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Introducción
El sacha inchi (Plukenetia volubilis L.) es una planta amazónica que presenta floración y fructificación continua [1, 2]. El aceite extraído de las semillas de sacha inchi es una fuente importante de ácido α-linolénico (omega-3). Debido a sus propiedades nutricionales y fisicoquímicas, la industria alimentaria y las industrias farmacéutica y de biodiesel presentan, respectivamente, gran interés en este [3-5]. Adicionalmente, el aceite de sacha inchi, el cual ha incursionado en el mercado mundial como aceite virgen, se usa tradicionalmente en la dieta peruana y se utiliza, como ingrediente, para funcionalizar alimentos en humanos (por ejemplo, hamburguesas, snacks y yogures) y para alimentos en animales [5].
Por otra parte, los alimentos son evaluados de acuerdo con dos funciones: su valor de proveer componentes nutritivos estándar y sus propiedades sensoriales. La primera está relacionada con los compuestos químicos presentes en componentes nutritivos y la segunda está asociada a propiedades organolépticas. Estas describen las características físicas de un producto y son percibidas mediante los sentidos (gusto, tacto, olfato y vista) [6]. Como consecuencia de esta situación surgen los alimentos funcionales, los cuales tienen efectos beneficiosos y nutricionales básicos en las funciones del organismo, pues mejoran la salud humana o disminuyen el riesgo de contraer enfermedades. Entre este tipo de alimentos se encuentran los aceites vegetales, como el aceite de sacha inchi [7]. Adicionalmente, si estos alimentos presentan ciertas características sensoriales atractivas para el consumidor, se facilita su incorporación en la dieta.
Una de las propiedades más importantes para definir la calidad de un aceite es su aroma, el cual resulta de su composición volátil. Debido a esto, en el área de la tecnología de alimentos, el estudio y análisis de compuestos orgánicos volátiles (VOCs) han tomado gran relevancia, ya que estos generan la percepción sensorial del consumidor, en la medida en que dan a conocer la composición aromática y determinan la calidad del contenido de odorantes para así producir un aceite más apetecible al consumidor [8].
Ahora bien, a la fecha, solo se ha reportado un estudio sobre el contenido de compuestos volátiles del aceite de sacha inchi [9]. En este único estudio solo se reportan los compuestos volátiles identificados, más no se reporta su actividad sensorial. Por lo tanto, no se tiene información sobre la composición volátil que caracteriza y define las características sensoriales de aroma del aceite. Por lo anterior, el objetivo de este estudio es la optimización de un método de SPME en espacio de cabeza (HS-SPME), seguido del análisis por cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas y detector olfatométrico, el cual permita establecer, por primera vez, el contenido de odorantes activos presentes en el aceite de sacha inchi.
Materiales y métodos
Materia prima
Se trabajó con un aceite comercial de sacha inchi, suministrado por un establecimiento comercial, obtenido por prensado en frío de semillas de sacha inchi provenientes del corregimiento de San Pablo, Santa Rosa de Osos, Antioquia, Colombia.
Reactivos e insumos
La mezcla de alcanos (desde C6 hasta C25) fue suministrada por Supelco (Bellefonte, PA, USA). El agua de calidad analítica se obtuvo de un sistema de purificación Milli-Q de Millipore (Bedford, USA).
Las fibras de SPME empleadas fueron proporcionadas por Supelco (Bellefonte, PA, USA): polidimetilxiloxano PDMS (100 pm), polidimetilsiloxano/divinilbenceno PDMS/DVB (65 pm) y polidimetilsiloxano/carboxen/divinilbenceno DVB/CAR/PDMS (50/30 pm). Se utilizaron columnas DB-WAX de 30 m, 0,25 mm de diámetro interno y 0,25 pm de espesor de película y DB5 de 30 m, 0,25 mm de diámetro interno y 0,25 pm de espesor de película Agilent J&W Scientific (Folsom, CA, USA).
Entrenamiento del panel sensorial
Para la evaluación sensorial del aroma, se entrenó un panel sensorial olfativo conformado por diez personas: cinco mujeres y cinco hombres entre los 18 - 35 años. El entrenamiento consistió en sesiones prácticas y teóricas, las cuales se llevaron a cabo una vez por semana, en sesiones de 2 h durante 5 meses.
