¹Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (Corpoica). ²Centro de Investigación Nataima. Km 9 Vía Espinal-Ibagué. Tolima, Colombia. *Autor para correspondencia: mlozano@corpoica.org.co

El cultivo de maracuyá (Passiflora edulis), de gran importancia económica para Colombia, actualmente es afectado por la enfermedad del marchitamiento vascular causado por Fusarium sp. lo que hace necesario la búsqueda de alternativas que permitan un control eficiente de esta enfermedad. Aislados de las bacterias Azotobacter spp., Azospirillum spp. y el hongo Trichoderma spp., fueron evaluados como potenciales biocontroladores de Fusarium sp. en pruebas in vitro e in vivo. Las pruebas de “test dual” evidenciaron que un aislado nativo de Trichoderma sp. y un producto comercial (Trichoderma lignorum), provocaron la inhibición del crecimiento micelial de Fusarium sp. entre 94.2% y 93.6%, respectivamente. La evaluación de aislados de Trichoderma sobre plántulas de maracuyá en tres momentos de aplicación indicó que la inoculación previa disminuyó el porcentaje de infección de las plantas entre un 75 y 50%, mientras que con aplicaciones después o simultáneamente con el patógeno, el porcentaje de infección disminuyó en 25%. Estos resultados indican que la aplicación de organismos de biocontrol en semillas pregerminadas mejora la protección de las plantas contra el fitopatógeno estudiado y son un recurso importante en el manejo preventivo de las enfermedades de maracuyá.

Palabras clave: Azospirillum spp., Azotobacter spp., biocontrol, Passiflora edulis, Trichoderma spp.

The passion fruit crop (Passiflora edulis) is very important for the Colombian economy. Nowadays this crop is affected by damping-off disease caused by Fusarium sp. So, it is necessary to look for alternatives which allow us to control the disease efficiently. The bacteria Azotobacter spp., Azoospirillum spp. and the fungi Trichoderma spp., were evaluated as a Fusarium sp. potential biocontrol in In vitro and In vivo test. The research was carried out in laboratory and nursery. The “dual test” showed that an wild isolate of Trichoderma spp. and a commercial product (Trichoderma lignorum), inhibited the mycelial growth of Fusarium sp. between 94.2 and 93.6 % respectively. Trichoderma assessment on passion fruit plantlets at three application times demonstrated that applying Trichoderma before Fusarium sp. appearance, decreased the disease occurrence between 75.0 and 50.0 %, whereas applying Trichoderma after or simultaneously with the pathogen the disease in the plantlets decreased until 25.0 %. This suggest that inoculation of pregerminated seeds with bio-control agents improved the protection of plants against the pathogenic and they are an important tool for management of diseases in plants of maracuyá.

Key words: Azospirillum spp., Azotobacter spp., biocontrol, Passiflora edulis, Trichoderma spp.

La producción de maracuyá (Passiflora edulis Sims) en Colombia ocupa un lugar importante en la explotación frutícola. Entre los departamentos de mayor producción se encuentra Huila con un área sembrada de 1635 ha. No obstante, una problemática fitosanitaria en el cultivo es el marchitamiento vascular conocido como secadera o muerte descendente de la planta ocasionado por Fusarium spp., que se caracteriza por el amarillamiento parcial de las hojas, enanismo de los brotes, disminución del crecimiento de la planta y por tanto pérdida de la producción (Lozano- Tovar et al., 2008).

Las cepas patogénicas de Fusarium muestran un alto nivel de especificidad en sus hospederos y se reconocen alrededor de 120 formas especiales (Armstrong y Armstrong, 1981). El manejo de este patógeno se hace principalmente mediante fungicidas de amplio espectro como bromuro de metilo (Fravel et al., 2003). Sin embargo, estas estrategias de control químico han generado la emergencia de cepas resistentes, además de efectos negativos en la salud pública y el medio ambiente. Esta problemática permite plantear el uso de estrategias de control biológico, importantes para la recuperación del equilibrio de los agroecosistemas y para el aprovechamiento del potencial antagonista natural de ciertos microorganismos como hongos y rizobacterias contra patógenos vulnerables (Avendaño et al., 2006).

