¹Docente-Investigador Facultad de Ciencias Básicas e Ingenierías, Universidad de los Llanos. Km 12 Vía Puerto López, Villavicencio, Colombia.
^*Autor para correspondencia: gchavesbe@gmail.com ; †luzyinethortiz@yahoo.es

El análisis molecular del cistrón, que codifica para la proteína de la cubierta del virus del mosaico de la caña de azúcar (SCMV) reportado en la base de datos del banco de genes (GenBank), reveló la presencia de 45 nucleótidos adicionales que codifican para quince aminoácidos, en la región amino de la secuencia de la proteína de la cubierta del aislamiento mexicano identificado con el número de acceso GU474635. El análisis BLAST indicó que esta característica particular también está presente en el aislamiento D00949, reportado en 1991 en Estados Unidos. El análisis filogenético de 185 secuencias de la proteína de la cubierta de SCMV reportadas de Asia, áfrica, Brasil y Argentina, entro otros, sugiere diferentes orígenes filogeográficos de los aislamientos mexicanos. El aislamiento mexicano GU474635 es filogenéticamente más cercano a aislamientos de SCMV de Brasil y de EE.UU., mientras que secuencias de la proteína de la cubierta del virus SCMV reportadas en China y Alemania son filogenéticamente más cercanas al aislamiento mexicano EU091075. Las características particulares que comparten aislamientos virales de tres países del continente americano, a saber, EE.UU., México y Brasil, sugieren un bajo control fitosanitario en el intercambio de material vegetal.

Palabra clave: Filogenia, maíz, proteína de la cubierta, virus del mosaico.

The molecular analysis of the Sugarcane mosaic virus (SCMV) for coat protein cistron reported in the public GenBank database, revealed the presence of 45 additional nucleotides coding for 15 amino acids in the N-terminal region of the coat protein sequence of the mexican isolate GU474635. BLAST analysis indicates this particular feature is also present in the coat protein sequence identified with the accession number D00949 reported in the USA in 1991. Phylogenetic analysis of 185 SCMV coat protein sequences reported from Asia, Africa, Brazil and Argentina among others, suggest a putative different phylogeographical origin of the mexican SCMV isolates. Coat protein sequence from isolate GU474635 is phylogenetically closer to isolates from Brazil and USA, while SCMV coat protein sequences from Germany and Spain are phylogenetically closer to the coat protein from isolate EU091075. Particular features among SCMV isolates from different countries along the American continent, i.e USA, Mexico and Brazil suggest low phytosanitary control in plant material exchange among countries.

Key words: Coat protein, maize, mosaic virus, phylogeny.

El virus del mosaico de la caña de azúcar (SCMV) es un miembro del grupo de los Potyvirus, familia Potyviridae, los cuales pueden infectar diferentes cultivos que incluyen la caña de azúcar, el sorgo y el maíz y causar mosaicos, clorosis y enanismo (Shukla et al., 1989). Tradicionalmente, los aislados de SCMV originados en la caña de azúcar fueron designados como razas de SCMV; y los originados en maíz como razas de MDMV. Sin embargo, tanto las razas de SCMV como de MDMV-B comparten muchas propiedades en común y, por tanto, MDMV-B fue considerado una raza de SCMV (Shukla et al., 1994). Estos potyvirus, que infectan la caña de azúcar, fueron incluidos en un subgrupo de SCMV que consta de cuatro especies distintas pero relacionadas: SCMV, virus del mosaico del sorgo (SrMV), virus del mosaico del enanismo del maíz (MDMV) y virus del mosaico del pasto johnson (JGMV). Entre estos virus, solamente SCMV y SrMV infectan la caña de azúcar en condiciones naturales y son considerados los agentes causales del mosaico de esta planta, reportado en más de setenta países (Jeffery et al., 1998).

Las partículas virales de esta familia son filamentosas y van desde los 650 hasta los 900 nm de longitud y de los 11 a los 13 nm de ancho. Poseen una cadena simple de ARN de cadena positiva de 10 kb aproximadamente. El genoma de SCMV es poliadenilado (Adams et al., 2005) y presenta una proteína VPg unida covalentemente al extremo 5'. El genoma está rodeado por aproximadamente 2.000 unidades de proteína de la cubierta (CP) (Chen et al., 2001). La CP potyviral cumple diferentes funciones que incluyen la transmisión por áfidos, el movimiento célula a célula, el movimiento sistémico, la encapsidación del genoma y la regulación de la amplificación de ARN. La región amino de la CP contiene el motivo DAG, altamente conservado entre los Potyvirus y son transmitidos por áfidos (Dombrovsky et al., 2005). El análisis de la estructura genética y la variación de las poblaciones son áreas cruciales de la biología y en el caso de los virus, altamente relevantes para el desarrollo de estrategias de control de enfermedades o epidemias, así como para propósitos de diagnóstico (Jridi et al., 2006; Martin et al., 2006), por lo que en las últimas dos décadas el interés en la estructura genética de las poblaciones virales ha emergido y evolucionado considerablemente (Fondong y Chen, 2011; Garcia-Arenal et al., 2001; Ge et al., 2007; Glasa et al., 2011; Holmes, 2003; Jridi et al., 2006; Martin et al., 2006; Moreno et al., 2004; Rommelfanger et al., 2012; Yoshida et al., 2012; Zhang et al., 2011). Entender la estabilidad genética viral y la composición nucleotídica de diferentes aislamientos con orígenes distintos son aspectos clave para el desarrollo de estrategias de control viral (Moreno et al., 2004; Tan et al., 2004).