Los jueces se entrenaron con muestras de productos de diferentes descriptores sensoriales olfativos: florales, frutales, verdes y grasos. Las muestras se ubicaron en recipientes oscuros marcados con un código de tres dígitos para evitar el sesgo. La metodología utilizada fue la propuesta por Steinhaus y Schieberle [10]. Se introdujo una escala de intensidades de 0 a 3, en la cual, 0 indica que no se detecta olor, 1 que se detecta una nota débil (apenas reconocible), 2 que se detecta una nota claramente identificable y 3 que se detecta una nota intensa. Se realizaron olfatometrías de entrenamiento en la descripción y asignación de la intensidad de cada odorante, previo a analizar la muestra problema [11].
Optimización de la técnica de extracción HS-SPME
Se optimizaron los principales parámetros que afectan el proceso de extracción, estos son: la fase extractora (naturaleza química del recubrimiento de la fibra), la temperatura de extracción y el tiempo de extracción.
Inicialmente, se evaluaron tres fibras con diferentes polaridades: PDMS, PDMS/DVB y DVB/CAR/PDMS. La inyección se realizó en modo manual, empleando un holder de SPME; Supelco (Bellefonte, PA, USA). Todas las fibras se acondicionaron térmicamente según la recomendación del fabricante. Se eligieron las siguientes condiciones de partida: 2,0 g de aceite de sacha inchi, tiempo de extracción de 30 min, temperatura de extracción de 40 °C y tiempo de equilibrio de 5 min. Estas condiciones iniciales se tomaron del trabajo reportado por F. Ramos-Escudero [9], donde se analizó la fracción volátil del aceite de sacha inchi. La eficiencia de la extracción se evaluó en función de la cantidad e intensidad de la señal de los analitos volátiles extraídos y se verificó por análisis olfatométrico GC-O.
Posteriormente, se evaluó la temperatura de extracción. Para ello, se emplearon cuatro temperaturas diferentes: 30, 40, 50 y 60 °C. Finalmente, se estudiaron cuatro tiempos de extracción: 20, 40, 60 y 80 min. En todos los casos, solo se modificó el parámetro en estudio, manteniendo las otras condiciones constantes.
Se utilizó un cromatógrafo de gases VARIAN 3800 acoplado a un sistema de detección de espectrometría de masas Saturn 2000 con analizador de trampa de iones y un inyector split/splittles estándar con un liner para SPME de 0,75 mm de diámetro interno. Se usó el modo de inyección splittless a una temperatura de 250 °C durante 3 min. Se empleó helio como gas portador a una velocidad lineal constante de 1 mL / min y una columna cromatográfica DB-WAX de 30 m de largo, 0,25 mm de diámetro interno y 0,25 pm de espesor de película. La temperatura inicial del horno cromatográfico fue de 40 °C durante 4 min, luego se incrementó a una velocidad de 5 °C/min hasta 220 °C, dando un tiempo de análisis de 45 min. La temperatura de la trampa de iones se mantuvo en 150 °C y la línea de transferencia a 240 °C. El rango de masas seleccionado fue de 40 a 350 Dalton.
Identificación de los odorantes por GC-O
El análisis se realizó en un cromatógrafo de gases HP HEWLETT PACKARD 5890 series II plus con detector de ionización de llama (FID) y con un puerto de olfacción adaptado al cromatógrafo de gases. Se utilizó el modo de inyección splittless a una temperatura de 250 °C durante 3 min. Se empleó el gas portador hidrogeno a una velocidad lineal constante de 1 mL/min.
La identificación de los compuestos odorantes se realizó en dos fases cromatográficas: la primera, DB-WAX, de 30 m de largo, 0,25 mm de diámetro interno y 0,25 pm de espesor de película. La temperatura inicial fue de 40 °C durante 4 min, luego, se incrementó a una velocidad de 5 °C/ min hasta 220 °C. El tiempo total de análisis fue de 45 min. La segunda columna, DB-5, con las mismas dimensiones que la anterior, se mantuvo a una temperatura inicial de 40 °C durante 4 min, luego, se incrementó a una velocidad de 5 °C/min hasta 270 °C. El tiempo de análisis fue de 50 min. En ambos casos la temperatura del detector se mantuvo a 280 °C.
