Introducción
El fibrinógeno (Fg) es una glicoproteína plasmática sintetizada por los hepatocitos [1]. En la etapa final de la coagulación de la sangre, la trombina convierte el Fg soluble en monómeros de fibrina que posteriormente polimerizan y forman la fibrina insoluble, por acción del Factor XIII (FXIIIa). La transglutaminasa es activada fisiológicamente por la trombina en presencia de calcio [2,3]. El Fg está formado por tres pares de cadenas polipeptídicas distintas (Aα, Bβ, y ү)2. Una variante de la cadena y normal (үA) o la más abundante del Fg se produce por empalme alternativo del ácido ribonucleico mensajero (ARNm), llamado gamma prima (ү’) [4,5]. Esta variante constituye un sitio de unión a la trombina de alta afinidad [6].
En la variante de Fg үA/ү’ los últimos cuatro aminoácidos del extremo carboxi-terminal, alanina, glicina, aspártico y valina (AGDV), son reemplazados por una secuencia de 20 aminoácidos ү’408-427, VRPEHPAETEYDS LYPEDDL. Los dos residuos de tirosina están sulfatados y hay tres residuos de ácido aspártico y cuatro de ácido glutámico, los cuales le confieren a esta variante un fuerte carácter electronegativo [7,8]. Esta propiedad ha permitido separar por cromatografía de intercambio aniónico estas dos poblaciones del Fg [9]. A pH neutro, el Fg eluye con las dos cadenas yA (үA/үA) (pico 1; homodimérico), mientras que a pH mucho más ácido (tres órdenes de magnitud) eluye con las cadenas үA y ү’ (үA/ү’; heterodimérico). Algunos estudios clínicos han demostrado que los pacientes con una mayor proporción de үA/ү’ tienen un riesgo mayor de padecer enfermedades cardiovasculares [10] como infarto del miocardio [11], enfermedad arterial coronaria [12] y accidentes cerebrovasculares [13].
Se han planteado diferentes hipótesis con el fin de explicar los efectos del Fg үA/ү’ sobre la estructura y función de la fibrina [14]. La explicación a futuro sobre las implicaciones fisiopatológicas de la estructura del coágulo formado con una mayor proporción de fibrina үA/ү’ puede ayudar al diagnóstico temprano y al tratamiento de determinadas enfermedades vasculares. Sin embargo, es difícil predecir la contribución pro o antitrombótica del Fg үA/ү’ [15]. Considerando que los eventos cardiovasculares causan la interrupción del flujo sanguíneo y muerte celular debido a la formación de trombos de naturaleza oclusiva, resulta importante la investigación de las características de los coágulos formados con un elevado contenido de Fg үA/ү’ y el diseño de estrategias para su disolución. Por lo cual, la purificación del Fg үA/ү’ es un paso fundamental para conseguirlo.
Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue purificar la variante de Fg (үA/ү’) a partir de plasma de individuos sanos, precipitando primero el Fg total con β-alanina y luego separando las dos poblaciones de Fg, үA/үA y үA/ү’ por cromatografía liquida de separación rápida de proteínas (FPLC, por sus siglas en inglés), empleando una resina de intercambio iónico.
Materiales y métodos
Materiales
La trombina bovina y la mayor parte de los reactivos utilizados fueron grado analítico de la Compañía Sigma (St Louis, MO, USA). Los reactivos de electroforesis fueron adquiridos a través de Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA, USA).
El anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra la cadena ү’ humana (2.G2.H9) y la IgG de conejo anti-Fg humano marcado con biotina fueron adquiridos a través de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). El Fg үA/ү’ comercial en Enzyme Research Laboratories, USA. Las placas de ELISA de máxima adsorción fueron adquiridas en Thermo Scientific Nunc (Harnover Par - IL, USA).
Toma de la muestra de sangre
Las muestras de sangre se obtuvieron de cinco voluntarios aparentemente sanos, previa lectura y firma del consentimiento informado. Se realizó una punción venosa a nivel del antebrazo, utilizando una aguja mariposa (o scalp) acoplada a una jeringa. Se recogió la sangre anticoagulada con citrato de sodio al 3,8% p/v en una proporción de 9:1 (sangre:anticoagulante), descartando los primeros 3 mL. El plasma se obtuvo por centrifugación a 2000 g durante 20 min y se le adicionaron los siguientes inhibidores de proteasas: 200 U/mL de aprotinina, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 5 mM y benzamidina 5 mM. La muestra se distribuyó en alícuotas y se conservaron a -80 °C hasta su uso.
