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Revista Colombiana de Química

Print version ISSN 0120-2804On-line version ISSN 2357-3791

Rev.Colomb.Quim. vol.38 no.3 Bogotá Sep./Dec. 2009

 

INDUCCIÓN DIFERENCIAL DE LA ENZIMA PEROXIDASA Y SU RELACIÓN CON LIGNIFICACIÓN EN LOS MECANISMOS DE DEFENSA DEL CLAVEL (Dianthus caryophyllus L.) DURANTE SU INTERACCIÓN CON Fusarium oxysporum f. sp. Dianthi

DIFFERENTIAL INDUCTION OF PEROXIDASE ENZYME AND ITS RELATIONSHIP WITH LIGNIFICATION IN CARNATION DEFENSE (Dianthus caryophyllus L.) MECHANISM AGAINST Fusarium oxysporum f. sp. Dianthi

INDUCAO DIFERENCIAL DA ENZIMA PEROXIDASEEASUARELACAO COM A LENHIFICACAO NOS MECANISMOS DE DEFESA DE CRAVO (Dianthus caryophyllus L.) DURANTE A SUAINTERACCAO COM Fusarium oxysporum f. sp. Dianthi

 

Diana C. Cuervo1, Sixta T. Martinez1' 2, Harold D. Ardila1, Bianca L. Higuera1

1 Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, Bogotá, Colombia.

2 stmartinezp@unal.edu.co

Recibido: 14/07/09 - Aceptado: 15/12/09


RESUMEN

Se evaluó la actividad enzimática peroxidasa (POD) y el contenido de lignina en tallos de esquejes de clavel (Dianthus cayophyllus L.) inoculados con el hongo Fusarium oxysporum f.sp. dianthi (Fod) raza 2, con el fin de determinar su posible participación en la respuesta de defensa y en la resistencia de la planta al marchitamiento vascular. Inicialmente se seleccionaron las condiciones para la extracción y determinación de la actividad enzimática. Se encontró que el tratamiento con buffer citrato 100 mM pH 5,0 con 3% de PVPP presentó los mejores resultados de actividad peroxidasa para la extracción de la enzima a partir de tallos de clavel. Se determinaron las mejores condiciones para la medida de actividad enzimática POD a través de la reacción de oxidación de o-dianisidina con H2O2 seguida a 460 nm. Una mezcla de reacción con una concentración 0,6 mM de o-dianisidina y 2,0 mM de H2O2 en buffer citrato 100 mM a pH 5,5 y 45°C, presentó los mejores resultados para la cuantificación de la enzima. Una vez establecidas las condiciones, esquejes de clavel de una variedad tolerante y una susceptible al marchitamiento vascular fueron inoculados con el patógeno y se evaluaron los niveles de actividad de POD y de acumulación de lignina a diferentes tiempos pos-inoculación. La variedad tolerante (Bárbara), presentó inducción de dicha enzima a las 8 y 48 h pos-inoculación y aumento en el contenido de lignina a 48 y 72 h. A su vez, en la variedad susceptible (Delphi) no se encontraron cambios significativos en los niveles de POD ni en el contenido de lignina. Se estableció, por tanto, que la inducción de la actividad POD está asociada a la lignificación, que a nivel del tallo, hace parte de los mecanismos asociados a defensa en el modelo clavel-Fusarium oxysporum f. sp. dianthi.

Palabras clave: clavel, Fusarium oxysporum, defensa vegetal, peroxidasa, lignina.


ABSTRACT

Peroxidase (POD) enzymatic activity and lignin content in carnation stems (Diant-hus cayophyllus L.) infected with the fungus Fusarium oxysporum f.sp. dianthi race 2 were evaluated with the purpose of determining the possible enzyme participation in the plant defense response and in the resistance to the vascular wilting. Initially, the conditions for extraction and determination of enzymatic activity were selected. It was found that when citrate buffer 100 mM pH 5.0 with 3% PVPP was employed, the results of POD activity in enzyme extract obtained from carnation stems were higher. Best conditions were set for POD activity measure through oxidation reaction of o-dianisidine and H2O2 at 460 nm. A reaction mixture with a concentration of o-dianisidine 0,6mM and H2O2 2.0 mM in citrate buffer 100 mM pH 5.5 at 45 oC displayed the best results for enzyme quantification. Once conditions were established, tolerant and susceptible vascular wilting carnation cuttings were inoculated with the pathogen. In each treatment at stem level, different postinoculation times were evaluated for enzyme activity levels and lignin accumulation. Tolerant variety (Barbara) showed a POD induction at 8 and 48 h pos-inoculation and an increase in lignin content at 48 and 72 h. At the same time, in susceptible variety (Delphi) there were no significant changes in POD levels or lignin contents. Therefore, it was established that POD activity induction is associated to lignification which, at stem level, is part of the mechanisms associated to defense in carnation (Dianthus caryophyllus L.) against Fusarium oxysporum f. sp. dianthi.

