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Introducción
En la industria de alimentos, los empaques juegan un papel importante pues permiten proteger los productos de la degradación por factores externos (temperatura, luz, humedad, etc.), así como de la contaminación por olores, microorganismos, polvo, entre otros. La mayoría de los empaques son de tipo polimérico: cloruro de polivinilo (PVC), acetato de polivinilo (PVA), polietileno (PE), polipropileno (PP) o ácido poliláctico (PLA). Estos polímeros son estructuras inertes que, por su alto peso molecular (> 1000 Da), no pueden ser absorbidos. Adicionalmente, los aditivos para plásticos o colorantes orgánicos de las tintas para etiquetas pueden migrar hacia los alimentos por efecto del almacenamiento y condiciones ambientales, lo que conlleva un riesgo para la salud humana.
En Colombia, la norma NTC 5022 y las regulaciones en alimentos expedidas por el INVIMA obligan a la industria del plástico a cumplir requisitos sanitarios para los materiales que están destinados al contacto con alimentos para asegurar la inocuidad de los mismos 1. Por esta razón, en la actualidad se disponen de varios mecanismos de seguridad alimentaria para empaques plásticos, entre ellos el control del contenido total de sustancia en el polímero, el análisis de material no volátil transferido al alimento (migración global), el análisis de migración de sustancias específicas hacia el alimento (migración especifica) o la predicción de la concentración final de migrantes en el producto de consumo a través de modelos matemáticos 2 , 3.
La migración de sustancias desde el empaque plástico hacia el alimento es uno de los fenómenos de transferencia de masa que puede observarse en este sistema y está regido principalmente por las leyes de la difusión y la convección 4 , 5. Algunos autores han estudiado este fenómeno con el objeto de entender y poder predecir el comportamiento de las sustancias que migran desde el material de empaque. Así, se han desarrollado modelos físicos y matemáticos aplicados a diseño de productos 6, metodologías alternativas para la evaluación de la migración especifica 7 y conocimiento específico sobre la movilidad de algunas sustancias en el material plástico 8 - 10.
El ensayo de migración global consiste en simular las condiciones reales de uso del empaque cuando está en contacto con el alimento. De esta forma, según el tipo de alimento al que está destinado el empaque, se utiliza un tipo específico de simulantes de alimentos grasos; por ejemplo, para alimentos grasos se utiliza aceite vegetal enriquecido en ácido oleico 11 - 13. En el caso de estos alimentos, la migración puede ser crítica porque las sustancias lipofílicas del empaque pueden migrar, causando deterioro en la calidad del producto 14.
Para determinar la cantidad de aceite retenido por el empaque plástico, se cuantifican los respectivos ésteres metílicos (FAMEs) mediante cromatografía de gases (CG) usando triheptadecanoato de glicerilo (GTM, por sus siglas en inglés) como estándar interno 1. Este resultado se puede relacionar gravimétricamente con la masa inicial y final del empaque para establecer la migración global desde el empaque hacia el alimento.
Sin embargo, en este método de cuantificación se ha evidenciado la presencia de interferencias provenientes del empaque que en el análisis cromatográfico elúyen en tiempos de retención semejantes a los obtenidos para los ésteres metílicos de los ácidos grasos (FAMEs) y del patrón interno.
Es así como en la misma norma se ha recomendado el uso de patrones internos alternativos como el éster 3-fenil propanoato de etilo (EFP, por sus siglas en inglés) y la trinonadecanoina 1. El uso de estos patrones alternativos implica ciertas consideraciones económicas y técnicas: por un lado, el uso de la trinonadecanoina triplica el costo del ensayo y, por el otro, el uso de EFP técnicamente no cumple con la principal característica de un patrón interno, esto es, poseer naturaleza química semejante al analito de interés (esteres de ácidos grasos) 15.
Así, durante la revisión de patrones alternativos, se encontró que el ácido tetradecanóico (AM) no ha sido identificado como componente presente en simulantes grasos de aceite de girasol enriquecido en ácido oleico 16, aceite de oliva virgen 17 ni de aceite de oliva refinado 18. Por tanto, en este trabajo se incluye su evaluación como patrón alternativo. De igual modo, se busca evaluar el desempeño analítico de la NTC 5022 en la etapa de cuantificación del ensayo de migración global con simulante graso (aceite vegetal) cuando se cambia el patrón interno GTM por EFP.