Entre los microorganismos más usados en el control biológico se encuentran los géneros Trichoderma, Pseudomonas, Bacillus, Paenibacillus, Azotobacter y Azospirillum (González et al., 2004). Trichoderma es un hongo benéfico de vida libre, encontrado comúnmente en el suelo y asociado a las raíces de las plantas. Es avirulento, capaz de producir antibióticos y enzimas líticas como celulasas, hemicelulasas, xilasas y quitinasas de interés industrial para la protección de cultivos (Harman et al., 2004).

Las especies de Trichoderma pueden ejercer el biocontrol de hongos fitopatógenos indirectamente, compitiendo por el espacio y los nutrientes, modificando las condiciones ambientales, estimulando el crecimiento de las plantas y sus mecanismos de defensa; también pueden realizar el biocontrol directamente, mediante micoparasitismo. Estos mecanismos pueden actuar de forma coordinada y su importancia en los procesos de biocontrol depende de la cepa de Trichoderma, el hongo al que antagoniza, del tipo de cultivo y de condiciones ambientales tales como la disponibilidad de nutrientes, el pH y la temperatura (Benítez et al., 2004; Porras, 2000).

Las bacterias que colonizan la raíz y su zona de influencia son denominadas rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal (PGPR), desempeñan funciones clave para la planta, tales como control biológico de los patógenos mediante efectos antagonistas o inducción de resistencia sistémica, incremento de la biodisponibilidad de los elementos minerales como la solubilización de fosfatos, fijación de nitrógeno o la fitoestimulación, producción de antibióticos, degradación de fitotóxicos y la producción de sideróforos (Mantilla, 2007).

Con base en lo anterior, el objetivo de esta investigación fue evaluar microorganismos rizosféricos como potenciales antagonistas de Fusarium spp., causante de la pudrición radicular de maracuyá en el departamento del Huila, en la cual se incluyeron los géneros de las bacterias Azotobacter, Azospirillum y especies del hongo Trichoderma.

La investigación se realizó en el laboratorio de Microbiología de Suelos de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (Corpoica), sede Nataima, ubicada en Espinal, departamento del Tolima (Colombia).

Material biológico

Se empleó el aislado 054 de Fusarium sp. obtenido de plantas enfermas de maracuyá, seleccionado como altamente patogénico en pruebas previas (Ruiz et al., 2010) y caracterizado molecularmente (Sandoval-Lozano et al., 2010). Para su crecimiento se utilizó medio PDA (papa dextrosa agar) a pH 5.5 - 6,0. Los microorganismos benéficos Azotobacter spp. (aislados 015 y 028) y Azospirillum spp. (aislados 002 y 023) fueron obtenidos de la rizósfera de plantas sanas de maracuyá y seleccionados por su capacidad de producción de ácido indolacético (Muñoz y Lozano- Tovar, 2007). Para el género Trichoderma se utilizaron tres aislados nativos (Tr001, Tr002 y Tr003), obtenidos de suelos de los municipios de Algeciras y Rivera del departamento del Huila (Muñoz y Lozano-Tovar, 2007), dos productos comerciales (T. lignorum y T. harzianum) y un producto preformulado (Trichoderma sp.). Para el crecimiento de los antagonistas se utilizaron medios específicos Ashby para Azotobacter spp., NFB semisólido para Azospirillum spp. (Bashan, 1998) y agar -jugo V-8 para Trichoderma. Las semillas de maracuyá fueron obtenidas comercialmente de la empresa Semillas del Pacífico con registro ICA 00581.

Actividad antagónica in vitro de aislados de Trichoderma spp. frente a un aislado de Fusarium sp.