Key words: carnation, Fusarium oxysporum, plant defense, peroxidase, lignin.


RESUMO

Foram avaliadas a actividade enzimática peroxidasa (POD) e o conteúdo de lignina em talos de estacas de cravo (Dianthus cayophyllus L.) inoculados com o fungo Fusarium oxysporum f.sp. dianthi raça 2, com o propósito de determinar a sua possível participação na resposta de defensa e à resistência da planta ao murchamento vascular. Inicialmente foram seleccionadas as condiciones para a extracção e determinação da actividade enzimática. Foi encontrado que o tratamento com buffer citrato 100 mM pH 5,0 com 3% de PVPP, apresentou os melhores resultados de actividade peroxidasa na extracção da enzima a partir de talos de cravo. Foram determinadas as melhores condições para medir a actividade enzimática POD a través da reacção de oxidação de o-dianisidi na com H2O2 e com seguimento a 460 nm. Uma mistura de reacção com uma concentração 0,6 mM de o-dianisidina e 2,0 mM de H2O2 em buffer citrato 100 mM a pH 5,5 e 45 °C, apresentou os melhores resultados para a quantificação da enzima. Uma vez estabelecidas as condições, estacas de cravo de uma variedade tolerante e uma susceptível ao murchamento vascular foram inoculadas com o fungo patogénico, e se avaliaram a diferentes tempos pos-inoculação os níveis de actividade desta enzima e de acumulação de lignina. A variedade tolerante (Bárbara), apresentou uma indução de POD às 8 e 48 h pos-inoculação e um aumento no conteúdo de lignina às 48 y 72 h. Por outro lado, na variedade susceptível (Delphi) não se encontraram mudanças significativas nos níveis de POD nem no conteúdo de lignina. Se estabeleceu, por tanto, que a indução da actividade POD está associada à lignificação que a nível de talo faz parte dos mecanismos associados à defesa no modelo cravo-Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raça 2.

Palavras-chave: cravo, Fusarium oxysporum, defesa vegetal, peroxidasa.


INTRODUCCIÓN

El marchitamiento vascular causado por el patógeno Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (Fod) es la enfermedad de mayor impacto para el cultivo del clavel en el mundo. Colombia es el segundo productor mundial de esta flor, y la presencia de la enfermedad genera pérdidas a nivel económico y una disminución significativa en su producción. Para el control del marchitamiento vascular, el sector floricultor ha implementado un plan integrado de manejo basado principalmente en evitar la entrada y diseminación del patógeno en los cultivos (1). Sin embargo, dicho plan, además de aumentar los costos en la producción, genera apenas un control aceptable de la enfermedad, siendo frecuente la aparición de la misma en los cultivos. El desarrollo de nuevas alternativas de control más eficaces, compatibles con los sistemas de producción actuales e inocuos para el medio ambiente, se convierten en una necesidad para el fortalecimiento del cultivo de esta flor en nuestro país. Alternativas de control como el cultivo de variedades tolerantes, el control biológico y el uso de elicitores, han llamado la atención de la comunidad científica en este aspecto. Para el desarrollo de dichas alternativas se requiere un conocimiento detallado de los mecanismos bioquímicos y moleculares involucrados en la interacción planta-patógeno, mecanismos que finalmente van a determinar la resistencia o susceptibilidad a la enfermedad. Se ha encontrado que la infección activa un proceso de defensa multicomponente y compartimentalizado, que tiene como objetivo localizar el patógeno en los tejidos vasculares xilemáticos infectados (2-4). En este proceso, inicialmente se presenta la formación de geles, compuestos principalmente de polisacáridos y compuestos fenólicos en los vasos, ambos exudados de las células parenquimáticas adyacentes al punto de infección. Una vez los fenólicos se fusionan a la pared y a las gomas, estos pueden estar sujetos a reacciones de polimerización y oxidación, con el fin de formar una barrera durable en la interfase de la infección y los tejidos sanos. Este proceso conocido como lignificación, es central en la respuesta de defensa del clavel a este patógeno (5, 6). La enzima peroxidasa desempeña un papel determinante en diversos procesos fisiológicos necesarios para el funcionamiento de la plantas, incluida la lignificación (7-9). La participación de esta enzima en los mecanismos de defensa ha sido ampliamente documentada para diversas especies (8-10), y a pesar de que un incremento en la actividad de esta enzima es frecuente en las condiciones de estrés biótico, para muchos modelos planta-patógeno, incluido el estudiado en esta investigación, dicho aumento en la actividad no se ha relacionado simultáneamente con otros procesos de defensa como la lignificación. La evaluación simultánea de los fenómenos bioquímicos que se presentan durante la interacción in vivo entre la planta y el patógeno son un primer paso en la búsqueda de aquellos procesos que al regular la respuesta de defensa vegetal, pueden ser finalmente determinantes en la resistencia a la enfermedad (10). Con el fin de aportar en el conocimiento de estos fenómenos bioquímicos relacionados con defensa en la interacción clavel-Fusarium oxysporum f. sp. dianthi, en el presente trabajo se evaluaron de manera simultánea los niveles de la enzima peroxidasa y los niveles de lignina, en variedades con diferentes niveles de tolerancia a la enfermedad durante el proceso mismo de la interacción entre estos dos organismos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Extracción de la enzima POD