Grupo de estudio
El grupo estaba conformado por sujetos sanos (una mujer y cuatro hombres), con edades comprendidas entre 18-40 años, índice de masa corporal entre 18,5 y 24,5 kg/m2 y concentración de Fg entre 2-4 mg/mL. Se excluyeron del estudio sujetos con hábitos tabáquicos o alcohólicos, presión arterial sistólica > 120 mm Hg y diastólica > 80 mm Hg, colesterol total > 200 mg/dL, triglicéridos >150 mg/dL, sujetos con diabetes u otras patologías que pudieran alterar la distribución normal de las poblaciones de Fg.
Purificación de Fg total
La purificación de Fg se realizó a partir del plasma de cada individuo a través de la técnica de precipitación con β-alanina [16], con algunas modificaciones. Se pasó el plasma por una columna de lisina-sefarosa para eliminar el plasminógeno, según el método de Deutsch etal. [17]. Al plasma depleta-do de plasminógeno se le eliminaron las proteínas vitamina K dependientes: se agregó MgSO4 a razón de 2,4 mg/mL de plasma y se agitó suavemente en un rotador de 360° durante 15 min a temperatura ambiente (TA). Luego se agregó BaSO4 en una proporción de 90 g/L. Se agitó suavemente en un rotador de 360° durante 1 h a TA y luego se centrifugó a 2000 g durante 15 min a 4 °C. Se volvió a adsorber el sobrenadante con BaSO4. Al sobrenadante obtenido se le agregó lentamente por goteo una solución de β-alanina 6 M y ácido s aminocaproico (EACA) 0,1 M, hasta una concentración final de β-alanina de 2,7 M. Se mezcló suavemente durante 30 min a TA y se centrifugó a 2000 g por 30 min. Se descartó el sobrenadante y el precipitado se resuspendió con tampón Tris-salino (TS) (Tris 50 mM, NaCl 0,15 M) pH 7,4 y EACA 0,1 M. Se repitió el proceso de precipitación dos veces más y el último precipitado se resuspendió con tampón TS. La solución de Fg se dializó a 4 °C contra el tampón TS. La concentración de Fg purificado se determinó por espectrofotometría (Genesys 6, Spectronic Instruments, Rochester, NY, USA) a 280 nm, utilizando 1,51 como coeficiente de extinción molar del Fg [18]. También se determinó la concentración a través del método de Lowry [19], empleando albúmina sérica bovina como proteína estándar. La solución de Fg se distribuyó en alícuotas y se congelaron a -80 °C hasta su uso.
Medición de la funcionalidad (coagulabilidad) de la proteína purificada
La funcionalidad del Fg purificado se determinó para cada muestra por triplicado. La actividad coagulante del Fg purificado se evaluó empleando el siguiente protocolo: en un tubo de borosilicato de 10 x 75 mm, se formó un coágulo de fibrina con 200 μL de solución de Fg purificado y 200 μL de solución trombina bovina-cloruro de calcio (trombina 1,25 U/mL y CaCl2 5 mM, concentración final). Se colocó un aplicador de madera en el tubo que contenía la solución de Fg y se dejó coagular a 37 °C por 30 min. Se recogió el coágulo y se determinó la concentración de proteínas, por el método de Lowry en la solución de Fg purificado y en el sobrenadante obtenido luego de remover el coágulo. El porcentaje de coagulabilidad se calculó mediante la siguiente ecuación (1) [20]:
Donde Pr: Proteina; Fg: Fibrinógeno.
Para la realización de estudios funcionales se recomienda que la coagulabilidad del Fg purificado sea ≥ 90%.
Electroforesis
La integridad de las cadenas polipeptídicas del Fg purificado fue analizada por electroforesis (SDS-PAGE) en condiciones reductoras, empleando la técnica de Laemmli [21]. Las corridas se realizaron a voltaje constante de 100 V durante 1 h; las bandas proteicas se visualizaron con azul de Coomassie R250 al 0,25% y se compararon con un patrón de Fg comercial.
