INTRODUCCION

La raza criolla Hartón del Valle se originó de bovinos introducidos por los españoles alrededor de 1539; se explota principalmente en sistemas de doble propósito (leche y carne) y puede generar hasta el 65% de los ingresos por concepto de venta de leche y quesos (^{Casas y Valderrama, 1998}).

El contenido total de proteínas en leche bovina es de alrededor de 35 g L^-1, con el 80% representado por las caseínas αs_1-, αs_2-, β- y κ-CN, 10% por β- lactoglobulina, 2% por α-lactoalbúmina y pequeñas cantidades de enzimas e inmunoglobulinas (^{Muysson y Verrinder, 1989}; ^{Braunschweig et al., 2000}). Las caseínas αs_1- y αs_2- constituyen aproximadamente el 48% de las caseínas totales, las β-caseínas el 35% y κ-caseínas el 13%. Las α y β caseínas contienen varios grupos serina fosfato, la k-caseína presenta muy pocos, razón por la cual tiene baja capacidad para unirse al calcio, lo que la hace insensible a la precipitación inducida de las proteínas lácteas (^{Muysson y Verrinder, 1989}).

Las caseínas se precipitan a un pH bajo (4.5- 5.0), temperatura de 20ºC, seguida de una proteólisis en la porción hidrofílica de la κ-CN ocasionada por 44 quimosina o pepsina, lo cual permite la formación del cuajo, materia prima para la manufacturación del queso (^{Ginger y Grigor, 1999}).

Las caseínas están codificadas por genes autosómicos estrechamente ligados (^{Chessa et al., 2003}), lo que implica que la unidad de transmisión genética sea el haplotipo. Del gen de la κ-CN se han descrito seis variantes alélicas: A, B, C, E, F y G. La κ-CN está conformada por 169 aminoácidos, con regiones variables en los codones 136 y 148 del tercer exón; la variante A contiene treonina en el codón 136 (ACC) y ácido aspártico en el 148 (GAT), la variante B contiene isoleucina (ATC) y alanina (GCT). La leche bovina que contiene κ-CN del tipo B presenta contenido proteico más alto, mayor estabilidad al calor y a la congelación, menor tiempo de coagulación, cuajo más consistente y 5-10% más de rendimiento quesero (^{Barroso et al., 1998}).En la detección de los genotipos AA, AB y BB se han utilizado muestras de leche, en hembras lactantes y en el caso de evaluación de machos se requieren 5 a 6 años para una prueba de progenie. Las técnicas moleculares han permitido identificar genotipos de interés en machos jóvenes.

La sustitución nucleotídica permite usar el exón como marcador de selección (^{Prinzenberg et al., 1996}), con técnicas como PCR-RFLP (reacción en cadena de la polimerasa-polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción) o PCR-SSCP (reacción en cadena de la polimerasa-polimorfismo en la conformación de ADN de cadena única). (^{Barroso et al., 1998}). En la técnica PCR-RFLP se amplifica una región del gen de κ-CN y para la detección de las variantes alélicas se digiere con enzimas de restricción que son de alto costo. El método de detección de mutaciones PCR-SSCP (^{Orita et al., 1989}) es una técnica rápida, sencilla y de bajo costo que se basa en la migración diferencial de cadenas desnaturalizadas de ADN, debido a que las cadenas simples adquieren estructuras secundarias complejas que dependen de la secuencia de nucleótidos (^{Hoelzel, 1998}). Con los métodos PCR-RFLP y PCR-SSCP pueden identificarse variantes alélicas de forma rápida en muestras de semen o sangre, en animales de cualquier sexo y edad, lo que permite a los productores de hatos lecheros aumentar en corto tiempo la frecuencia del alelo B, mediante la utilización de reproductores homocigotos.

En esta investigación se estandarizaron y compararon las técnicas PCR-RFLP y PCR-SSCP para la identificación de los alelos de la κ-CN, en bovinos Hartón del Valle.