La primera etapa del presente estudio consistió en la selección de las condiciones para realizar la extracción de la enzima peroxidasa a partir de tallos de clavel. Con tal fin se realizaron ensayos de extracción usando metodologías previamente reportadas para otras enzimas presentes en esta matriz vegetal (11) (Tabla 1). Se pesaron aproximadamente 0,4 g de tallos y se maceraron vigorosamente con nitrógeno líquido. Se adicionó la solución extractora por evaluar y se agitó durante 1 h a 4 °C. Se centrifugó a 12000xg por 30 minutos y el sobrenadante fue separado del precipitado para la determinación de actividad y cuantificación de proteína. El mismo procedimiento se siguió con cada uno de los sistemas de extracción denominados (E1, E2, E3 y E4), usando diferentes aditivos como la PVPP (Polivinil polipirrolidona). La selección se realizó bajo un diseño experimental completamente aleatorio con 4 tratamientos, realizando triplicado de extracción y duplicado de cuantificación de la actividad.

Determinación de actividad enzimática

La medida de la actividad peroxidasa se hizo a través del seguimiento espectrofotométrico a 460 nm cada 10 s por 1 min, de los productos de la reacción de oxidación de la o-dianisidina en presencia de H2O2 y del extracto enzimático (4). La velocidad de la reacción se calculó a partir de la pendiente de la zona lineal de la gráfica A460nm vs. tiempo y la actividad específica se definió como el cambio de la absorbancia a 460 nm por minuto por mg de proteína (ΔAbs460nm/min*mg proteína).

Determinación de los mejores parámetros de actividad enzimática

Se empleó un diseño experimental escalonado con el fin de seleccionar las mejores condiciones para la medida de actividad POD. En primer lugar, se evaluó el pH de la reacción en un intervalo de 3 a 10 utilizando las soluciones reguladoras descritas a continuación para cada uno de los pH evaluados: ácido acético: acetato de sodio 100 mM para pH 3 y 4; ácido cítrico-citrato de sodio 100 mM para pH 4,5, 5 y 5,5; fosfato ácido de sodio-fosfato diácido de sodio 100 mM para pH 6, 6,5, 7, 7,5, 8; y finalmente borato de sodio-ácido bórico 100 mM para pH 9 y 10. El efecto de la temperatura fue analizado en un rango de 5 a 60 °C, y se evaluó la concentración del sustrato o-dianisidina en el intervalo de 0,1 a 1,5mM y de H2O2 de 0,5 a 15 mM.

Cuantificación de proteína

Se determinó según el método de Bradford modificado por Zor y Selinger, 1996 (12), empleando como patrón albúmina de suero bovino.

Material biológico

Para realizar el ensayo in vivo se utilizaron esquejes de clavel con 4 semanas de enraizamiento de las variedades Delphi (susceptible) y Bárbara (tolerante). Se utilizó un aislamiento del patógeno obtenido de plantas susceptibles con síntomas evidentes de marchitamiento, el cual se mantuvo en el medio comercial PDA (Papa-Dextrosa-Agar) con repiques cada 20 días. El inóculo se preparó por transferencia del medio sólido a medio líquido Czapeck Dox-Broth por 10 días a 25 °C con agitación de 90 rpm. El micelio se filtró en gasa estéril y se preparó una suspensión de 1,5x106 conidias/mL (por conteo en el hemocitómetro). Esta suspensión fue utilizada para la inoculación de los esquejes. Todo el material biológico fue suministrado por la empresa Floramérica.