Materiales y métodos
Reactivos
Se utilizaron los siguientes reactivos: aceite de girasol enriquecido en ácido oleico marca Gourmet® (adquirido del comercio local), triheptadecanoato de glicerilo (GTM) (Sigma Aldrich, > 99%, USA), 3-fenil propanoato de etilo (EFP) (Sigma Aldrich, > 98%, USA), ácido tetradecanóico (AM) (Merck, > 98%; Alemania), heptano, sulfato de sodio, hidróxido de potasio y metanol (Merck, R.A., Alemania) y trifluoruro de boro en metanol 16% (p/p) (BF3) (Merck, R.A., Alemania).
Cuantificación del aceite retenido por el empaque plástico
Siguiendo la metodología descrita en la NTC 5022-2 para los ensayos de migración global, se realizaron cuatro réplicas con láminas de polietileno de 1 dm2 por el método de inmersión total. Se pesó el empaque vacío y se adicionaron 200 mL de aceite de girasol enriquecido en ácido oleico manteniendo la relación sugerida en la norma (100 mL por cada dm2 de contacto) Se dejó durante diez días a 40 °C ± 1 °C en una estufa marca Binder KB 115-UL (Alemania) con división de escala de 0,1 °C. Una vez cumplido el tiempo de contacto, se descartó el simulante graso y el exceso se limpió con un paño absorbente. Posteriormente, se pesó el empaque con el residuo de aceite.
Extracción Soxhlet
Se realizó la extracción tipo Soxhlet del aceite vegetal retenido por el empaque plástico, usando como solvente de extracción n-heptano. A cada una de las muestras de aceite vegetal se les adicionaron 3,0 mL de una mezcla de patrones internos que contenía 2,0 mg/mL de GTM, AM y AFP de cada estándar disueltos en ciclohexano. Así, la cantidad de cada estándar en el extracto fue de 6,0 mg. Las muestras se dejaron cubiertas por el solvente orgánico y se hicieron 6 ciclos de extracción por hora, durante 7 h de extracción continua. Los extractos obtenidos se llevaron a sequedad en un rotavapor Yamato, modelo RE200 (USA).
Transesterificación de ácidos grasos
Al residuo obtenido de la extracción Soxhlet se agregaron 10,0 mL de n-heptano y 10,0 mL de solución de KOH en metanol (11 g/L), los cuales se sometieron a reflujo durante diez minutos. Luego, se adicionaron 5,0 mL de una solución de trifloruro de boro en metanol (16% (p/p)) y se dejó en reflujo por dos minutos. Una vez el extracto alcanzó la temperatura ambiente, se agregó una solución saturada de sulfato de sodio (Na2SO4). Finalmente, la fase orgánica se separó y se analizó por cromatografía de gases.
Análisis por cromatografía de gases
Se utilizó un cromatógrafo de gases Varian modelo CP-3800, equipado con una columna HP-1MS (100% dimetil polisiloxano), (Agilent, 30 m x 0,25 mm di, df = 0,25 µm). Un µL de cada extracto se inyectó con un automuestreador CP-8400 a 250 °C, en modo Split 1:50. Se empleó helio como gas de arrastre, con un flujo de 1,5 mL/min. El programa de temperatura inició en 180 °C por dos minutos, con una tasa de calentamiento de 10 °C/min hasta 240 °C, donde se mantuvo por un minuto; luego hubo calentamiento hasta 300 °C a una velocidad de 50 °C/min donde permaneció por un minuto. Se empleó un detector de ionización de llama (FID) que se mantuvo a una temperatura de 300 °C. La cantidad de simulante retenido por el empaque plástico es equivalente a la cantidad de FAMEs formados y se determinó a partir de la sumatoria total de las áreas de los picos obtenidos por GC-FID.
Cálculo de migración global
La diferencia entre la masa inicial del empaque vacío y la masa del empaque final, junto con la cantidad de simulante retenido cuantificada por cromatografía de gases, permite conocer la masa transferida por el empaque hacia el simulante de alimento. Aunque el área efectiva de contacto son 2 dm2, la masa obtenida se relaciona con un área de contacto estándar de 1 dm2 y el resultado se expresa en mg/dm2.
Desempeño analítico
Para la evaluación del desempeño analítico de cada uno de los tres patrones internos se obtuvo una curva de calibración independiente para cada uno, con siete niveles de concentración evaluados por triplicado. La evaluación de la linealidad se estableció mediante la determinación de la desviación estándar relativa de la pendiente (% Sb), los y-residuales en los distintos niveles, el error porcentual por nivel de concentración (%ε), el coeficiente de correlación y de determinación (r y r 2) y las pruebas estadísticas de proporcionalidad y varianza relacionadas 19.