Esta prueba fue realizada en placas Petri con PDA. Para el efecto, a 1 cm del borde de la placa se colocó un disco de 5 mm de diámetro con crecimiento del fitopatógeno de 8 días de edad y de manera equidistante, en forma opuesta se colocó un disco de Trichoderma spp. de 6 días de edad. Se empleó un diseño completamente al azar con cuatro repeticiones. Se midió el porcentaje de inhibición de crecimiento micelial del Fusarium sp., el cual se determinó mediante la ecuación: %IC = (CC - CF)/CC*100), donde CC = diámetro de la colonia de Fusarium sp. creciendo sin la presencia de antagonistas y CF = diámetro de la colonia del fitopatógeno creciendo en presencia del antagonista (Avendaño et al., 2006). La capacidad antagónica se determinó mediante la escala propuesta por Bell et al. (1982) de 0 a 4, donde: 0 = ausencia de invasión de la superficie del patogeno y 4 = invasión total de la superficie del patógeno y esporulación sobre ella.

Efecto de extractos crudos de antagonistas sobre la germinación de conidios de Fusarium sp.

Los aislados de Trichoderma se cultivaron en 500 ml de caldo V8-pH 6, el cual fue incubado durante 6 días a 140 r.p.m. y 28 °C. Los aislados de Azotobacter spp. y Azospirillum spp. se cultivaron en 250 ml de medio NFB modificado (Haahtela et al., 1981) y fueron incubados durante 48 h a 140 r.p.m. a 28 °C. Las biomasas fúngica y bacteriana se separaron por centrifugación a 3000 r.p.m. por 15 min, el sobrenadante se filtró en papel Waltman® 40 y a través de una membrana de celulosa Millipore® de 0.22 µm. Sobre placas de agar se dispensó 1 ml de los filtrados, posteriormente se sembraron 100 µl de una suspensión de 1 x 10⁵ conidios/ml de Fusarium sp. en puntos determinados previamente.

Para el control se utilizaron 100 µl de agua destilada estéril. Los tratamientos fueron distribuidos bajo un diseño completamente al azar con tres repeticiones. Se evaluó el porcentaje de inhibición de germinación (%IG), el cual se determinó después de 7 h de iniciados los tratamientos, contando 100 esporas (germinadas o no), mediante la ecuación: %IG = ((GC - GF)/GC)*100, donde GC = Germinación esporas del tratamiento control, GF = Germinación esporas del fitopatógeno tratado con el filtrado.

Efecto de Trichoderma spp. sobre el desarrollo de la pudrición radicular en plantas inoculadas con Fusarium sp. en casa de malla

Los aislados nativos (Tr001, Tr002 y Tr003) se cultivaron en placas con PDA e incubados durante 96 h. Las esporas se cosecharon en agua destilada estéril y la concentración se ajustó con cámara de Neubauer a 1 x 10⁶ conidios/ml, los productos comerciales y el preformulado de Trichoderma fueron aplicados de acuerdo con la recomendación técnica del uso del producto.

El aislado de Fusarium sp. se multiplicó en rodajas de papa (Solanum tuberosum) y se incubó durante seis días a 28 °C, la concentración para la inoculación de las plantas fue ajustada a 1 x 10⁶ conidios/ml (Ruiz et al., 2010).

Se utilizaron semillas comerciales de maracuyá (Passiflora edulis) que fueron sembradas en sustrato 1:1:2 (cascarilla de arroz quemada: cascarilla de arroz sin quemar:suelo) esterilizado en autoclave a 15 psi durante una hora por dos días consecutivos. Se evaluaron tres momentos o tiempos de aplicación de los biocontroladores, así: momento 1: patógeno aplicado ocho días después de la inoculación del antagonista; momento 2: inoculación del patógeno y del antagonista al mismo tiempo; y momento 3: aplicación de patógeno ocho días antes del antagonista. Se utilizaron tres controles de la forma siguiente: químico (48% p/v de Mefenoxam, equivalente a 465 g/l de Metalaxil-M; negativo o blanco consistente en plántulas sin inóculos; y positivo o plántulas inoculadas con solo el fitopatógeno. Las observaciones sobre el desarrollo de la enfermedad se hicieron durante cuatro meses, registrando la sintomatología externa de ésta y la mortalidad de las plantas. Se utilizó un diseño completamente aleatorizado con cuatro repeticiones. A todas las plántulas se les realizó un corte superficial con un bisturí en el cuello de la raíz en el momento de la inoculación del patógeno.