En este estudio se analizaron las secuencias nucleotídicas de 185 CP reportadas alrededor del mundo, con el propósito de establecer las relaciones filogenéticas de las dos únicas secuencias americanas (México) completas de SCMV y reportadas en el GenBank (Aislamientos 1 y 2 en el Cuadro 1). Los análisis moleculares indican diferencias entre los aislamientos americanos en la región amino de la proteína de la cubierta. Esta diferencia resulta en dos poblaciones putativas de SCMV con diferente origen filogenético que infectan el maíz en su centro de origen y diversificación.

Secuencias de la proteína de la cubierta de SCMV y alineamiento

Las secuencias de la CP de SCMV se buscaron en la base pública de secuencias conocida como GenBank. Al momento de realizar el estudio se seleccionaron 206 secuencias, que se indican en el Cuadro 1. Con el propósito de una identificación más detallada, de cada acceso se muestra el país de origen, el año de recolección o de publicación y el hospedante en los casos en que la información se encontraba disponible. El criterio de selección inicial de las secuencias fue la presencia del motivo altamente conservado DAG. Todas las secuencias fueron alineadas a partir de los aminoácidos deducidos empleando ClustalW en el programa MEGA, versión 4.0 (Kumar et al., 2008), usando los parámetros por defecto; el alineamiento de secuencias se ajustó de manera manual en los casos en los que fue necesario. De las 206 secuencias iniciales se descartaron aquellas que estaban incompletas o muy cortas y aquellas secuencias únicas que generaban brechas o gaps que causaban problemas mayores en el alineamiento.

Con los criterios anteriores, se eliminaron del conjunto veintiuna secuencias y queda un total de 185 resaltadas en gris en el Cuadro 1. Con base en el alineamiento de aminoácidos deducidos de las 185 secuencias nucleotídicas seleccionadas, se ajustó de manera manual la longitud de cada secuencia a 747 nucleótidos, que codifican para 249 aminoácidos, contando desde el motivo DAG hasta la secuencia consenso de aminoácidos SRTPARAKEA. Los aminoácidos resaltados con negrilla son altamente conservados en todas las secuencias. Con este procedimiento se pretendió un mejor alineamiento que resulta en árboles filogenéticos más confiables.

Árboles filogenéticos

Los árboles filogenéticos se construyeron empleando el algoritmo de Neighbor-joining (NJ) (Saitou and Nei, 1987) en el programa MEGA. La divergencia de secuencias se estimó por el método de dos parámetros de Kimura (Kimura, 1980) y los árboles filogenéticos se visualizaron usando tree explorer en MEGA 4.0. Para estimar la confianza de los patrones de ramificación de los árboles filogenéticos se empleó un valor de remuestreo con 1.000 replicaciones. Los árboles filogenéticos generados en MEGA se exportaron en formato PDF y se editaron empleando el programa Canvas 10 en plataforma Mac OS X 10.6.8.