Se prepararon tres muestras para cada uno de los tres niveles de concentración de aceite de girasol escogidos (16 mg, 64 mg y 112 mg), con el fin de evaluar la precisión intermedia y exactitud del método, de modo que hubo un total de nueve puntos a evaluar en cada curva de calibración preparada con cada patrón interno.
Las operaciones de extracción y transesterificación descritas, se realizaron en presencia de 3,0 mL de solución de patrón interno GTM, AM y EFP; todos de concentración 2,0 mg/mL. Como parámetros de comparación se evaluó el índice HORRATr y el porcentaje de recuperación (%) para precisión intermedia y exactitud, respectivamente 19. Por otro lado, mediante la aplicación de la prueba estadística de Cochran (G α = 0,05) se evaluó si las recuperaciones a distintos niveles de las curvas de calibración eran distintos y mediante la aplicación de una prueba estadística t (α = 0,05) se comprobó si la recuperación de los métodos era estadísticamente igual al 100% de recuperación.
Análisis estadístico
Los resultados de migración global se evaluaron a través de un análisis de varianza (ANOVA) con un α = 0,05, con el fin de evidenciar diferencia estadística entre los patrones. Posteriormente, se realizó la prueba de comparación múltiple de Dunnett (α = 0,05) usando como patrón de referencia el patrón sugerido originalmente por la norma NTC 5022 (GTM).
Resultados y discusión
Linealidad
El comportamiento lineal de cada patrón se evaluó a partir de tres curvas de calibración independientes, cada una con siete niveles, donde se obtuvo la regresión entre la relación masa de aceite/masa patrón y la relación entre la sumatoria de áreas correspondientes a los FAMEs/área del patrón (Tabla 1).
Los resultados del r correspondientes a GTM y AM concuerdan con estudios similares y cumplen con criterios previamente establecidos para métodos de este tipo, los cuales sugieren que el r no debe ser menor a 0,999 en cromatografía 16 - 18. Además el GTM y AM mostraron un %Sb menor al 5%, tal como lo sugiere el JRC, Joint Research Centre, para métodos de estas características 19. Las curvas que emplearon el EFP como estándar interno no cumplieron este requisito de linealidad.
En la Figura 1 se presenta la comparación de los %ε y se observan diferencias en las curvas construidas con GTM y AM en relación con las de EFP, principalmente porque estas últimas cumplen el requisito sugerido (%ε < 15%) solamente para masas superiores a 80 mg 12. Este comportamiento se explica por las pérdidas de EFP en las etapas de extracción y esterificación, lo cual se refleja especialmente en niveles bajos de concentración.
Precisión
En la Tabla 2 se presenta la repetibilidad que experimenta el sistema cromatográfico al ser utilizado en las condiciones de ensayo con FAMEs provenientes de aceite de girasol enriquecido en ácido oleico.
Tabla 2 Resultados obtenidos en el análisis de repetibilidad del sistema cromatográfico.
Triheptadecanoato de glicerilo (GTM); ácido tetradecanóico (AM); 3-fenil propanoato de etilo (EFP); aSumatoria de las áreas obtenidas para los FAMEs. bDesviación estándar relativa.
Las relaciones de área para FAMEs y los patrones GTM y AM (Área FAMEs/Área patrón) resultaron semejantes entre sí, lo cual obedece a su similitud estructural. Esta similitud les confiere un comportamiento analítico similar, tal como se evidencia en la desviación estándar relativa (%RSD) del conjunto de lecturas analizadas. Este hecho se corrobora por las diferencias significativas determinadas para las mismas relaciones usando como patrón EFP. Este comportamiento también puede deberse a la respuesta proporcional que existe entre la señal del detector FID y el número de carbonos activos que posee una cadena carbonada y a las diferencias que se presentan en la respuesta del detector para cadenas lineales y compuestos aromáticos. Por ello se recomienda el uso de FAMEs de cadenas lineales saturadas 20.
Precisión intermedia
Como se muestra en la Tabla 3, la mayoría de intervalos de confianza en cada nivel incluyen los valores nominales de masa. No obstante, el %RSD encontrado para el EFP es demasiado alto en comparación al criterio de Horwitz estimado para concentraciones cercanas a las analizadas (%RS Desperado < 4,0%) 21. Al usar AM y GTM como patrón interno el comportamiento fue adecuado.
Tabla 3 Parámetros analíticos de precisión intermedia y exactitud obtenidos para cada uno de los patrones internos.