Ensayo in vivo para determinar la inducción de POD

Para evaluar la dinámica de la actividad POD en respuesta a la infección con el patógeno se llevó a cabo un ensayo in vivo con un diseño experimental de bloques al azar para 4 tratamientos: variedad susceptible control, variedad susceptible inoculada, variedad tolerante control y variedad tolerante inoculada. Para ello, esquejes de clavel de cada una de las variedades (Delphi y Bárbara) fueron inoculados por inmersión de sus raíces durante 30 s en la suspensión de conidias (1,5x106 conidias/mL) (13). Los esquejes fueron sembrados en recipientes con sustrato estéril (tierra + cascarilla de arroz) que contenían 300 mL de solución nutritiva. Para asegurar la infección de las plantas con el patógeno, la solución nutritiva tenía una concentración de 1x103 coni-dias/mL (11). Esta solución fue utilizada únicamente para la siembra de los esquejes sometidos a inoculación. Se prepararon de igual modo los respectivos controles, los cuales se sumergieron en agua estéril y se sembraron en un sustrato con solución nutritiva. Los esquejes inoculados y los controles se mantuvieron en las mismas condiciones ambientales. El muestro se realizó a 0, 8, 24, 48 y 72 h pos-inoculación por triplicado para cada uno de los tratamientos y con duplicado en cada uno de los ensayos de cuantificación de la actividad.

Determinación del contenido de lignina

En los esquejes provenientes del ensayo in vivo se determinó el contenido de lignina aplicando el método del ácido tioglicólico (14), con algunas modificaciones. Los precipitados obtenidos luego de la extracción de la peroxidasa fueron resuspendidos en etanol (1:2) y centrifugados a 5000xg. Los precipitados se secaron a 60 °C durante 24 h. Se pesaron aproximadamente 10 mg de material vegetal seco y se resuspendió en 1mL de HCl 2N y 100 ,µL de ácido tioglicólico. La mezcla fue calentada durante 4 h a 92 °C con agitación constante. Una vez enfriada la mezcla, se centrifugó a 16000xg por 15 minutos. Los precipitados se lavaron con agua desionizada, se les adicionó 1 mL de NaOH 0,5N y se dejaron en agitación durante toda la noche a temperatura ambiente. El residuo insoluble fue removido por centrifugación y el tioglicolato de lignina se precipitó por la adición de 1 mL de HCl concentrado (3 h, 4 °C). Después de centrifugación a 16000xg por 20 min, el residuo fue resuspendido en 1,5 mL de NaOH 0,5N. Se hizo la lectura a 280 nm y el contenido de lignina fue expresado en unidades de absorbancia por mg de material vegetal seco. La determinación en cada uno de los tiempos de muestreo se lleva a cabo realizando triplicado en la extracción y duplicado de cuantificación.

Análisis estadístico

Para este estudio se optó por un diseño experimental completamente aleatorizado, realizando en cada uno de los muestreos triplicado de tratamiento y duplicado de cuantificación. El análisis estadístico se realizó mediante análisis de varianza sencillo ANOVA (p = 0,05) y se asignaron grupos estadísticamente diferentes mediante la prueba de Tuckey.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Establecimiento del sistema de extracción para la enzima POD

La literatura reporta diferentes sistemas de extracción para peroxidasa vegetal que van desde la utilización de soluciones reguladoras de tris-HCl, fosfato o citrato hasta el uso de estas mismas soluciones con aditivos como PVPP, tritón o EDTA. La variedad de soluciones extractantes concuerda con la composición variable de las diferentes partes que constituyen la planta, y es la razón que motiva a encontrar la mejor solución para extraer la enzima de acuerdo con el sistema que se va estudiar (9, 15). En este trabajo se utilizaron 4 soluciones extractantes con las que se evaluó tanto el efecto del pH como del uso de PVPP. De acuerdo con los resultados obtenidos (Figura 1), el mejor nivel de actividad se obtuvo con el sistema E4, constituido por buffer citrato 100 mM pH 5,0 y 3% de PVPP. Teniendo en cuenta que los compuestos fenólicos pueden reaccionar con las enzimas, inactivarlas o disminuir su actividad (15), es necesario el uso de aditivo PVPP, ya que en cualquiera de los sistemas evaluados mejora los niveles de actividad, dada su capacidad para retener dichos compuestos reactivos, potenciales interferentes en la determinación de actividad enzimática debido a su reactividad química y a su abundancia en esta especie vegetal (13).