Cuantificación del Fg үA/ү’ por el método de ELISA
El Fg үA/ү’ se cuantificó por ELISA [12], mediante el uso de un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra la cadena ү’ de origen humano (2.G2. H9). Este anticuerpo reconoce exclusivamente el Fg ү’ y no tiene reacción cruzada con el Fg үA. El anticuerpo 2.G2.H9 se diluyó con tampón fosfato salino (PBS) pH 7,4 hasta una concentración 1,5 μg/mL. Se agregaron 50 μL de esta solución a cada pocillo de una placa de ELISA y se dejó incubando toda la noche a 4 °C. Luego se bloquearon los sitios inespecíficos mediante la adición de 250 μL de PBS-albúmina sérica bovina (BSA) al 4% y glucosa al 2%, por 90 min a 37 °C. Se lavó la placa tres veces con PBS, suplementado con Tween 20 al 0,05% y se añadió la solución de Fg purificado por FPLC, dejando reposar durante 30 min. Transcurrido este tiempo, se realizarón tres lavados como se indicó previamente y se adicionaron 50 μL de un segundo anticuerpo, IgG de conejo anti-Fg humano marcado con biotina, durante 1 h a 37 °C. Se colocaron 50 μL de estreptavidina peroxidasa, dejando reposar durante 20 min. La reacción se reveló con 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) como sustrato cromogénico.
Se detuvo la reacción con ácido sulfúrico 0,1 N y se leyó inmediatamente a 450 nm en un lector de ELISA INFINITE 200M (TECAN, Männedorf, Switzerland). La cuantificación de Fg үA/ү’ en los eluatos de la columna se determinó por triplicado a partir de una curva estándar hecha con Fg үA/ү’ comercial, en un rango de 0 μg/mL a 1,5 μg/mL. La tendencia lineal de la curva se ajustó con el método de mínimos cuadrados, empleando el programa de Microsoft Excel versión 2007.
Separación de la variante de Fg үA/ү’ del Fg total
La variante de Fg (үA/ү’) se purificó a partir de un Fg purificado con un 3% de Fg үA/ү’ inicial, empleando FPLC, en un equipo AKTA purifier General Electric Company Healthcare, empleando una columna de intercambio aniónico. Se inyectaron 500 μL de la solución de Fg (4 mg/mL), en buffer Tris y purificado por β-alanina, a una columna de intercambio aniónico de HiPrepTM DEAE FF 16/10 (20 mL) (GE Healthcare). A continuación, se lavó la columna con 2 CV (CV: Volumen de la columna) del tampón de equilibrio A (H3PO4 5 mM, Tris 0,039 M, pH 8,5). Luego se aplicó un gradiente no lineal, el cual se controló con el software UNICORN. El gradiente se formó mezclando el tampón A y el tampón B: H3PO4 500 mM, Tris 0,5 M, pH 4,1. Ambos tampones fueron suplementados con aprotinina 5 KIU/mL, como se describe en la Tabla 1. La cromatografía se llevó a cabo a TA a una velocidad de flujo de 4 mL/min. Las fracciones proteicas eluidas se concentraron con amicon (Millipore), hasta obtener un volumen de 200 μL. La concentración de proteínas se determinó por espectrofotometría a 280 nm, utilizando el coeficiente de extinción del Fg: 1,51 M-1cm-1. Se evaluó por electroforesis SDS-PAGE la integridad de las proteínas separadas por FPLC. La presencia de Fg үA/ү’ se confirmó por Western blotting empleando el anticuerpo monoclonal de ratón 2.G2. H9 dirigido contra la secuencia de aminoácidos 408-427 de la cadena ү’ de origen humano, en un sistema de transferencia (Bio-Rad, USA).
Resultados y discusión
Purificación de Fg
La fracción de Fg total purificada por β-alanina presentó una coagulabilidad de 90,0 ± 0,5% y un rendimiento promedio del 85%. La pureza e integridad del Fg fue evaluada por electroforesis SDS - PAGE en un gel al 8% en condiciones reductoras.
En la Figura 1 se pueden apreciar las tres cadenas del Fg: Aα, Bβ y ү, con peso moleculares aparentes de aproximadamente 67, 57 y 47 kDa, respectivamente. Además, la preparación de Fg no estaba contaminada con plasminógeno.
Cromatografía liquida de separación rápida de proteínas
Las poblaciones de Fg үA/үA y Fg үA/ү’ presentes en el Fg precipitado por β-alanina se separaron por cromatografía, utilizando una columna de intercambio aniónico y un gradiente no lineal-partido, obteniéndose dos picos principales, el 1: үA/үA y el 2: үA/ү’ (ver Figura 2). El pico 1 eluyó con un tiempo de retención promedio de 22,2 ± 0,5 min y el pico 2 eluyó a 32,8 ± 0,8 min. Debido a la baja concentración del pico 2, se realizaron seis corridas con el FPLC, empleando el Fg purificado de un individuo (3% de Fg үA/ү’, cuantificado previamente por ELISA) y luego se concentraron por separado las fracciones correspondientes al pico 1 y 2. La concentración promedio del pool de los dos picos concentrados se determinó por espectrofotometría a 280 nm, pico 1 = 2,20 ± 0,07 g/L y pico 2 = 0,25 ± 0,05 g/L (promedio ± el error estándar). La Figura 3 corresponde al resultado del Western blotting.