Las muestras de sacha inchi fueron evaluadas por seis jueces entrenados. Cada análisis independiente por GC-O del aceite de sacha inchi fue realizado por tres jueces. Cada juez hizo el análisis en periodos de 15 min y el análisis completo de las muestras en tres sesiones diferentes.
Con los datos proporcionados se calculó la frecuencia modificada (MF), Ec. (1); donde F(%) es la frecuencia de detección de un atributo aromático expresado como un porcentaje e I (%) es la intensidad promedio expresada como un porcentaje de la intensidad máxima, el cual permitió estimar los compuestos odorantes más importantes y con mayor impacto en el aroma presentes en el aceite de sacha inchi.
Identificación de los compuestos
La identificación de los compuestos sensorialmente activos se realizó bajo los siguientes criterios: comparación con un espectro de masas de referencia de la base de datos NIST Mass Spectral Library 2017, comparación con los índices de retención lineales (LRI) reportados en la literatura en fase polar y no polar, comparación de los descriptores de aroma reportados por los jueces en las olfatometrías con los olores de referencia de los compuestos reportados en la literatura y comparación con estándares de los compuestos disponibles. El criterio para aceptar la identificación de un compuesto fue la correcta correspondencia del espectro de masas, los LRI y la descripción olfativa con los datos de referencia reportados para cada compuesto.
Resultados y discusión
Optimización de la técnica HS-SPME
Uno de los parámetros más relevantes a optimizar en la técnica de SPME es el tipo de fase extractora (fibra), debido a que el recubrimiento participa en uno de los equilibrios fundamentales que rigen el proceso de extracción. Se eligió la fase extractora DVB/PDMS/CAR, la cual presentó mayor número de señales y más intensidad de señal respecto a las otras dos fases evaluadas. Los cromatogramas se muestran en la figura 1. Adicionalmente, se verificó por GC-O la cantidad de odorantes identificados, siendo la fase DVB/PDMS/CAR la cual presentó mayor número de odorantes con mayor intensidad sensorial, confirmando así que esta fase extractora es la adecuada para continuar el estudio.
Figura 1 Cromatogramas del análisis de compuestos volátiles presentes en aceite de sacha inchi con diferentes fibras de SPME. 1: PDMS, 2: PDMS/CAR y 3: PDMS/CAR/DVB.
Una vez definida la fase extractora, se estudió el efecto de la temperatura de extracción (30, 40, 50 y 60 °C), observándose que, a mayor temperatura, aumenta la cantidad de compuestos volátiles extraídos (representados por la suma total de las áreas de todos los picos en el cromatograma), notándose que el proceso alcanza el equilibrio de fases a 50 °C. Por ello, se eligió la temperatura de 50 °C como la más adecuada para el método de extracción de compuestos volátiles activos, los resultados se muestran en la figura 2.
Figura 2 Efecto de la temperatura en el proceso de extracción de los compuestos volátiles presentes en el aceite de sacha inchi.
Luego, se optimizó el tiempo de extracción (20, 40, 60 y 80 min). Para esto, se tomaron las áreas de tres compuestos que eluyen al inicio, a la mitad y al final del análisis cromatográfico, hexanal, 1-hexenol y 3,5-octadien-2-ona, respectivamente. Los resultados se muestran en la figura 3, allí se observa que el equilibro se alcanza a partir del minuto 40 en todos los casos. Al evaluar las áreas totales de todos los compuestos volátiles extraídos se encontraron resultados similares, los cuales permitieron definir este tiempo como el más apropiado para realizar la extracción de los compuestos volátiles.
Figura 3 Efecto del tiempo de extracción sobre el proceso de extracción de los compuestos volátiles presentes en el aceite de sacha inchi.
Finalmente, se comparó el olor del aceite de sacha inchi con el olor del extracto retenido en la fibra de SPME, encontrándose que el extracto obtenido presenta el mismo olor que la muestra problema de aceite de sacha inchi estudiada.
Identificación por cromatografía gaseosa-espectrometría de masas-olfatometría (GC-MS-O)
En la tabla 1 se presentan los compuestos volátiles sensorialmente activos presentes en el aceite vegetal de sacha inchi con sus correspondientes porcentajes de MF.