Establecimiento de las condiciones para la medida de actividad enzimática

Se determinó que existe variación de la actividad específica en los diferentes pH evaluados y que el pH con el que se presentan los mayores niveles de actividad es de 5,5 (Figura 2). Este coincide con el utilizado en la mejor solución extractora, indicando que en dichas condiciones de pH, la enzima, además de presentar una alta solubilidad, tiene un ambiente químico conveniente para que en su sitio activo se transforme el sustrato. A condiciones de pH extremo se observa una disminución en la actividad de la enzima, lo cual demuestra el conocido efecto que puede llegar a tener la concentración de iones hidronios sobre la estructura de las proteínas, alterándolas y, en algunos casos, inactivándolas. Este resultado es similar al encontrado para una peroxidasa aislada de hojas de palma real con un pH 5,2 (16). Los valores de pH reportados para la máxima actividad de POD se encuentran entre 5 y 7 (17-22) aunque se reportan valores de pH más ácidos (23).

Se encontró que entre las temperaturas evaluadas, la de 45 °C presenta la mayor actividad de la enzima POD. (Figura 3). Algunas enzimas incluso peroxidasas aisladas de otras fuentes vegetales (24) a estas condiciones, pueden estar inactivas porque se han desnaturalizado; sin embargo, es conocido que, en general, las POD son bastante estables al calor y no es raro encontrar buena actividad de ellas aun a altas temperaturas (25, 26). Peroxidasa aislada de uvas malvasia presentó un pH y una temperatura óptima de 5,5 y 40 °C, respectivamente, valores similares a los encontrados en tallos de clavel (27).

La Figura 4 se realizó manteniendo constante la concentración de H2O2 aniveles de saturación; la Figura 5, manteniendo constante la concentración de o-dianisidina a niveles de saturación. En las dos gráficas se observa claramente el comportamiento típico de una enzima que sigue la cinética de Michaelis-Menten, resultado que concuerda con el reportado para 6 isoperoxidasas purificadas de raíces de rábano originarias de Corea, las cuales también siguen esta cinética en ensayos realizados usando como sustrato o-dianisidina o guaiacol (22). Los valores de Km aparente obtenidos para cada uno de los sustratos utilizados en el presente ensayo, o-dianisidina y H2O2 a las condiciones descritas, fueron 1,49 mM y 0,56 mM, respectivamente.

Determinación de la actividad POD en el ensayo in vivo

La peroxidasa es una enzima involucrada en diferentes procesos fisiológicos de las plantas, algunos de ellos propios del desarrollo, otros inducidos por estrés biótico o abiótico. Entre los procesos que involucran la enzima están: regulación hormonal, mecanismos de defensa, control de elongación celular, polimerización de extensina, entrecruzamiento de los polisacáridos de la pared celular, biosíntesis de lignina y procesos de suberización (28). Estudios previos realizados por investigadores holandeses concluyen que esta enzima se induce en clavel de manera no diferencial en interacciones compatibles e incompatibles (29). Sin embargo, dichos estudios se llevaron a cabo usando razas del patógeno con alta prevalencia en Holanda y en condiciones de inoculación muy diferentes a las usadas por el patógeno para entrar en la planta en las condiciones de cultivo. Por otro lado, la actividad de esta enzima no se relaciona con otras respuestas bioquímicas asociadas, punto central en la búsqueda de probables mecanismos de regulación de la respuesta de defensa vegetal. El ensayo in vivo del presente estudio, además de realizarse usando condiciones de inoculación semejantes a las usadas por el patógeno en los cultivos de clavel, permite relacionar la actividad de la enzima con un proceso bioquímico reportado como determinante en la respuesta de defensa del clavel. Los resultados obtenidos del ensayo in vivo se muestran en la Figura 6, y en esta se puede observar que a las 8 y 48 h pos-inoculación se presentó una inducción significativa de la enzima POD en la variedad tolerante (Bárbara). En la variedad susceptible (Delphi), hacia el último día de muestreo, se observaron diferencias que, aunque significativas (p = 0,5) con respecto al control, son mucho menores que los valores inducidos presentados por la variedad tolerante. Es interesante observar que, en general, los niveles de actividad de la enzima son mayores en la variedad tolerante a lo largo de todo el ensayo y, en adición a la inducción pronunciada observada a las 48 h pos-inoculación, estos resultados son un indicio de la relación de la actividad POD con la respuesta de defensa de la planta y con la resistencia a la enfermedad. Resultados similares, de inducción temprana (72 h), se encontraron en estudios del modelo Lupine amarillo (Lupinus luteus L.)-Fusarium oxysporum, que indican la posible participación de la enzima POD en mecanismos de de fensa por parte de la planta debido al evidente aumento de la actividad de la enzima junto con niveles altos de sacarosa endógena que limitan la infección y el desarrollo del patógeno (9). Yamunarani y cols., 2004 (30), reportan aumento de actividad peroxidasa en tomate, un día después de inducir resistencia en la planta, con extracto de agallas de Quercus infectoria. En otro modelo planta-patógeno, algunas isoenzimas de POD se indujeron en raíces y hojas de pimienta luego de inoculación con esporas de Paenibacillus illinoisensis (31). Por otro lado, Luhováy cols., 2006 (32), realizaron un análisis de actividades enzimáticas, entre ellas la de peroxidasa, en raíces de 2 genotipos de Pisum sativum con diferente susceptibilidad a Fusarium oxysporum y Fusarium solani, y encontraron un aumento de actividad para esta enzima en raíces infectadas a partir del día 2 y hasta el 28 pos-inoculación. Según dichas consideraciones, los resultados obtenidos en el presente estudio coinciden con los encontrados en otros modelos planta-patógeno y permiten proponer que la enzima POD está relacionada con los mecanismos de defensa del clavel y por ende con resistencia al marchitamiento vascular.