Cuantificación de Fg үA/ү’
Se desarrolló la técnica de ELISA tipo sándwich con el anticuerpo monoclonal 2. G2.H9. El Fg үA/ү’ se une específicamente al anticuerpo inmovilizado y es reconocido por un segundo anticuerpo, un anti-Fg humano marcado con biotina, acoplado a una enzima marcada. Se realizó una curva estándar (ver Figura 4) usando diferentes concentraciones de Fg үA/ү’ comercial. La concentración de Fg үA/ү’en el Fg purificado por β-alanina para cada muestra de plasma obtenido de cada individuo se calculó a partir de la curva estándar. La concentración promedio de Fg үA/ү’ ± el error estándar fue de 0,22 ± 0,16 g/L, con un coeficiente de variabilidad del 0,72%. Este resultado concuerda con los reportados en otros estudios [12,22]. Lovely et al. [22] evaluaron la relación de Fg үA/ү’ con enfermedades cardiovasculares, utilizando un inmunoensayo. Determinaron que la concentración de esta variante en plasma de individuos sanos se encuentra en un rango de 0,088 - 0,551 g/L. Por lo tanto, se puede concluir que el ELISA estandarizado en el presente trabajo es de gran utilidad para la determinación de Fg үA/ү’ en plasma y podría facilitar futuros estudios de esta variante, marcador de riesgo para las enfermedades cardiovasculares [23,24].
La cadena ү del Fg presenta dos isoformas como consecuencia del empalme alternativo del ARNm: la isoforma үA, constituida por 411 aminoácidos, la cual representa entre el 90 y 95% del Fg [25] y la үA/ү’, formada por 427 aminoácidos, con una secuencia única después de la posición 407, la cual constituye aproximadamente entre el 10-15% del Fg total en plasma.
Sin embargo, este porcentaje puede variar, particularmente en condiciones patológicas donde el porcentaje de cadena үA/ү’ aumenta, por ejemplo en pacientes con enfermedades arteriales coronarias e infarto del miocardio [22].
Diversos estudios han sugerido que el aumento en la proporción de la variante de Fg үA/ү’ altera la formación y la estructura de la fibrina, por lo que el plasma procedente de pacientes con desórdenes trombóticos forman coágulos más rígidos y menos permeables en comparación con los coágulos formados a partir del plasma de individuos sanos [14,26]. Cheung et al. [27] reportaron que la concentración de Fg ү’ se encuentra aumentada en pacientes con embolia pulmonar en fase aguda (0,79 ± 0,33 g/L) en relación a controles sanos (0,33 ± 0,10 g/L). También hay evidencias de que la concentración de Fg үA/ү’ aumenta en la fase aguda en pacientes que han sufrido un accidente vascular del cerebro (0,42 ± 0,17 g/L) en comparación con los controles (0,34 ± 0,10 g/L) [13].
El Fg үA/ү’ tiene propiedades bioquímicas y biofísicas que son diferentes al Fg үA. Algunos estudios han demostrado que el Fg үA/ү’ se une a la trombina con gran afinidad [2,6,28] uniéndose, a su vez, al exositio II de la misma. Otros estudios han reportado que la cadena үA/ү’ tiene la propiedad de unir FXIII [29-31], aunque otras investigaciones no confirmaron esta interacción [32].
Durante los últimos años, los métodos de separación y purificación de proteínas han avanzado notablemente. Algunos de estos avances están relacionados con la introducción de procedimientos de cromatografía líquida de alto rendimiento. Las ventajas de estos métodos son: excelente poder de resolución, velocidad de separación y alta sensibilidad [33]. Diferentes estudios [33-37], han demostrado que los péptidos y proteínas de mayor peso molecular han sido separados ocasionalmente por medio de cromatografía líquida de alto rendimiento. El fracaso en la obtención de resultados puede estar relacionada con el sistema de disolventes y la columna empleada, razón por la cual se han implementado otros sistemas de cromatografía.