Evaluación de la aplicación de microorganismos antagónicos en semillas pregerminadas y sembradas en sustrato inoculado con Fusarium sp.

Las semillas de maracuyá fueron desinfectadas con hipoclorito de sodio al 0.8% por un minuto y lavadas tres veces con agua estéril. Luego fueron colocadas en agua por 24 h para su pregerminación. Los microorganismos antagónicos Azotobacter spp. (015 y 028), Azospirillum spp. (002 y 023), Trichoderma sp. (Tr003) fueron cultivados en medios específicos (Ashby, NFB semisólido y Jugo V8). El inóculo de Fusarium sp. fue obtenido mediante la metodología anteriormente mencionada. Se utilizó una concentración de 1 x 10⁶ conidios/ml para el caso de Trichoderma spp. y Fusarium sp. La concentración de los aislamientos bacterianos se ajustó por colorimetría a 600 x 10⁶ UFC/ ml (Sutton, 2011). Se evaluaron dos momentos de aplicación: momento 1: inoculación previa de los antagonistas a la semilla pregerminada y siembra de éstas 48 h después de la aplicación del patógeno en el sustrato; momento 2: inoculación de los antagonistas a las semillas pregerminadas y siembra ocho días antes de la aplicación del fitopatógeno en el sustrato. Las observaciones del desarrollo de la enfermedad se hicieron durante cuatro meses, registrando la sintomatología externa y la mortalidad de las plantas. El ensayo se realizó con un diseño completamente al azar con cuatro repeticiones. Se establecieron, además, tres controles, como se describió anteriormente.

Análisis de resultados

Los datos fueron procesados mediante análisis de varianza y se establecieron diferencias de medias con la prueba de rango múltiple Tukey al 95% (p < 0.05), utilizando el programa Statistix 8 (2008).

Actividad antagónica de Trichoderma spp. sobre Fusarium sp.

La evaluación de la actividad antagónica mostró diferencias entre los tratamientos (p < 0.001); donde el aislamiento Tr003 y el producto comercial T. lignorum presentaron los mayores porcentajes de inhibición del crecimiento micelial de Fusarium sp. con 94.2 y 93.6%, respectivamente. Según la escala propuesta por Bell et al. (1982), el aislamiento nativo Tr003 fue calificado como clase 4, ya que invadió totalmente la superficie del patógeno y esporuló sobre él (Cuadro 1). Avendaño et al. (2006) en pruebas de antagonismo in vitro con Trichoderma spp. encontraron igualmente inhibiciones del crecimiento de F. oxysporum con invasión total del micelio del patógeno siete días después de la aplicación. Según Tovar (2008) aislamientos de Trichoderma spp. inhibieron el crecimiento de R. solani hasta 63.67% después de 72 h. Según Melo y Faull (2000) T. harzianum y T. koningii inhibieron entre el 79-82% del crecimiento micelial de R. solani, demostrando diferentes mecanismos de acción donde T. harzianum parasita y destruye el micelio de R. solani y T. konningii produce cantidades considerables de antibióticos.

Evaluación del efecto de extractos crudos de antagonistas sobre la germinación de conidios de Fusarium sp.

Se presentaron diferencias estadísticas entre los tratamientos (p < 0.001), existiendo diferencias entre todos los microorganismos frente al control y diferencias entre antagonistas (Figura 1). El producto comercial T. lignorum y el aislamiento nativo de Trichoderma sp. (Tr003) presentaron el mayor porcentaje de inhibición de la germinación de conidios de Fusarium sp., con 44.7 y 40.7%, respectivamente; mientras que la inhibición observada con los extractos de los aislados de Azotobacter y Azospirillum fue inferior a 20% (Figura 1). La inhibición de la germinación puede ocurrir por la variedad de enzimas que produce Trichoderma spp. como glucanasas, quitinasas, exonucleasas, proteasas, además de otros metabolitos altamente tóxicos como ácido harziánico, alamentianas, peptaiboles, antibióticos, 6-pentil-a- pirona, viridina, gliovirina, glisoperinas, ácido hepteldico, entre otros (Benítez et al., 2004). Según Michel et al. (2005) cepas de Trichoderma producen quitinasas y glucanasas e inhiben el potencial reproductivo de conidios de F. oxysporun hasta en 95% e inhiben el crecimiento micelial en 34%.