MATERIALES Y METODOS

Se utilizó sangre de 2 machos reproductores y 34 hembras de la raza de ganado criollo Hartón del Valle en dos hatos lecheros situados en Roldanillo (04º 24' 53'' latitud norte, 76º 09' 17'' longitud oeste) y dos unidades de producción animal pertenecientes a la Universidad Nacional de Colombia, en Palmira (03º 32' 22'' latitud norte, 76º 18' 13'' longitud oeste) y Candelaria (03º 24' 27'' latitud norte, 76º 21' 04'' longitud oeste) (Valle del Cauca, Colombia). Los individuos se seleccionaron al azar; las muestras de sangre se tomaron en tubos vacutainer® de 5 ml con anticoagulante EDTA, se conservaron refrigeradas y se extrajo el ADN mediante el protocolo de “Salting Out” (^{Miller et al., 1998}); la valoración del ADN se realizó en geles de agarosa al 1.2% por comparación con concentraciones conocidas de ADN del bacteriófago lambda.

Por medio de PCR se amplificó un fragmento de 453 pb, situado en el tercer exón del gen de κ-CN del cromosoma 6 (^{Barroso et al., 1998}). Se utilizaron 120 ng de ADN en una solución buffer de PCR que contenía 20 nmoles de cada primer (sentido, 5´ -TGT GCT GAG TAG GTA TCC TAG TTA TGG-3´; antisentido, 5´-GCG TTG TCT TCT TTG ATG TCT CCT TAG-3´); 2 mM de MgCl2, 200 μM de mezcla de dNTP (MBI fermentas) y 2 U de Taq polimerasa (InvitrogenTM) en un total de 100 μl. Las muestras se sometieron a un ciclo de desnaturalización (5 minutos a 94˚C) y luego a 35 ciclos (1 minuto 94˚C; 1 minuto 65˚C; 2 minutos 72˚C) con una extensión final de 72˚C por cinco minutos.

Para la PCR-RFLP se digirieron 15 μl de producto de PCR con 2U de cada una de enzimas de restricción HinfI, HaeIII y Tail (estereoisómero de MaeII) (Tabla 1). Las muestras se incubaron a 37˚C por 3 horas para las enzimas HinfI y HaeIII y a 65˚C para la enzima TaiI. La visualización de los fragmentos se realizó en geles de poliacrilamida al 12% (relación de acrilamida: N,N´-metilene-bisacrilamida de 29:1) que contenía 0.5XTBE (0.045 M tris-borato, 0.001 M EDTA, pH 8.0). La tinción de los geles se hizo con nitrato de plata (^{Sambrook y Russell, 1991}) Para PCR-SSCP se mezclaron 2 μl de los productos de PCR con 8 μl de buffer desnaturalizante (0.05% Xylene-Cianole, 0.05% azul de Bromofenol, 5.5 mM de EDTA pH 8.0), se desnaturalizaron a 95oC por dos minutos y luego se enfriaron a 4˚C para evitar que el ADN se renaturalice. La electroforesis se realizó en una cámara Biometra (12 x 8 cm), en geles al 12% de poliacrilamida (relación de acrilamida: N,N´-metilenebis- acrilamida de 100:1), TBE 0.5X (0.045 M trisborato, 0.001 M EDTA, pH 8.0) y 5% de glicerol. Las muestras se corrieron durante 8 horas a 200 voltios en TBE 0.5X con temperatura regulada a 15oC. La tinción de los geles se hizo con nitrato de plata.

Se calcularon las frecuencias alélicas para evaluar si la muestra poblacional se encontraba en equilibrio Hardy-Weinberg (^{Klug y Cumming, 1999}), usando la distribución chi-cuadrado.

RESULTADOS Y DISCUSION

PCR-RFLP: La enzima HinfI permitió diferenciar los alelos A y E de B y C (Tabla 1 y Figura 1). Con la enzima HaeIII se descartó la presencia del alelo E y con TaiI se descartó la presencia del alelo C. En el patrón de bandas generado, solo se encontraron alelos A y B y se identificaron 17 individuos homocigotos AA, 15 heterocigotos AB y 4 homocigotos BB.

Tabla 1 Longitud (pb) de los fragmentos obtenidos por digestión de los productos de PCR, con las enzimas de restricción Hinfl, Haelll y Tail. 

Figura 1 Patrón de bandas obtenido por amplificación del fragmento de 453 pb del gen de la k-CN, digerido con las enzimas HinfI, HaeIII y Tail. 

En la digestión con la enzima HinfI se observó una banda inespecífica alrededor de los 250-300 pb (Figura 2), cuando se utilizó 5U de enzima de restricción por 15 μl de producto de PCR, de acuerdo con la metodología descrita por ^{Barroso et al . (1998}); esta banda desapareció al reducir a 2U de enzima.

Figura 2 Digestión del fragmento de 453 pb la k-CN, con 5U de la enzima HinfI, donde se muestra la presencia de una banda inespecífica. 