Los estudios sobre la variante de Fg үA/ү’ actualmente son de considerable interés, debido a que su relación estructura-función aún permanece en investigación [30]. Bajo este contexto, para realizar cualquier estudio sobre esta variante es imprescindible su separación y purificación. Los pioneros en la purificación de Fg үA/ү’ fueron Finlayson, Mosesson, Siebenlist et al. [30,38], quienes utilizaron una cromatografía de intercambio iónico con una columna de DEAE - celulosa. Siebenlist utilizó la técnica de Finlayson con algunas modificaciones con el fin de obtener una mejor resolución de la fracción correspondiente al Fg үA/ү’, empleando un gradiente cóncavo, controlado por el sistema de cromatografía de separación rápida de proteínas (FPLC). Con el objetivo de purificar la fracción del fibrinógeno total correspondiente al heterodímero Fg үA/ү’, nosotros describimos un método eficiente, utilizando el sistema de cromatografía FPLC, mediante el cual se controló el programa de gradiente utilizado.
En el presente trabajo se diseñó un gradiente de elución con cuatro segmentos a diferencia de los utilizados por Siebenlist et al. [30] (13 segmentos) y la separación del pico 2 se logró en un menor tiempo (30 min). Cabe destacar que en la obtención de la variante del Fg үA/ү’ por FPLC, la cadena Aα se degrada fácilmente durante el proceso de purificación, por lo que es indispensable añadir aprotinina (inhibidor de serino proteasas como la plasmina) a todas las soluciones a emplear. Gorkun et al. [39] han indicado que cierto grado de degradación de la cadena Aα Aα Aα es común en el Fg obtenido a partir de plasma. Con el fin de obtener resultados óptimos, dos componentes del sistema de separación son de especial importancia: el material de la resina y la clase de columna, ya que solo algunos tipos de material son adecuados para la separación de moléculas de proteínas [36] y el sistema disolvente o tampón que tiene que ser cuidadosamente adaptado a cada separación de una proteína específica [33]. El Fg que contiene la cadena үA/ү’ es un heterodímero, con una estequiometria (AαBPy)-(AαBPү’) y se conoce como Fg үA/ү’ o pico 2 del Fg [8], mientras que la molécula de Fg del pico 1 es homodimérica (Fg үA/үA).
Algunos estudios han indicado que la cadena ү’ [8,40] posee una mayor carga negativa que la cadena үA [5] y contiene dos tirosinas sulfatadas y algunos residuos de ácido aspártico y glutámico. Por consiguiente la cadena үA/ү’ es de mayor longitud y contiene más grupos aniónicos que la cadena үA, pudiéndose separar las dos poblaciones de Fg por cromatografía de intercambio aniónico.
La concentración promedio del pico 2 fue de 0,25 ± 0,05 g/L. Este resultado es similar al reportado por Finlayson et al. [38], quienes obtuvieron concentraciones de proteínas relativamente bajas, al utilizar un procedimiento que requiere de mayor tiempo y cantidad de reactivos, debido a que los picos obtenidos deben ser purificados nuevamente. Sin embargo, se debe tener en cuenta que la concentración de los picos 1 y 2 en cada método de purificación del Fg ү’ puede estar asociado al tamaño y al volumen de muestra inyectado a la columna [41].
Las ventajas del procedimiento de FPLC para la separación de las dos variantes de la cadena y de la Fg son evidentes: cantidades menores de muestra pueden ser fraccionadas cuantitativamente en componentes puros y los tiempos de separación son considerablemente más cortos. La forma de obtención del Fg үA/ү’, además de reducir los tiempos de la purificación, reduce los costos, debido a que la técnica de FPLC es un método de purificación rápido y de alta sensibilidad y precisión en comparación con los métodos clásicos de separación. Esta técnica será de mucha utilidad para futuras investigaciones relacionadas con una obtención rápida de Fg үA/ү’, tema de interés por su implicación como factor de riesgo trombótico [42,43].
Conclusiones
De acuerdo con los resultados obtenidos se puede concluir que la técnica utilizada para la purificación de las variantes del Fg, correspondiente al Fg үA/үA (pico 1) y Fg үA/ү’ (pico 2), resultó ser un método eficiente, para la purificación de la variante de Fg үA/ү’ en el pico 2, debido a las ventajas que ofrece en comparación con los métodos de purificación anteriormente estudiados. Se demostró, adicionalmente, que el pico 1 no estaba contaminado con ү’. La purificación y la cuantificación de Fg үA/ү’ en plasma por medio de las técnicas de FPLC y ELISA es de gran utilidad para futuros estudios de esta variante en plasma.