Triheptadecanoato de glicerilo (GTM); ácido tetradecanóico (AM); 3-fenil propanoato de etilo (EFP).
Según la AOAC, en condiciones de repetibilidad los índices HORRATr (RSDcalculado/RSDesperado) se esperan entre 0,3 y 1,3 lo cual confirma el buen desempeño del AM y el GTM, contrario a lo ocurrido con el EFP 22.
Exactitud
Mediante la prueba estadística C de Cochran, se estableció que no hubo diferencia significativa entre las recuperaciones a diferentes niveles de concentración (G critico(α = 0,05;n = 3) = 0,87). Adicionalmente, también se comprobó que el estadístico t no muestra diferencia significativa entre el 100% de recuperación y las recuperaciones medias obtenidas en los tres tipos de cuantificaciones (tcritico(α= 0,05;n=9) = 2,26).
No obstante, según la AOAC y estudios similares, los porcentajes de recuperación aceptables para estos niveles de concentración oscilan entre 97% y 103%, por lo tanto, se considera que el ensayo con EFP no posee buen porcentaje de recuperación 18 , 22. Lo anterior puede verificarse en la Tabla 4.
Límites de detección (LD) y cuantificación (LC)
El LD y el LC en la determinación de FAMEs por cromatografía de gases provenientes de aceite vegetal absorbido por un empaque plástico fueron determinados a partir de cada una de las curvas de calibración. Para calcularlos se involucró tanto la pendiente de la regresión lineal (b) como la desviación estándar en el origen (Sa) 23. Así se estableció que el LD es de 2,80 mg para GTM; 2,05 mg para AM; y 16,7 mg para EFP. Las determinaciones utilizando los tres patrones internos mostraron LC de 9,34 mg para GTM; 6,84 mg para AM; y 55,6 mg para EFP.
Estos resultados permitieron inferir que el uso del ácido tetradecanóico (AM) como patrón interno alternativo al GTM resulta mejor en cuanto a sensibilidad con respecto al uso de 3-fenil propanoato de etilo (EFP).
Lo anterior confirma que el EFP no es una buena alternativa como patrón interno de medición en la determinación del aceite vegetal absorbido por empaques plásticos en contacto con un simulante de alimentos grasos.
Ensayos de migración global en aceite de girasol
Se calculó la migración global en las cuatro réplicas del ensayo usando los resultados de aceite retenido obtenidos con los tres patrones internos 4. Con el objeto de comprobar la hipótesis que el uso de cualquiera de los patrones internos no genera influencia en el resultado de la migración, se realizó un ANOVA sobre los resultados de migración. Se encontró que existe diferencia significativa entre los grupos de ensayos para un α = 0,05, por lo cual se concluye que al menos uno de los grupos es diferente a los otros y genera resultados de migración distintos. Para comprobar qué tratamiento difiere de los otros se aplicó la prueba Dunnett utilizando como tratamiento control el GTM (patrón de referencia de la norma NTC 5022) con un α = 0,05 y se determinó que al usar EFP como patrón interno existe diferencia significativa con el tratamiento control.
En la Figura 2 se muestra la comparación de medias de los resultados de migración global y sus respectivas desviaciones estándar (α = 0,05) con cada patrón interno.
Figura 2 Migración global obtenida en una muestra plástica utilizando como patrón de cuantificación de FAMEs de GTM (Triheptadecanoato de glicerilo); AM (ácido tetradecanóico); EFP (3-fenil propanoato de etilo).
Se observa gráficamente que aunque la desviación de las mediciones con patrón interno AM es levemente mayor a la presenciada con GTM, no hay diferencias significativas. Por el contrario, los resultados obtenidos con EFP difieren en gran medida con los calculados por cualquiera de los otros dos patrones evaluados.
Conclusiones
La cuantificación de FAMEs utilizando como patrón interno el AM tiene parámetros analíticos aceptables que concuerdan con los resultados obtenidos con el patrón interno de referencia y con otros estudios. Adicionalmente, no hay diferencia estadística significativa al usar GTM o AM con respecto a los resultados de migración global en un empaque. Por lo cual es posible usar AM como patrón interno, sin afectar los resultados del ensayo de migración global ni reducir su desempeño analítico, por el contrario, genera una ventaja competitiva debido a que el AM posee un menor costo en el mercado que el GTM (120 USD/g versus 1 USD/g, respectivamente). Por otro lado, el desempeño del EFP no es satisfactorio y su aplicación como patrón interno alternativo, como lo sugiere la norma EN1186, debería evitarse.