PCR-SSCP: Se detectaron dos patrones de movilidad que corresponden a los alelos A y B (Figura 3). En los geles PCR-SSCP cada cadena de ADN migra de manera independiente. El alelo A de k-caseína genera dos bandas que se diferencian por su ubicación en el gel, de las dos del alelo B; los genotipos homocigotos, por lo tanto presentan dos bandas y los heterocigotos cuatro bandas. Se detectaron 17 individuos homocigotos AA, 15 heterocigotos AB y 4 homocigotos BB, lo que coincidió perfectamente con la técnica PCR-RFLP.

Figura 3 Patrones de corrida de las variantes alélicas de k-CN obtenidas por PCR-SSCP en ganado Hartón del Valle donde se presentan los genotipos homocigotos AA t BB y el heterocigoto AB.  

Se detectaron claramente las variantes alélicas en fragmentos de 453 pares de bases, cuando la literatura menciona que la PCR-SSCP es más eficiente para fragmentos entre 176 y 354 pb y enfatizan en la importancia de mantener la temperatura entre 4˚C y 10˚C con cámaras de electroforesis con sistema de enfriamiento. La PCR-SSCP se simplificó en aspectos técnicos pues se utilizó una cámara Biometra pequeña con dimensiones 12cm x 8 cm, sin sistema de refrigeración, lo cual permitió reducir los costos asociados al tamaño de los geles de poliacrilamida como el de los reactivos para la elaboración del gel, fijación, tinción y revelado, además de los costos de refrigeración, así como un equipo más económico. La detección de las variantes se logró con electroforesis a 200 v durante cuatro horas, por lo cual se disminuyó el tiempo de 14 horas recomendado por otros autores (^{Barroso et al, 1998}). Para una detección óptima se puede aumentar a ocho horas, pero para efectos diagnósticos solo se requirieron cuatro horas. Aunque algunos autores (^{Fan et al., 1993}; ^{Cai y Touitou, 1993}; Barroso et al., 1998) recomiendan la purificación de los productos de PCR para PCR-SSCP con el fin de evitar exceso de primers o iniciadores que puedan alterar los patrones de bandas, no fue necesario realizarlo, lo que redujo los costos de la técnica.

La detección de los alelos de la k-caseína utilizando PCR-SSCP tiene la ventaja con relación a la técnica PCR-RFLP que se evita la digestión del fragmento amplificado con tres enzimas de restricción HinfI, HaeIII y Tail proceso costoso por el alto precio de las enzimas y porque cada digestión debe hacerse de manera independiente.

Equilibrio Hardy-Weimberg: Las frecuencias alélicas fueron: f(A) = 0.681, f(B) = 0.319. La población muestreada resultó en equilibrio (P ≤ 0.05), aunque el tamaño de muestra es pequeño para hacer inferencias poblacionales. La frecuencia del alelo B (0.319) en Ganado Hartón del Valle fue mayor que en Holstein en EEUU (0.18) (^{Van Eenennaan y Medrano (1991)} y Colombia (0.24) (^{López et al., 1999}). Similar a Bovinos Criollos de Argentina (0.30) (^{Poli et al., 2002}) y menor a los Bovinos Criollos de Uruguay (0.47) ^{Postiglioni et al, (2002)}, Bovinos Criollos de Argentina (^{Liron et al., 2002}) y a Criollo de la Patagonia (0.395) y Bolivia (0.645) (^{Liron et al., 2002}).

Mediante técnicas moleculares es posible identificar animales portadores del genotipo de interés de cualquier sexo y edad, en forma rápida, lo cual representa una ventaja para los propietarios de hatos lecheros. El incremento de la frecuencia alélica de la variante B es una de la vías para mejorar la eficiencia lechera para su transformación en queso. Para una raza que presente una frecuencia alélica de 0.25 para el alelo B de la kappa-caseína, es posible aumentar la frecuencia alélica si solo se utilizaran toros con el genotipo BB; la frecuencia de este alelo ascendería al 60% en la primera generación y se situaría alrededor del 100% en pocas generaciones (^{Prinzenberg et al., 1996}).

Se recomienda la realización del estudio poblacional completo, utilizando la técnica SSCP, ya que se conocen los patrones de bandas que se obtienen para los alelos A y B y utilizar enzimas de restricción únicamente en el caso de que se obtenga un patrón de bandas diferente del reportado, para reducir drásticamente los costos.