del total de ácidos grasos.

Tabla 2 Perfil lipídico de CHL2 en heterotrofia. 

Varios autores, han reportado que este ácido graso ejerce una acción beneficiosa en los vasos sanguíneos reduciendo el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares ³⁷. Otros ácidos encontrados fueron: ácido palmitoleico (C16:1) 19,75%, ácido araquídico (C 20:0) 19,37%, ácido linoleico (C 18:2) 11,86%, ácido palmítico (C16:0) 7,24%, ácido linolénico ( -C 18:3), 2,61%, ácido erúcico (C 22:1) 4,61%, ácido esteárico (C18:0) 2,4%. Es importante resaltar el ácido palmitoleico, el cual ha sido reportado como un importante constituyente de la dieta humana que ayuda a prevenir enfermedades cardiovasculares ³⁸ y el ácido linoleico es un ácido graso poliinsaturado asociado a la familia de los omega-6, se ha reportado que ayuda a subir las defensas, disminuye los niveles de grasa corporal, disminuye la presión arterial, ayuda a controlar el colesterol y los triglicéridos, reduce el riesgo de enfermedades del sistema circulatorio, ayuda a eliminar las grasas perjudiciales para el organismo, interviene en un buen funcionamiento de los sistemas nervioso y visual ³⁹.

El perfil lipídico encontrado en este trabajo está acorde con reportes previos donde utilizando a Chlorella los ácidos predominantes son: palmitoleico, oleico y araquídico ⁴⁰. Aunque otros autores reportan que los ácidos grasos que más predominan en cepas de Chlorella son el ácido esteárico, el ácido araquídico ³⁷ y el linoleico ⁴⁰. Cabe destacar también que para la cepa CHL2 se detectaron ácidos grasos poliinsaturados esenciales como el ácido linolénico y el ácido eicosapentaenóico (EPA) en donde este último tiene un valor importante como nutracéutico ya que actúa previniendo la formación de bloques nocivos de prostaglandinas tales como; la prostaglandina D2 (induce la vasodilatación, la hiperalgesia y la quimiotaxis de neutrófilos fuertes); la prostaglandina E2 (induce pirexia, hiperalgesia, la quimio taxis de neutrófilos). El EPA también puede aumentar y mejorar la función inmunológica del cuerpo humano ³⁷.

En la Figura 5 se muestra la asociación de los ácidos grasos de acuerdo al grado de saturación, los ácidos grasos saturados son aquellos que solo poseen enlaces sencillos en la unión de los carbonos que componen la cadena; los monoinsaturados poseen una sola insaturación, es decir posee un solo doble enlace en la cadena de carbonos y finalmente los poliinsaturados que poseen dos o más insaturaciones (dobles enlaces) durante toda la cadena de carbonos.

Figura 5 Agrupación de ácidos grasos de acuerdo al grado de saturación. 

Como se observa en la Figura 5 para la cepa CHL2 en régimen heterotrófico, el 54% de los lípidos son monoinsaturados (AGM), el 30,04% son saturados (AGS) y finalmente el 16,74% poliinsaturados (AGP). Según reportes de otros autores, para Chlorella vulgaris el porcentaje de ácidos grasos saturados puede oscilar entre 20% - 30%, mientras que los poliinsaturados (AGP) pueden oscilar del 5%-24% ⁴⁰; para cepas de Chlorella un porcentaje de AGS del 40% y 60% de AGI ⁴⁰ y otros reportan 58,60% de AGS, 15% de AGM y 26,4% de AGP ⁴¹. Al comparar los resultados obtenidos con los reportados en la literatura se puede observar que estos son similares, cabe resaltar que el porcentaje de AGP en este trabajo fue mayor que los ya reportados.

Los PUFA´s tienen un nivel de importancia alto, pueden servir en la prevención y tratamiento de muchas enfermedades cardiovasculares; reducir la presión sanguínea, los niveles de colesterol en sangre y probabilidad de padecer cáncer, entre otras enfermedades. Actualmente se ha reportado que ayuda a la calidad de vida de pacientes con VIH. La biomasa de microalgas en comparación con otras fuentes de ácidos grasos, tales como varias especies de pescado (bacalao, anchoas y sardinas), presenta algunas ventajas como la ausencia de contaminación con metales pesados y ciertas microalgas aún tenían significativamente mayor espectro de PUFA, algunos con cadenas de más de 18 átomos de carbono ⁴⁰. Finalmente, se puede observar que el cultivo heterotrófico resulta promisorio para la obtención de PUFA´s o AGP, ya que la cepa estudiada contiene un perfil lipídico donde la cantidad de ácidos grasos insaturados son alrededor del 70%, cabe resaltar que en este trabajo no se utilizó concentraciones altas de glucosa, ni se utilizaron limitaciones de nutrientes (fósforo o nitrógeno) que podrían inducir aún más, la producción de PUFA´s.