Determinación del contenido de lignina en muestras obtenidas a partir del ensayo in vivo y relación con la actividad peroxidasa

Se ha postulado que la actividad peroxidasa podría ser importante en resistencia a la penetración de patógenos en plantas por estar involucrada en el depósito de extensina en la pared celular, mediar en el entrecruzamiento de ésta en presencia de H2O2 (33) y participar en la polimerización oxidativa de alcohol hidroxicinamílico para formar lignina (34), procesos que conducen a dar rigidez a la pared celular y colocar barreras a la infección del patógeno (35). Teniendo en cuenta la importancia que tienen las peroxidasas en la biosíntesis de lignina, es de esperar que la inducción de POD esté relacionada con un aumento en el contenido de lignina. Esta correlación se observa en el modelo Lupine amarillo (Lupinus luteus L.)-Fusarium oxysporum, en el que la síntesis de lignina aumenta a tiempos tempranos de infección (24 h) (9). Se han reportado isoenzimas específicas de peroxidasas de pared celular que se creen son responsables de la etapa final de la lignificación (36-38) la cual está asociada a mecanismos de defensa.

La Figura 7 presenta los resultados del contenido de lignina obtenido de los tallos de clavel del ensayo in vivo. Se observa que para la variedad tolerante, hay un aumento de lignina a partir de las 48 h posinoculación que se mantiene hasta las 72 h. La inducción de la enzima POD concuerda con el aumento en el contenido de lignina a 48 h, lo cual confirma el papel que esta enzima desempeña en la defensa del clavel al patógeno causal del marchitamiento vascular. Es importante tener en cuenta que no es solamente esta enzima la que está involucrada en la biosíntesis de lignina, ya que enzimas como las polifenoloxidasas cumplen también este papel, que en este modelo planta-patógeno también han sido correlacionadas con defensa a nivel del tallo (4).

Estudios realizados por Dalisay y Kuc (39), reportan aumento de actividad peroxidasa y del proceso de lignificación, lo mismo que la depositación de extensina, procesos que se asocian con resistencia sistémica inducida en la interacción cohombro-Colletotrichum lagenarium. La acumulación de lignina y compuestos fenólicos se ha correlacionado con resistencia a la enfermedad en varias interacciones planta patógeno como son los modelos Arroz-Xanthomonas oryzae y Co-hombro-Trichoderma harzianum (40). Los resultados obtenidos en el presente trabajo permiten proponer que una inducción diferencial de la enzima peroxidasa en la variedad tolerante de clavel con respecto a la susceptible en tiempos tempranos pos-inoculación, está relacionada con la acumulación de lignina durante la activación de los mecanismos de defensa asociados con la resistencia del clavel al patógeno causal del marchitamiento vascular.

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad Nacional de Colombia, dependencia DIB, y a Colciencias, por la financiación.

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