Estructura genómica

El alineamiento inicial de los aminoácidos deducidos de las secuencias completas de la proteína de la cubierta de SCMV permitió identificar secuencias reportadas en Brasil, EE.UU y México, con un total de 328 aminoácidos y quince adicionales, en comparación con la mayoría de secuencias CP de SCMV. La secuencia CP del aislamiento identificado con el número de acceso GenBank GU474635, reportado en México, tiene un total de 984 nucleótidos comparado con la secuencia de la misma región genómica del aislamiento EU091075, también mexicano, con 939 nucleótidos que codifican para 313 aminoácidos. El peso molecular estimado de la proteína de la cubierta del aislamiento EU091075 es de 33.82 kDa, mientras que la CP del aislamiento GU474635 tiene un peso molecular estimado de 34.71 kDa. La similitud de secuencias entre la región CP de los dos aislamientos mexicanos es de 88.3%. La razón biológica de la secuencia adicional de aminoácidos encontrados en algunos de los aislamientos de SCMV puede ser variada. La región variable de la CP de Potyvirus es necesaria para la transmisión por áfidos y la infección sistémica y es importante para la adaptación del virus al hospedero. La especificidad en la transmisión del virus por vectores se define por la capacidad de una especie de vectores en transmitir ciertos virus pero no otros (Dombrovsky et al., 2005). En el caso de los Potyvirus, la transmisión depende de la presencia de un componente ayudador que interactúa con la región amino terminal de la CP (Dombrovsky et al., 2005). La especificidad de la interacción entre la CP y HC se caracterizó in vitro con el virus del moteado de las venas del tabaco (TVMV) por medio de ensayos de interacción proteína-proteína. HC interactúa con viriones o monómeros de CP procedentes de TVMV transmitido por áfidos, pero no para TVMV no transmitido por áfidos. En Potyvirus, la interacción HC ocurre con la región amino terminal de la CP, que incluye el motivo DAG (Blanc et al., 1997) y los aminoácidos en la región amino cerca al motivo DAG afectan la transmisión por áfidos. Es decir, el contexto en el cual el motivo DAG se localiza dentro de la región amino terminal juega un papel importante en la determinación de la eficiencia de la transmisión de los Potyvirus por áfidos (López- Moya et al., 1999). Estudios más recientes han sugerido el papel de la región amino de la CP en el reconocimiento de diferentes HC de virus que infectan diversos hospedantes (Dombrovsky et al., 2005). En este contexto es válido pensar que la variación en el número y clase de aminoácidos que se encuentran cerca al motivo DAG en los aislamientos de SCMV, se debe precisamente a la especificidad del virus por vectores de las regiones específicas de donde fueron muestreados a través de la interacción de la CP y HC. De otro lado, se conoce que los determinantes de especificidad del hospedero pueden encontrarse en la región amino de la CP (Salvador et al., 2008), por lo que también es posible sugerir que la variabilidad encontrada en la región amino de los aislamientos mexicanos de SCMV puede deberse a la especificidad del hospedero. Las diferencias en la región amino terminal han sido también determinantes para emplearlas como criterio molecular en la discriminación de géneros y especies dentro de la familia Potyviridae (Adams et al., 2005).

Análisis del alineamiento de secuencias nucleotídicas

Con el fin de determinar las relaciones filogenéticas entre los aislamientos mexicanos de SCMV se realizó la comparación de secuencias de sus CP con las secuencias CP de SCMV reportadas alrededor del mundo y publicadas en el Banco de Genes (GenBank) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/. La búsqueda y comparación se hizo empleando el programa BLAST del Centro Nacional de Información en Biotecnología, el cual se puede acceder en la dirección electrónica http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. El resultado de la comparación y análisis BLAST con la secuencia completa de la CP del aislamiento mexicano GU474635, indica que la secuencia más relacionada es la identificada con el número de acceso D00949 (Frenkel et al., 1991) la cual comparte el 95% de similitud nucleotídica (Evalue 0.0). El análisis indica que la misma secuencia presenta similitudes nucleotídicas del 87% (Î-value 0) con secuencias CP de SCMV reportadas en Brasil e identificadas con los números de acceso DQ315492, DQ315498, DQ315496, DQ315495, DQ315494, DQ315490 y DQ315489, y una similitud del 86% (E-value 0.0) con secuencias de CP de SCMV también reportadas en Brasil, identificadas con los números de acceso DQ315493 y DQ315491.

En Frenkel (1991) reportó por primera vez una "diversidad de secuencia inesperada" en la CP de aislamientos de SCMV y MDMV-B de Iowa, EE.UU., que consistía, en el caso de MDMV-B, en una duplicación de aminoácidos en la región amino. El aislamiento D00949 se obtuvo de campos de maíz dulce en Iowa e inicialmente se designó como Iowa 66-I88 (ATCC-PV53) (Hill et al., 1973). De esta manera, la secuencia CP del aislamiento mexicano de SCMV GU474635 está altamente relacionada con aislamientos de EE.UU. Estos aislamientos, junto con los aislamientos de Brasil, tienen la CP más larga de SCMV que se encuentra en las bases de datos, con 984 nucleótidos, lo que se debe posiblemente a un evento de duplicación de aminoácidos (Frenkel et al., 1991). Debido a que no se cuenta con información de otros cistrones de los aislamientos de EE.UU. y Brasil, no es posible determinar si los aislamientos mexicanos se relacionan con estos en el resto del genoma. La presencia de este fragmento particular de nucleótidos en aislamientos de SCMV reportados en diferentes países a lo largo del continente americano sugiere, primero, posibles eventos de recombinación entre estos aislamientos; segundo, el transporte a larga distancia de material infectado/aislamientos virales; y tercero, la necesidad de cuarentenas más apropiadas en la introducción de germoplasmas que puedan contener nuevas variantes virales. La ecología molecular ha revelado que junto con la recombinación, el sinergismo entre especies virales, nuevos vectores y la adaptación al hospedero, el movimiento a larga distancia es uno de los factores responsables en la emergencia de enfermedades tropicales virales graves (Fargette et al., 2006). La restricción en el movimiento de germoplasma entre países puede no ser tan estricta, lo cual hace necesario incrementar las medidas de seguridad para prevenir la introducción de muevas variantes virales que puedan ocasionar enfermedad.