Tabla 1 Compuestos odorantes identificados en el aceite vegetal de sacha inchi mediante HS-SPME.
*Compuestos volátiles identificados positivamente por comparación con estándares reales. En los demás casos se tiene la identificación tentativa de los compuestos. MF = Frecuencia modificada.
Se encontraron compuestos agrupados en aldehídos, hidrocarburos, alcoholes, cetonas, terpenos, furanos y ácidos carboxílicos. En algunos casos, se logró la identificación positiva de los componentes por comparación con estándares auténticos, en otros se reportó la identificación tentativa de los compuestos volátiles. Según la frecuencia modificada, los compuestos volátiles con mayor impacto sensorial son: E-2-octenal, E-2-heptanal, 3,5-octadien-2-ona y el ácido hexanóico. El descriptor de olor "notas verdes" presentó mayor frecuencia de detección aromática.
Dentro de los compuestos identificados se destaca la familia de los aldehidos (6 compuestos identificados). Generalmente, los aldehidos se caracterizan por sus notas tanto agradables como a rancio en los alimentos, con descriptores como verde, césped recién cortado, cítrico o dulce [12]. Los aldehídos encontrados pertenecen al grupo de los alquenales, alcadienales, aldehídos saturados y aldehídos aromáticos, siendo los más importantes a la contribución sensorial los alquenales y los alcadienales. Estos compuestos han sido encontrados en otros aceites vegetales de oliva, lino y comino [6, 12, 13], y su presencia en el aceite se da vía reacciones de lipoxigenación, donde los principales precursores son el ácido linoleico y el ácido a-linoleico [14]. Una situación similar se presenta con los alcoholes en la fracción volátil, su presencia se debe a la actividad de óxido-reducción de los lípidos y la presencia de ácido linoleico y ácido a-linoleico, contribuyendo a la formación de notas verdes y rancias en el aceite [15, 16].
La presencia de hidrocarburos volátiles aromáticos (VAH, por sus siglas en inglés) en la fracción volátil de los aceites vegetales comestibles ha causado cierto nivel de preocupación, debido a la presencia de tolueno, estireno y derivados del benceno en bajas concentraciones [17, 18].
El origen de estos VAH es en gran parte desconocido. Bierdermann et al. realizaron experimentos para evaluar si los VAH surgen de contaminación del aire o de rutas biosintéticas que tienen lugar durante la maduración de los frutos, llegando a la conclusión de que la concentración de VAH encontrada era mayor que la esperada a través del equilibrio con el aire. Esto indica que el origen de los VAH podría surgir de vías tanto endógenas como exógenas [19].
Otros compuestos encontrados como el aristoleno y el limoneno se han reportado previamente en aceites vegetales, presentando notas florales y cítricas [20, 21]. Para el ácido hexanoico, se ha reportado que puede ser el resultado de una descomposición secundaria del hexanal, lo cual está correlacionado con un porcentaje relativamente alto de este aldehído en el aceite [22]. En el caso del 2-pentilfurano, este furano se forma en el aceite a partir del ácido linoleico y se ha reportado su presencia en aceites de soya [23].
Conclusiones
Se establecieron las condiciones óptimas (fase extractora, la temperatura de extracción, el tiempo de extracción) para la extracción por HS-SPME, las cuales permitieron la identificación de los compuestos volátiles sensorialmente activos presentes en el aceite vegetal de sacha inchi de origen colombiano. Seguidamente, se identificaron, por primera vez, un total de 20 compuestos activos de aroma en la muestra de aceite de sacha inchi, los cuales se agrupan en 6 aldehidos, 6 hidrocarburos, 3 alcoholes, 2 terpenos, 1 cetona, 1 furano y 1 ácido carboxílico. Los odorantes con mayor potencia aromática son el E-2-octenal, E-heptanal, (E,E)-3,5-octadien-2-ona, ácido hexanoico y el (E,E)-2,4-heptadienal con MF superiores al 75%. Dichos compuestos tienen descriptores sensoriales a verde, graso y seta que caracterizan el aroma global del aceite de sacha inchi.