Efecto de Trichoderma spp. en el desarrollo de la pudrición radicular en plantas de maracuyá inoculadas con Fusarium sp.

En el estudio realizado en casa de mallas, la inoculación previa presentó diferencias (p = 0.0003) entre los tratamientos. Los aislamientos nativos Tr002 y Tr003 de Trichoderma disminuyeron la infección de las plantas entre un 75 y 50%, respectivamente. No obstante, cuando se aplicaron simultáneamente con el patógeno la reducción de la infección solo fue de 25% y cuando se aplicaron ocho días después de la inoculación del patógeno no se observó reducción de la enfermedad. Los productos de Trichoderma sp. (preformulado) y T. lignorum presentaron 100% de infecciones en todos los momentos de aplicación (Cuadro 2), lo que indica que algunas cepas del hongo Trichoderma disminuyen la enfermedad sólo cuando se aplican en forma preventiva. Hernández et al. (1999) encontraron resultados similares a los del presente estudio cuando evaluaron momentos de aplicación de T. harzianum para el control de Dothiorella sp., obteniendo el mejor resultado cuando el antagonista fue aplicado 24 h antes que el patógeno.

Evaluación de la aplicación de microorganismos antagónicos en semillas pregerminadas de maracuyá sembradas en sustratos inoculados con Fusarium sp.

Cuando las semillas pregerminadas de maracuyá fueron tratadas con Azotobacter spp., Azospirillum spp. y Tricoderma spp., ocho días antes de la inoculación con Fusarium sp., se presentaron diferencias entre los tratamientos (p < 0.0001), siendo los tratamientos con Trichoderma iguales estadísticamente al blanco, así como el aislado 015 de Azotobacter y el aislado 002 de Azospirillum. La mayor eficiencia se logró con Trichoderma (Tr003 y T. lignorum), que alcanzaron 100% de protección (Cuadro 3).

Cuando los antagónicos fueron aplicados a las semillas 48 h después de la inoculación del patógeno se presentaron diferencias entre tratamientos (p < 0.0001), así los aislados de Trichoderma fueron diferentes del control positivo e iguales al blanco. Su protección frente a la enfermedad fue de 75 y 87.5 % (Cuadro 3), mientras que los tratamientos con rizobacterias y el control químico fueron similares al control positivo y su protección varió entre 12.5 y 50% (Cuadro 3). González et al. (2004) observaron que la aplicación de T. harzianum en semillas de melón redujo la incidencia de F. oxysporum entre 37.5 y 46.3%. Rincón (1991) demostró el efecto antagónico de Trichoderma sobre R. solani en semilleros de café, y obtuvo una reducción de 55% en la incidencia de la enfermedad cuando inoculó el sustrato con el hongo antagonista. Betancourt (1997) realizó un estudio empleando la cepa de Trichoderma Th003 frente al fitopatógeno F. oxysporum en semillas de tomate en preemergencia y observó que el porcentaje de protección fue del 66.94% vs. el control.

• Las interacciones que tienen lugar en la rizósfera son muy complejas, es necesario profundizar en su conocimiento para poder establecer estrategias que permitan un manejo más eficiente de los sistemas agrícolas.
• Los resultados de este trabajo indican la importancia de la colonización previa de la rizósfera por organismos benéficos como estrategia de manejo integrado de enfermedades radicales en plantas, al evidenciarse el efecto de las diferentes cepas de Trichoderma spp. disminuyendo el porcentaje de infección de las plantas entre un 75 y 50%.

Esta investigación fue posible gracias a los recursos del Proyecto Manejo Preventivo de la Pudrición Radicular de Maracuyá en el Departamento del Huila, ejecutado por Corpoica y cofinanciado por la gobernación del Huila, Codecyt y Colciencias.

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