Relaciones filogenéticas

El árbol filogenético que se generó a partir del alineamiento de 185 secuencias CP de SCMV (Figura 1) reportadas en diferentes continentes, agrupa a los aislamientos de México, Brasil y el aislamiento D00949 de EE.UU en un mismo clado, con un valor aceptable de remuestreo del 69%. Este resultado sugiere que los aislamientos D00949 de EE.UU, GU474635 de México y los reportados en Brasil pueden tener un origen genético común. De otro lado, el aislamiento EU091075, también de origen mexicano, está más relacionado con secuencias provenientes de Alemania y China con similitudes nucleotídicas promedio del 92.5% y del 92.4%, respectivamente, en la totalidad de la secuencia, de acuerdo con los resultados de comparaciones pareadas empleando el algoritmo Martínez-NW (Martínez, 1983)implementado en el programa MegAlign del paquete DNASTAR. Las diferencias en la composición nucleotídica de las secuencias de CP de SCMV mexicanos sugiere la presencia de por lo menos dos grupos genéticos diferentes de SCMV que infectan al maíz.

En el árbol filogenético de la Figura 1 se aprecia cómo SCMV agrupa principalmente, según el hospedante del cual fue obtenido, en este caso maíz o caña. En el árbol se distinguen dos grupos principales: uno conformado por aislamientos de SCMV obtenidos principalmente de caña y reportados en áfrica, China, Argentina e India; y otro que reúne principalmente los aislamientos de SCMV que fueron logrados de maíz, con algunos clados que contienen aislamientos obtenidos a partir de caña de azúcar.

Análisis del alineamiento de aminoácidos

El alineamiento de las CP de secuencias de SCMV mexicanos muestra que las diferencias en los aminoácidos se localizan en la región amino donde se generan dos brechas o gaps en el aislamiento GU474635 (Figura 2A). El alineamiento de las secuencias CP D00949 y la CP del aislamiento GU474635 no genera ningún gap, como se espera dada la igualdad en su longitud y la alta similitud de la secuencia (Figura 2B).

El análisis comparativo de las dos secuencias anteriores reveló que la secuencia de la CP del aislamiento mexicano GU474635 presenta la duplicación de aminoácidos reportada previamente por Frenkel (Frenkel et al., 1991) y que no lo había sido para otras secuencias. Se pueden apreciar algunas diferencias en la región de estudio debidas posiblemente a mutaciones. En la posición 41 existe un cambio de aminoácido A ® T (GCT ®ACT, transición) en la posición 53 se presenta el cambio G ® T (GGC ®AGT/C, transición) y en la posición 56 se presenta el cambio T®A (ACT ®GCT, transición) (Figura 2B). Finalmente, el alineamiento de las CP de SCMV mexicanas y el aislamiento genera dos gaps de quince aminoácidos en total, uno entre los aminoácidos 22-32 y otro entre los aminoácidos 74-77 del aislamiento EU091075 (Figura 2C). Este resultado ratifica la mayor relación entre la CP del aislamiento GU474635 y D00949.

• El presente estudio revela los diferentes orígenes filogenéticos de aislamientos de SCMV de un mismo país y la estrecha relación de uno de ellos con aislamientos de otros países, lo cual indica poca restricción en el movimiento de germoplasma. Surge entonces, la necesidad de incrementar las medidas de seguridad para prevenir la introducción de nuevas variantes virales que puedan aumentar el riesgo de enfermedad entre países.
• La diferencia en la composición nucleotídica en los aislamientos mexicanos de SCMV sugiere la presencia de por lo menos dos cepas del virus que infectan el maíz en ese país.
• Únicamente existe el reporte de dos secuencias parciales de SCMV en Colombia que infectan Elaeis guineensis (hospedante alterno) (números de acceso AY072882 y AY 072881). La escasez de información acerca de este virus que en Colombia afecta principalmente cultivos en la región del Valle del Cauca y de la región Andina, no permite determinar su relación filogenética con otros aislamientos, ni diseñar estrategias de control basadas en aproximaciones biotecnológicas.

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